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布鲁氏菌Omp10-Omp28-L7/L12融合蛋白在乳酸乳球菌中的表达及其免疫效果初步研究

2020-12-08阅读(436)

布鲁氏菌Omp10-Omp28-L7/L12融合蛋白在乳酸乳球菌中的表达及其免疫效果初步研究

论文摘要

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由胞内寄生菌布氏杆菌属侵入机体引起的一种人和动物都能感染的细菌性传染病,简称布病。世界上大部分地区都有布鲁氏菌病的发生,成为严重威胁人类健康和经济发展的问题。近年来,布鲁氏菌病的流行越来越严重,我国也不例外,进行布鲁氏菌病的防控显得尤为重要,免疫接种是预防布鲁氏菌病的一个重要手段,目前常用的疫苗主要是布鲁氏菌弱毒活疫苗,这些疫苗虽具有良好的保护能力,但其也存在不足之处,如具有一定毒性、易感染人,而且干扰血清学检测,导致无法区分自然感染动物与免疫动物等,因此,研究一种更好的布病新型疫苗越来越重要。乳酸乳球菌表达系统是一种安全、高效的表达系统,经常应用于亚单位疫苗的制作,本研究将布鲁氏菌Omp10、Omp28、L7/L12三个优势抗原基因串联后导入乳酸乳球菌表达系统中,构建能够表达布鲁氏菌融合蛋白Omp10-Omp28-L7/L12的乳酸乳球菌免疫制剂。乳酸乳球菌是自然界中常见的益生菌种,是公认的安全级微生物,且乳酸乳球菌可以长时间定植在肠道,刺激机体黏膜免疫反应从而引起全身免疫反应。因此本试验选用乳酸乳球菌表达系统,首先利用PCR技术扩增公司合成的Omp10-Omp28-L7/L12融合基因,然后通过DNA重组技术将Omp10-Omp28-L7/L12融合基因与乳酸乳球菌表达载体pNZ8148连接,最后通过电转化的方式转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中。经乳酸链球菌素nisin诱导后,分别用鼠抗His标签抗体、Omp10多克隆抗体、Omp28多克隆抗体、L7/L12多克隆抗体作为一抗,HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗对表达产物进行Western blot试验,结果显示均出现了大小为55.4kDa的特异性条带,说明布鲁氏菌Omp10-Omp28-L7/L12融合蛋白表达成功。将重组乳酸乳球菌pNZ8148-Omp10-Omp28-L7/L12/NZ9000通过灌胃的方式免疫SPF BALB/c小鼠,第0-4d进行首次免疫,连续免疫4d,并在10-14d进行加强免疫,在首免后第0d、7d、14d、21d、28d、35d每组随机取3只小鼠采集血液和小肠,通过检测布鲁氏菌特异性抗体IgG、肠粘膜sIgA、血清IL-2、IL-4、IFN-γ水平以及外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞数目等指标进行免疫效果分析。结果表明,重组乳酸乳球菌pNZ8148-Omp10-Omp28-L7/L12/NZ9000能诱导机体产生特异性血清IgG抗体和小肠黏膜sIgA抗体,而且能使IL-2、IL-4和IFN-γ细胞因子水平提高,促使CD4+、CD8+T淋巴细胞数目增高。综上所述,重组乳酸乳球菌不仅能够表达布鲁氏菌Omp10-Omp28-L7/L12融合蛋白,而且能够使小鼠产生体液免疫反应和细胞免疫反应。为进一步研制布鲁氏菌病新型疫苗提供了试验依据。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 1.引言
  •   1.1 布鲁氏菌病简介
  •   1.2 布鲁氏菌病病原学
  •   1.3 布鲁氏菌病流行病学
  •   1.4 布鲁氏菌病临床症状
  •   1.5 布鲁氏菌抗原研究进展
  •     1.5.1 外膜蛋白
  •     1.5.2 L7/L12 蛋白
  •   1.6 布鲁氏菌病检测方法概述
  •     1.6.1 病原学检测方法
  •     1.6.2 血清学检测
  •     1.6.3 ELISA试验
  •     1.6.4 荧光偏振试验（FPA）
  •     1.6.5 胶体金免疫层析技术（CICA）
  •     1.6.6 分子生物学技术（PCR）
  •   1.7 布鲁氏菌病疫苗研究现状
  •     1.7.1 羊种布鲁氏菌Rev-1 疫苗
  •     1.7.2 牛种布鲁氏菌S19 疫苗
  •     1.7.3 猪种布鲁氏菌S2 疫苗
  •     1.7.4 羊种布鲁氏菌M5 疫苗
  •     1.7.5 灭活疫苗
  •   1.8 乳酸菌表达系统研究现状
  •     1.8.1 乳酸菌的概述
  •     1.8.2 乳酸菌表达系统
  •     1.8.3 乳酸菌作为活疫苗载体简述
  •   1.9 黏膜免疫研究现状概述
  •   1.10 本研究的目的及意义
  • 2.材料与方法
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 菌种及试验动物
  •     2.1.2 主要试剂与试剂盒
  •     2.1.3 主要仪器
  •     2.1.4 溶液和培养基配制
  •   2.2 布鲁氏菌Omp10-Omp28-L7/L12 融合基因重组乳酸乳球菌株的构建
  •     2.2.1 Omp10-Omp28-L7/L12 基因的PCR扩增
  •     2.2.2 Omp10-Omp28-L7/L12 基因的克隆与鉴定
  •     2.2.3 Omp10-Omp28-L7/L12 融合基因重组乳酸乳球菌株的构建
  •   2.3 Omp10-Omp28-L7/L12 融合蛋白在重组乳酸乳球菌中的诱导表达
  •     2.3.1 Omp10-Omp28-L7/L12 融合蛋白的诱导表达
  •     2.3.2 表达产物Western blot检测
  •   2.4 布鲁氏菌Omp10-Omp28-L7/L12 融合基因重组乳酸乳球菌免疫效果研究
  •     2.4.1 口服免疫小鼠
  •     2.4.2 重组乳酸乳球菌在小鼠体内免疫反应
  •     2.4.3 数据分析
  • 3.结果与分析
  •   3.1 布鲁氏菌Omp10-Omp28-L7/L12 融合基因重组乳酸乳球菌株的构建
  •     3.1.1 PCR扩增布鲁氏菌Omp10-Omp28-L7/L12 基因
  •     3.1.2 重组乳酸乳球菌Omp10-Omp28-L7/L12 基因的克隆与鉴定
  •     3.1.3 布鲁氏菌Omp10-Omp28-L7/L12 融合基因重组乳酸乳球菌菌株的构建
  •   3.2 Omp10-Omp28-L7/L12 融合蛋白在重组乳酸乳球菌中的诱导表达
  •     3.2.1 表达产物Western blot检测结果
  •   3.3 布鲁氏菌Omp10-Omp28-L7/L12 融合基因重组乳酸乳球菌免疫效果研究
  •     3.3.1 特异性抗体血清IgG以及肠道sIgA效价检测结果
  •     3.3.2 血清IL-4、IL-2、IFN-γ浓度检测结果
  •     3.3.3 外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞数量检测结果
  • 4.讨论
  • 5.结论
  • 6.参考文献
  • 7.致谢
  • 8.攻读硕士期间发表论文情况
  • 9.个人简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李欣磊

    导师: 朱瑞良

    关键词: 布鲁氏菌,融合基因,乳酸乳球菌,表达,口服免疫

    来源: 山东农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 山东农业大学

    基金: 国家十三五重点研发计划“牛羊重要疫病诊断与检测新技术研究”(2016YFD0500905),山东省现代农业产业技术体系羊产业创新团队建设项目(SDAIT-10-06),山东省农业重大应用技术创新项目,山东省重点研发计划项目(2016GGH3115)

    分类号: S852.614

    总页数: 56

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