林荣呈, 李良璧, 匡廷云[1]2001年在《水稻紫黄质脱环氧化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达》文中指出依赖于叶黄素循环的热耗散作用被认为是植物在自然条件下免受强光破坏的主要途径。叶黄素循环的色素库由紫黄质(V)、环氧玉米黄质(A)和玉米黄质(Z)叁种色素组成。强光下,紫黄质脱环氧化酶(VDE)催化紫黄质经环氧玉米黄质形成玉米黄质,玉米黄质与质子化的捕光天线共同作用来耗散过多的激发能,从而保护强光对光系统Ⅱ反应中心的破坏。相反,在暗中或弱光下,玉米黄质可在玉米黄质环氧化酶(ZE)的催化下转变为紫黄质。 我们用cDNA末端快速扩增法(RACE)从水稻(Oryza sativa subsp.japonica)中克隆了紫黄质脱环氧化酶基因(Rvde),该cDNA序列全长1887bp,含1341bp的完整开放读码框架,推导编码446个氨基酸。其氨基酸序列与已报道的烟草、莴苣、拟南芥、菠菜和小麦的同源性分别为69％、69％、72％、71％和75％。与其它核编码的叶绿体蛋白质类似,它含有98个氨基酸的转运肽序列。将编码
郑波[2]2011年在《毛竹紫黄质脱环氧化酶基因的克隆与功能研究》文中研究说明适应各种光照环境是植物生存的本能,叶黄素循环在植物适应强光环境、光破坏防御和适应低光环境、提高光能利用效率过程中都发挥着重要作用。叶黄素循环含有叁种组分,即紫黄质、花药黄质和玉米黄质。当植物吸收的光能超过其转化能力时,类囊体腔被过度酸化,低pH能够激活紫黄质脱环氧化酶,催化紫黄质生成玉米黄质的反应。玉米黄质能够将过量光能以热能的形式耗散掉,而且能够清除一些氧自由基,以减轻过量光能对植物产生的伤害。而在低光照下,玉米黄质在玉米黄质环氧化酶的作用下转化为紫黄质,减少光能的热耗散,从而提高植物的光能利用率。毛竹(Phyllostachys edulis)是分布于我国亚热带地区的散生竹种,具有较高的经济价值。本论文以毛竹实生苗为材料,在研究叶片叶绿素荧光动力学参数的基础上,开展了毛竹叶黄素循环关键酶-紫黄质脱环氧化酶的研究,以期为认识竹子叶黄素循环在不同光照环境中的作用提供分子生物学基础,主要研究结果如下:第一,毛竹叶片叶绿素荧光动力学研究。利用叶绿素荧光技术,研究了毛竹实生苗叶片叶绿素荧光参数非光化学猝灭(NPQ)和电子传递速率(ETR)的变化规律。结果表明,充分暗适应后,随着光合有效辐射(PAR)逐渐增强,NPQ也随之增加,而ETR则呈现先上升,后下降的趋势。其表明NPQ在过量光能热耗散过程中发挥重要作用。第二,基因克隆。将不同物种的紫黄质脱环氧化酶(VDE)同源蛋白序列进行比对,设计简并引物,扩增得到毛竹VDE基因的部分cDNA序列,再通过RACE方法,获得5′和3′端序列,经拼接获得了基因全长cDNA(1723 bp),编码区为1356 bp,共编码451个氨基酸(其中N端的103个氨基酸为转运肽),该基因命名为PeVDE。根据PeVDE的编码区序列设计引物,以基因组DNA为模板进行扩增,经测序结果表明毛竹PeVDE基因编码区基因组序列含有4个内含子和5个外显子。第叁,基因的原核表达。将编码PeVDE成熟蛋白的基因序列克隆入原核表达载体pET-32b中,得到含有目的基因的重组表达载体。将该表达载体转入大肠杆菌表达菌株(Rosetta-gamin B (DE3))感受态细胞,进行原核诱导表达。通过优化诱导条件,在30℃条件下,0.4 mmol·L-1 IPTG诱导4 h,获得了表达丰度较高的可溶蛋白。第四,酶活性测定。通过超声破碎细菌,提取PeVDE重组总蛋白,以紫黄质为反应底物,在25℃、pH 5.1条件下暗处反应15 min,应用HPLC法检测反应产物。结果显示,反应产物中除了有紫黄质外,还有花药黄质和玉米黄质组分,由此证明重组蛋白具有生物学活性,能够将紫黄质依次转化为花药黄质和玉米黄质。第五,Western blotting分析。用原核表达所得的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。分别提取毛竹实生苗的根、茎、叶鞘和叶片组织的总蛋白,并通过SDS-PAGE进行分离,以PeVDE的多克隆抗体为探针进行检测。Western Blotting结果表明,在茎、叶鞘和叶片中都能检测到PeVDE,其中以叶片中含量最高,其分子量约为50 kDa,而在根中没有检测到。
李滨[3]2003年在《小麦紫黄质脱环氧化酶基因的克隆及其表达研究》文中研究说明植物光合机构中叶绿体色素吸收的光能通过光化学过程转化为稳定的化学能。然而，大多数情况下植物接受的能量要超过其所能转化的能量，如果过量的光能不及时耗散掉，光合功能会降低，导致光合作用的光抑制，甚至出现光氧化、光破坏。依赖于叶黄素循环(Xanthophyll cycle)的热耗散作用近年来受到普遍的关注。它在耗散过剩激发能、保护光合机构中起着主要的作用，被认为是光保护的主要途径。叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时，双环氧的紫黄质(V)在紫黄质脱环氧化酶(VDE)的催化下，经过中间物单环氧的花药黄质(A)转化为无环氧的玉米黄质(Z)；在暗处，则在玉米黄质环氧化酶(ZE)的作用下朝相反的方向进行，将Z重新环氧化为V，形成一个循环。关于叶黄素循环在防御光抑制和光破坏中的作用已成为光合作用研究的一个热点领域。本研究欲根据已知植物的紫黄质脱环氧化酶基因序列从小麦叶片中克隆该基因，并利用根癌农杆菌介导法将其反义基因导入烟草中，研究其在烟草植株内的功能表达，为VDE基因工程提供基因资源和理论依据。RT－PCR法得到小麦紫黄质脱环氧化酶(WVDE)的全系列，cDNA的全长为1,746。其ORF长度为1365bp，编码454个氨基酸，分子量为39.8KD，其中转运肽长度为106个氨基酸，成熟蛋白348氨基酸。GenBank注册号为AF265294。WVDE cDNA的编码区序列与水稻、拟南芥、烟草、莴苣、菠菜和茶树的同源性分别为78.7%、62.6%、58.3%、60.8%、60.6%和61.2%；小麦叶片在晴天情况下的PSII最大光化学效率（Fv/Fm）在上午随光强的增加而呈迅速下降，中午12:00达到最低点，表明发生光抑制。与此同时，非光化学猝灭（NPQ）迅速上升，在中午12:00达到最高值，光化学效率变化趋势相反。强光和弱光下叶黄素循环脱环氧化状态存在明显的差异。RT-PCT southern检测结果表明，小麦叶片中的WVDE的表达与反映过剩光能热耗散的NPQ值有很好的线性关系。选用pBI121载体系统，将WVDE的5'端反向插入到载体中。利用根癌农杆菌介导法转化烟草。经过近60天左右的培养，共获得烟草再生植株80余株。Southern杂交和RT-PCR检测结果，可以断定目的基因已经整合到转基因烟草的基因组中。<WP=9>转基因烟草与对照植株在强光处理的初期和早上照光时间较短、光强较弱时的Fv/Fm和NPQ无较大的差别，但随着照光时间的延长和光强的增加两者的Fv/Fm值的下降和NPQ值的升高开始呈现较大的差异。盐胁迫中转基因烟草与对照的Fv/Fm和NPQ的变化也有相似的结果，胁迫初期两者的Fv/Fm的下降几乎相同，但随着处理时间的增加，转基因株迅速降低，而对照则保持缓慢下降的趋势。4℃低温处理中转基因烟草与对照的Fv/Fm在开始的前3h中下降幅度基本一致，而3h之后转基因株表现出Fv/Fm的急剧降低，但置于弱光下48h后转基因植株的Fv/Fm可以恢复到与对照相同的初始值。研究表明转反义WVDE基因植株抑制了烟草VDE的活性，导致热耗散能力下降。逆境条件下，植物的碳同化过程受到抑制，导致光能更加过剩，在此情况下抑制VDE，光抑制加重。说明WVDE在过剩光能耗散中起重要作用。
李欣[4]2014年在《黄瓜紫黄质脱环氧化酶（CsVDE）基因及其启动子克隆和功能分析》文中研究指明叶黄素循环在植物防御强光破坏中起到重要保护作用,紫黄质脱环氧化酶(VDE)是叶黄素循环中的关键酶,能够催化紫黄质(V)转化成环氧玉米黄质(A)和玉米黄质(Z)。为了深入研究VDE作用机理,本研究克隆了黄瓜紫黄质脱环氧化酶基因(CsVDE)全长1470bp及其上游启动子片段1983bp。对CsVDE基因进行时空表达,亚细胞定位,环境胁迫诱导等功能研究；同时对CsVDE基因启动子进行组织化学定位,5’缺失和光诱导分析,获得以下结果：通过RT-PCR方法克隆得到CsVDE基因,进行序列同源性及进化树分析,结果表明CsVDE核酸序列具有其他物种中VDE基因共有的特征,并且CsVDE基因与拟南芥中VDE基因同源性最高。通过时空表达分析及western蛋白检测显示,CsVDE基因主要在叶片中表达,转录水平上成熟叶和老叶表达量最高,但是蛋白水平上幼叶中表达最多。GFP和胶体金亚细胞定位分析显示CsVDI在子叶、成熟叶和老叶中主要定位在叶绿体上。CsVDE基因受到干旱和冷胁迫诱导转录水平上升,在正常光下转录水平呈先上升后下降,再上升的变化,弱光下向后推迟两小时呈现同样变化趋势,强光下CsVDE基因在1小时内表达量快速上升随后逐渐下降。强光和正常光条件下,黄瓜叶片中脱环氧化比率(A+Z)/(V+A+Z)都在0.5小时内快速上升,并且强光条件下该值始终大于正常光。胶体金免疫CsVDE蛋白分析显示黄瓜叶片经强光照射后金颗粒增多。与野生型相比,转反义CsVDE基因拟南芥强光下非光化学猝灭(NPQ)被抑制,最大光化学效率(Fv/Fm)降低,脱环氧化比率(A+Z)/(V+A+Z)也明显降低。表明转基因拟南芥中叶黄素循环功能被部分抑制,并且强光下对光合系统Ⅱ(PSⅡ)的光抑制敏感性增加。对CsVDE基因启动子进行序列分析显示其中包含大量光响应元件及其它环境响应元件。组织化学分析显示,CsVDE基因启动子主要在转基因拟南芥绿色组织器官中表达,包括子叶、真叶、茎、萼片和果皮。通过一系列CsVDE基因启动子5’缺失片段分析显示删除pCsVDE-3(-1111)到pCsVDE-4(-741)之间的启动子区域,GUS活性降低了50%,删除pCsVDE-4(-741)到pCsVDE-5(-498)之间的区域,GUS活性恢复到最高水平。删除pCsVDE-5(-498)到pCsVDE-8(-194)的启动子区域显示GUS活性逐渐下降。通过进一步细致5’缺失分析显示在删除pCsVDE-B(-789)至pCsVDE-4(-741)之间的48bp后引起GUS活性明显降低。CsVDE基因启动子驱动的GUS活性表达可被ABA, SA、PEG、甘露醇和NaCl抑制；被GA、IAA诱导略微上升。强光处理4h时,CsVDE启动子活性被诱导明显上升,相应的强光诱导正调控区域和负调控区域分别在pCsVDE-D(-533)到pCsVDE-5(-498)和pCsVDE-B (-789)到pCsVDE-4(-741)之间。CsVDE启动子对初始24小时正常光照的响应区域主要在pCsVDE-5(-498)到pCsVDE-6(-476)之间的启动子区域。
韩菡[5]2009年在《低温胁迫下番茄紫黄质脱环氧化酶基因的表达和功能研究》文中研究说明光作为植物光合作用的唯一能源是植物生命活动的基础。然而,当植物吸收的光能超过其电子传递所需时,过剩的光能便会造成光合效率和光合功能的降低,引起光抑制,严重时还会发生光氧化破坏。植物除了在强光下会产生光抑制外,在低温弱光、高温、干旱、盐碱等逆境下由于CO2的固定受到限制,使得植物对光能的利用减少而导致光抑制。高等植物体内存在着多种防御机制以避免或减少光抑制,其中叶黄素循环被认为是逆境下保护植物光合机构免受过剩光能破坏的一种重要的机制。叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时,双环氧的紫黄质(V)在紫黄质脱环氧化酶(VDE)的催化下,经过中间物单环氧的花药黄质(A)转化为无环氧的玉米黄质(Z);在暗处,则在玉米黄质环氧化酶(ZE)的作用下朝相反的方向进行,将Z重新环氧化为V,形成一个循环。依赖于叶黄素循环的非光化学猝灭(NPQ)能够保护植物光合机构免受过剩激发能的破坏。有过剩光能存在时,由紫黄质(V)脱环氧化而积累的玉米黄质(Z)也被人们普遍认为对光合机构起到至关重要的保护作用。本研究从番茄叶片中分离到番茄紫黄质脱环氧化酶基因,并对该基因的表达和功能进行了分析。结果表明,该基因的表达并受光强、温度和昼夜节律的影响。过量表达该基因可减轻番茄植株对光抑制的敏感性,而抑制该基因表达可加重番茄植株在低温弱光胁迫下的光抑制程度。主要结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到紫黄质脱环氧化酶基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。命名为LeVDE(FJ648424)。该基因全长为1670bp,ORF为1437bp,编码478个氨基酸,分子量约为53 kDa。同源序列比较发现,番茄紫黄质脱环化酶基因的序列与拟南芥、烟草、菠菜、莴苣、水稻的紫黄质脱环化酶基因的序列同源性较高。结构同源性分析表明LeVDE有叁个特征结构域,block I为-端半胱氨酸富集区,有活性的VDE中N-端含有11-13个半胱氨酸,是VDE的抑制剂DTT作用的区域,低浓度DTT只能部分抑制VDE的活性,说明N-端的半胱氨酸形成不止一个二硫键。block II为脂质运载蛋白特征区,结合和转运疏水小分子的区域,为疏水底物A和Z的结合区。block III是C-端谷氨酸富集区,含有大量的负电荷,是VDE与类囊体膜结合的部位。2. Northern杂交结果表明,LeVDE基因呈非特异性表达,在叶绿素含量高的组织中表达量较高。同时,该基因在弱光和强光处理的24小时昼夜周期中都存在着相似的双峰表达模式,并部分受低温的抑制。Southern杂交结果表明,LeVDE基因在番茄基因组中是单拷贝的。3.将获得的LeVDE基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,用PCR及Northern杂交的方法对带卡那抗性的转基因番茄植株进一步检测,结果证明成功地获得了转正义和反义基因的番茄植株。与野生型植株相比,过量表达LeVDE基因的番茄叶片中A和Z的含量增加,而V的含量减少,脱环氧化状态较野生型高。LeVDE基因表达受到抑制的番茄植株中V量积累,而A和Z含量非常低,脱环氧化状态保持较低的水平4.构建了原核表达载体pET-LeVDE,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,将强诱导带切下,溶于PBS获得抗原,免疫小白鼠,其抗血清效价为1: 500。Western杂交表明,转正义植株中LeVDE基因已在蛋白水平过量表达。另外,分别对低温弱光和强光处理的野生型番茄进行了Western杂交分析。结果表明,LeVDE在蛋白水平的表达始终处在稳定的水平,基本不受光强和温度的影响。5.在低温弱光(4℃,100μmol m~(-2) s~(-1))和强光(1200μmol m~(-2) s~(-1))胁迫条件下,野生型和转正义基因株系T1-7和T1-10株系的NPQ及叶黄素循环脱环氧化状态(A+Z)/(V+A+Z)都增加,但野生型的增加更为明显。在低温弱光及强光胁迫条件下,依赖叶黄素循环的NPQ能够耗散过剩激发能,而转基因株系比野生型耗散能力加强。强光处理过程中,野生型比转正义基因株系的Fv/Fm降低更明显,且转基因株系的Fv/Fm恢复较快,野生型的Fv/Fm恢复较慢。与在强光下类似,T1-7和T1-10株系的Fv/Fm在低温胁迫过程中降低的程度比野生型小,而恢复较慢。这表明LeVDE的过量表达减轻了PSII的光抑制程度,与转基因番茄相比,野生型的PSII反应中心受伤害较严重。强光胁迫12 h,野生型和转基因番茄的净光合速率降低非常显着,但野生型下降程度明显大于转基因株系。这表明由于LeVDE的过量表达增强了低温弱光和强光胁迫下PSII反应中心的稳定性,使光合机构所受到的伤害减轻。在低温弱光处理过程中转正义基因植株与野生型的氧化态P700都降低,且野生型降低幅度大于转正义基因植株。经过12 h的处理,T1-7,T1-10和野生型的O_2~(-|-)含量分别增加了52.3 %,59.8%和81.1 %, H2O2含量分别增加了40.1%,42.3 %和61.3 %。野生型中O2和H2O2含量增加的程度明显高于转基因株系。另外,在低温处理过程中,转正义基因植株和野生型的MDA含量都增加,但转正义基因植株的MDA含量增加的较少。6.抑制LeVDE的表达使得过剩光能胁迫下的NPQ减少。在转反义基因植株中V大量积累而Z和A的含量非常低。在强光和低温弱光胁迫后,转反义基因植株脱环氧化状态始终保持较低的水平。在强光和低温胁迫过程中野生型和转反义基因植株的NPQ都上升,且胁迫12 h后转反义基因植株的NPQ低于野生型。这表明抑制Z的生成使得依赖于叶黄素循环的能量耗散减弱。7.在强光胁迫下野生型和转反义基因植株的Fv/Fm都降低,但是转反义基因植株降低幅度大于野生型。低温弱光胁迫下野生型与转反义基因植株的Fv/Fm均下降,转反义基因植株下降更为明显,低温处理后,(-)2,(-)9和野生型植株的Fv/Fm分别下降了20.1%,17.9%,12.1%。在低温弱光处理过程中转反义基因植株与野生型的氧化态P700都降低,转反义基因株系植株P700的下降更为显着。低温处理后,(-)2,(-)9和野生型植株中O_2~(-|-)含量分别增加了79.1%,76.4%和62.7%。经低温弱光处理后,野生型和转反义基因植株中MDA含量都增加,转反义基因植株中MDA含量增加更为显着,低温胁迫12小时后野生型,(-)2和(-)9中MDA含量分别增加到138.5 %,159.1 %和161.7%。综上所述,LeVDE的表达受温度、光强和昼夜节律的影响。过量表达该基因减轻了PSII和PSI对光抑制的敏感性。抑制该基因的表达加重了强光和低温弱光胁迫下的光抑制。
高珊[6]2009年在《番茄紫黄质脱环氧化酶基因的体外表达及功能分析》文中研究表明光是植物光合作用的唯一能源,是植物生命活动的基础。然而,当植物吸收的光能超过其电子传递所需时,过剩光能便会造成光合效率和光合功能的降低,严重时还会发生光氧化破坏。植物在长期的进化过程中形成了多种光保护机制,其中叶黄素循环被认为在植物防御光破坏中起着重要作用。所谓的叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时,双环氧的紫黄质(V)在紫黄质脱环氧化酶(VDE)的催化下,经过中间物单环氧的花药黄质(A)转化为无环氧的玉米黄质(Z);在暗处,则在玉米黄质环氧化酶(ZE)的作用下朝相反方向进行,将Z经A重新环氧化为V,形成一个循环。其中紫黄质脱环氧化酶(VDE)和玉米黄质环氧化酶(ZE)是该循环的关键酶。本研究以番茄(中蔬四号)为材料,利用RT-PCR的方法克隆了番茄紫黄质脱环氧化酶基因(LeVDE),并对该基因进行体外表达和功能分析。主要结果如下:1.根据已知序列设计特异引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片中克隆了番茄紫黄质脱环氧化酶基因的cDNA全序列。测序结果显示,番茄VDE的cDNA全长1670bp,ORF为1437bp,推测其编码478个氨基酸,分子量为53KD,该基因被命名为LeVDE。GenBank注册号为No. FJ648424。2.将获得的LeVDE基因成熟蛋白编码区与pET-30a(+)重组,构建原核表达载体pET::LeVDE,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白。通过镍离子亲和层析的方法纯化融合蛋白后免疫小鼠,制备抗体,其抗血清效价为1:500。分别对低温弱光和强光处理的番茄叶片VDE蛋白进行了Western杂交分析。结果表明,LeVDE在蛋白水平的表达始终处于稳态水平,基本不受光强和温度的影响。3.将获得的LeVDE基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,用RT-PCR和Western Blot的方法对带卡那抗性的转基因烟草进一步检测,结果证明成功地获得了转正义和反义基因的烟草植株。与野生型相比,过量表达LeVDE的烟草叶片中A和Z的相对含量较高,脱环氧化保持较高水平。LeVDE表达发生沉默的烟草植株中A和Z的相对含量较低,脱环氧化受到抑制。4.在强光(1200μmol m~(-2)s~(-1))及低温弱光(4℃,100μmol m~(-2)s~(-1))胁迫下,野生型和转基因株系NPQ与叶黄素循环脱环氧化状态(A+Z)/(V+A+Z)都增加,与野生型相比,正义株系增加更多,反义株系增加较少。结果表明,在低温弱光及强光胁迫条件下,LeVDE的过量表达可以提高叶黄素循环的脱环氧化状态,提高了热耗散能力。5.通过测定叶绿素荧光参数和净光合速率,探讨了过量与抑制LeVDE的表达在强光和低温弱光胁迫下对PSⅡ的影响。与野生型相比,胁迫条件下正义株系的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、净光和速率(Pn)下降程度较小,而反义株系的下降程度较大。表明LeVDE的过量表达减轻了PSⅡ对光抑制的敏感性,而抑制LeVDE的表达加剧了PSⅡ的光抑制。
林荣呈[7]2002年在《水稻、菠菜紫黄质脱环氧化酶基因的克隆、遗传转化及其特性的研究》文中提出自发现叶黄素循环具有热耗散的作用后，它被引起广泛的关注。目前普遍认为叶黄素循环的色素定位于天线色素蛋白复合体上，在跨膜质子梯度(△pH)形成后，玉米黄质(Z)和环氧玉米黄质(A)能够从叶绿素中吸收过多的激发能，并以热能的形式耗散到体外，从而保护光合器官免受强光的破坏。紫黄质脱环氧化酶(VDE)是叶黄素循环的关键酶，在较低的pH条件下，它能在数分钟内将紫黄质(V)转变为Z和A。本论文从水稻和菠菜中克隆了编码VDE酶的基因，并通过转基因植物进一步研究了叶黄素循环在热耗散方面的作用，主要获得了以下结果： 首次从两个水稻亚种(籼稻和粳稻)中克隆了Rvde基因(分别命名为iRvde和jRvde)的全长cDNA序列，分别长1647bp和1887bp，两者开放阅读框的同源性为98％，与其它已知vde基因的同源性在60％以上。推导两者均编码446个氨基酸，其中转运肽序列长98个氨基酸，两者成熟蛋白的氨基酸序列完全相同，与已知VDE成熟蛋白的同源性在75％以上，其中与小麦的同源性最高，达87.4％。 通过PCR扩增获得了Rvde基因的核基因组DNA序列，在它们的编码区中含有4个内含子，其长度在jRvde中分别为105bp、327bp、81bp和69bp，而iRvde基因的第2个内含子长425bp，与jRvde的第2个内含子差别较大。内含子的AT含量为60～63％，其两端为典型的GT／AG结构。 构建了jRvde基因的原核表达载体pET-Rvde，在0.4mmol／L IPTG的诱导下，该基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达，SDS-PAGE和Western杂交表明表达蛋白的分子量约为43kDa。随着IPTG诱导时间的延长，蛋白量逐渐增加，诱导4h后，它占大肠杆菌总蛋白的25％左右。吸收光谱差值A_(502-540)随反应的进行逐渐增大，反应体系总色素的HPLC分析表明，V逐渐降低，而Z刚好相反，说明表达的蛋白具有与活体VDE酶相同的功能，能在体外将V转变为A和Z。 从菠菜中克隆了Svde基因，并构建了该基因的反义抑制植物表达载体pCB-antiSvde，用根癌农杆菌介导法转化烟草，获得了大量的转基因植株。再生的愈伤组织经GUS染色后呈兰色。PCR扩增潮霉素抗性基因hpt和Svde基因结果显示，在‘转淬回植株T斤T；代中都分别扩增出互．okb和二．4比的目的片段，而在未转化的对照 植株中没有扩增。转基因植株的L代种了在潮霉素培养基上的萌发数与未萌发数的 比值为3：l，符合单基因的盂德尔分离规律。从T；代转基因植株中筛选出抑制程度较 强的一个株系A29，Soul。hem杂交结果表明外源S。de因已整合到烟草的基因组中， 并且只有一个插入位点。通过冻融法从该植株的类囊体中提取VDE酶，其酶活性为 3．2，是对照植株的45．7％，表明VDE酶受到了抑制。荧光动力学及HPLC测定结果显 示，强光处理后，在转基因植株中，Z和A的形成较少，非光化学淬灭（NPQ）值较对 照低，Fv”m的下降较对照快，表明转基因植株的热耗散能力下降，进而说明叶黄素 循环具有热耗散的功能。 同时还建立了根癌农杆菌介导的水稻遗传转化体系，并初步作了转化sVs基因 的试验。另外，还建立了一种适合于筛选转基因植株的DNA微量提取法，此方法操 作快捷方便，一个人在一天内能制备 50多个样品，100mg的植物鲜样平均可获得 40卜g的DNA，提取的DNA可直接用于PCR反应、酶切分析及Southern分析。
孟斌[8]2008年在《小麦叶黄素循环关键酶基因的表达与功能分析》文中研究说明当植物吸收的光能过剩超过其电子传递所需时,过剩光能便会造成光合效率和光合功能的降低,严重时还会发生光氧化破坏。植物在长期的进化过程中形成了多种光保护机制,可将过剩激发能对光合机构的损伤减小到最低程度,其中叶黄素循环被认为在植物防御光氧化破坏中起着重要作用。所谓的叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时,双环氧的紫黄质(V)在紫黄质脱环氧化酶(VDE)的催化下,经过中间物单环氧的花药黄质(A)转化为无环氧的玉米黄质(Z);在暗处,则在玉米黄质环氧化酶(ZE)的作用下朝相反方向进行,将Z经A重新环氧化为V,形成一个循环。其中紫黄质脱环氧化酶(VDE)和玉米黄质环氧化酶(ZE)是该循环的关键酶。因此,弄清叶黄素循环的功能以及该循环的调控机理具有非常重要的意义。本文以小麦(旱丰9703)为材料,利用RT-PCR克隆了小麦紫黄质脱环氧化酶基因(WVDE)和玉米黄质环氧化酶基因(WZE),并分析了两个基因在小麦中的表达特征。构建了WVDE和WZE基因反义表达载体,并转化烟草,探讨了转基因烟草耐低温弱光和强光胁迫能力的变化。主要结果如下:1、根据已知序列设计特异引物,通过RT-PCR的方法从小麦叶片中克隆了小麦紫黄质脱环氧化酶和玉米黄质环氧化酶基因的中间片段序列。2、Northern杂交结果表明,WVDE表达量随强光和低温弱光处理时间的延长逐渐增大,6小时达到最大,之后逐渐稳定。WZE的表达趋势与WVDE的相似。不同光强、不同温度条件下WVDE和WZE表达趋势基本相同,说明WVDE和WZE在RNA水平的表达不受温度和光强的影响,而是受到内生节律的调控。3、将获得的小麦紫黄质脱环氧化酶基因和小麦玉米黄质环氧化酶基因分别与含有35S启动子的PBI121载体重组,构建了反义表达载体,利用农杆菌介导法转入烟草中,获得了转基因烟草。在低温弱光及强光胁迫条件下,依赖叶黄素循环的NPQ能够耗散过剩激发能,而转WVDE基因烟草比野生型耗散能力下降;强光处理过程中,与野生型相比转基因烟草的Fv/Fm降低更明显,且野生型的Fv/Fm恢复较快,转基因植株恢复较慢。低温弱光处理时,野生型和转基因株系Fv/Fm降低程度要小于强光胁迫,但总的变化趋势基本相同,这表明WVDE的抑制加重了PSII的光抑制程度,与野生型相比,转基因烟草的PSII反应中心受伤害较严重;强光胁迫6 h和12 h,野生型和转基因烟草的放氧速率降低非常显着,低温弱光处理6 h和12 h,野生型和转基因烟草的放氧速率都降低,但下降程度不如强光处理下的明显。这表明由于VDE的表达抑制降低了低温弱光和强光胁迫下放氧复合体的稳定性,使光合机构所受到的伤害加重;对野生型和转WZE基因烟草进行同样的强光和低温弱光胁迫处理,但两者之间似乎差别不大。4、对转WVDE基因植株和野生型烟草的幼叶与成熟叶分别进行northern杂交分析,结果显示VDE基因在烟草幼叶当中的表达水平要比成熟叶的高。进一步测定强光胁迫条件下幼叶与功能叶的光合和荧光参数,幼叶受强光胁迫的影响要比功能叶小的多。膜脂测定结果显示,幼叶当中不饱和脂肪酸的含量要稍高于功能叶,或许这也是导致幼叶的抗光氧化能力高于成熟叶的原因之一。
朱素琴[9]2011年在《高盐/低温胁迫下水稻叶细胞内ASC的氧化还原状态和外源ABA的作用研究》文中提出采用基因表达谱芯片技术、实时荧光定量PCR、叶绿素荧光技术、基因克隆、原核表达等分子生物学和生物化学方法,研究了水稻叶内ABA-紫黄质循环和氧化还原平衡及其介导下的活性氧清除系统对高盐/低温逆境的响应。第一,水稻响应高盐/低温胁迫的ABA-紫黄质循环和氧化还原网络的构建。氧化还原网络具有清除ROS的功能,由抗氧化的非酶类物质如抗坏血酸(ASC)、谷胱甘肽、生育酚等和抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)等组成。基因表达谱芯片的数据分析表明,该系统涉及191个基因和/或EST。在低温逆境下,籼稻(i-93-11)/粳稻(j-NJ-1)表达上调(2倍以上,下同)基因有5/5个、下调(0.5倍以下,下同)基因有2/6个；在高盐胁迫下,表达上调基因32/27个、下调基因13/25个。ABA-紫黄质循环体系包括ABA合成、ABA分解途径和紫黄质循环。基因表达谱芯片的数据分析表明,该系统涉及22个基因和/或EST。在低温逆境下,籼/粳稻表达上调基因3/2个,没有检测到表达下调基因；在高盐胁迫下,籼/粳稻表达上调基因7/6个、下调基因6/5个。在高盐/低温胁迫下,NCED基因、8’OX基因、ZEP和VDE基因表达量发生了显着变化,这些基因的产物分别是ABA合成、ABA分解途径和紫黄质循环中的关键酶,说明ABA-紫黄质循环在逆境条件下也起着关键作用。进一步根据水稻基因表达谱芯片数据构建了水稻响应高盐/低温胁迫的ABA-紫黄质循环和氧化还原平衡介导的ROS清除网络,这是一个庞杂的酶促和非酶促生化反应网络体系,涉及到光合电子传递、呼吸链电子传递。该体系在细胞质、叶绿体(基质、类囊体膜、类囊体腔)和线粒体(内膜和基质)、过氧化物体等中进行。水稻中至少包括191个和22个基因组成的网络分别参与ROS的调控和ABA-紫黄质循环,该网络具有高度的灵活性和互补性。抗坏血酸(ASC)的氧化还原作用将ROS清除系统和ABA-紫黄质循环有机地联系在起,形成一个复杂的网络系统,在保护水稻光合机构免受氧化伤害的过程中起着非常重要的作用。第二,高盐或低温胁迫下ABA-紫黄质循环体系的保护作用。ABA预处理(+ABA)和非ABA预处理(-ABA)水稻叶片分别进行高盐胁迫(+SS)和非高盐胁迫(-SS)、低温处理(+LT)和非低温处理(-LT)后,置入1500μmolm-2s-1的PFD下,测定不同处理水稻叶片的PS Ⅱ实际光化学效率(φPS Ⅱ)、非光化学淬灭(NPQ)、紫黄质循环组分,并对紫黄质(V)的脱环氧化作用进行了动力学分析。采用RTqPCR技术,研究了ABA代谢和紫黄质循环相关基因在不同处理条件下的表达情况。根据水稻基因组序列和已知的ABA代谢和紫黄质循环相关基因序列设计引物,采用PCR技术克隆到相关基因翻译起始位点ATG上游启动子序列,克隆了叁个关键酶(ZEP、NCED和VDE)基因,并进行了分子生物学分析。高盐胁迫或低温逆境下PS Ⅱ实际光化学效率(ΦPS Ⅱ)下降、PS Ⅱ还原性增强、非光化学淬灭(NPQ)增加。与低温逆境相比,高盐胁迫导致PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)下降得更多,PS Ⅱ更还原,非光化学淬灭(NPQ)上升的幅度更少。外源ABA可减少PSⅡ实际光化学效率(ΦPS Ⅱ)下降,减轻PS Ⅱ的还原状态,并增加非光化学淬灭(NPQ)容量。因此,低温逆境水稻较高盐胁迫水稻,ABA预处理水稻较非ABA预处理水稻有更高的光合电子传递活性(P),更多的能量耗散(D)和更少的过量光能(E)积累。外源ABA可增大水稻叶片中紫黄质循环库,促进紫黄质循环组分中紫黄质脱环氧化作用,通过改变紫黄质循环动力学提高非光化学淬灭(NPQ)水平。外源ABA和紫黄质循环介导的非光化学淬灭(NPQ)之间的协同作用可保护水稻叶片在高盐胁迫/低温逆境下免受氧化伤害。高盐胁迫(—ABA+SS)下(?)(?)CED4基因,低温逆境(—ABA+LT)下NCED5和NCED4基因表达上调,分别为7.579、3.777和3.589倍。另外,高盐胁迫*低温逆境下8’OX1基因的表达量分别高达13.874和51.253倍,VDE基因的表达量分别达2.326和2.956倍,ZEP基因的表达量分别达2.985和1.874倍。NCED、8'OX、VDE和ZEP酶分别是ABA合成、ABA分解和紫黄质循环的关键酶,高盐胁迫/低温逆境能诱导ABA的代谢和紫黄质循环。外源ABA能明显增加+ABA+SS、+ABA+LT水稻叶内上述基因的表达量。在高盐胁迫(—ABA+SS)、低温逆境(—ABA+LT)、或在添加外源ABA的高盐/低温(+ABA+SS和+ABA+LT)条件下,ZEP(LOC_Os04g37619)基因的表达均明显上调。该基因上游序列中有ABRE、MYC/MYB、DRE和EP2等顺式作用元件,其表达可能受依赖于ABA(如ABRE、MYC/MYB元件)或不依赖于ABA(如DRE元件)的非常复杂的网络体系调控。NCED4基因、(?)(?)CED5基因、8'OX1基因、VDE基因对高盐胁迫、低温逆境、添加外源ABA等均有不同程度的敏感性,其表达量均有不同程度的增加。ZEP酶的N-末端有一段脂溶性的“β片层-套环-α-螺旋”结构,NCED酶蛋白N-末端有一段两性(脂溶性和水溶性)α-螺旋,VDE序列中含有保守的4个His残基和高电荷C-末端区,上述酶的这些特性与水稻在特定条件下通过调节酶的催化活性来适应变化了的环境有关。ABA代谢及紫黄质循环相关酶活性受基因转录、转录后修饰、酶分子的脂溶性和水溶性、酶分子所在溶液的pH值等的调节。第叁,高盐/低温胁迫下ASC的氧化还原状态及相关基因/蛋白质表达分析。为了解逆境对水稻叶内抗坏血酸含量及氧化还原状态的影响,分别以高盐和低温胁迫为例,研究了它们对水稻叶内抗坏血酸、脱氢抗坏血酸含量以及单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等四种酶活性及其相关基因表达的影响。结果如下：逆境下水稻叶内H2O2含量逐渐增加,ASC/DHA比值不断下降,且下降的幅度明显大于对照。ASC/DHA比值是水稻叶内抗氧化系统清除活性氧潜力的一个重要指标。MDHAR酶和DHAR酶分别催化MDHA和DHA还原生成ASC。逆境下编码MDHAR酶的5个基因中有2个基因表达上调,编码DHAR酶的2个基因中有1个基因表达上调。逆境下MDHAR酶和DHAR酶活性均有不同程度的增加,其变化趋势与相关基因表达量的变化趋势一致。GLDH酶催化半乳糖酸-1,4-内酯脱氢生成ASC,是ASC生物合成途径中最后一步反应的关键酶。GLDH酶位于线粒体内膜,是膜结合酶。编码GLDH酶的基因在逆境下表达上调,与GLDH酶活性增加的变化趋势一致。APX酶催化H2O2还原为H2O,同时将ASC氧化为DHA,是清除H2O2,影响ASC/DHA比值的重要酶。逆境下编码胞质APX(APX1和APX2)的2个基因中有1个表达明显上调,编码过氧化物体APX(APX3和APX4)的2个基因略有上调,编码叶绿体基质APX(APX5、APX6和APX7)和1个类囊体膜结合APX(APX8)基因均有不同程度的下降。通过同源建模,构建了APX酶的3D结构。APX酶含血红素辅基,近端组氨酸的咪唑N是血红素Fe(Ⅲ)的第五个配体、远端组氨酸位于血红素辅基与H2O2结合的一侧,离血红素稍远,不与血红素Fe(Ⅲ)成键,它是酶催化中心的活性位点,具有接受质子的功能。当APX与底物H2O2结合成为酶-底物复合体时,血红素Fe(Ⅲ)的第六个配位位置被H2O2分子占据。APX酶的第二个底物是ASC,位于血红素辅基卟啉环γ位,与丙酸侧链以氢键相连,并与相邻R173/R179的胍基有两个氢键相连,还与相邻K31/T29的ε-氨基/β-OH以氢键相连。ASC不仅是抗坏血酸过氧化物酶的底物之一,而且在维持抗坏血酸过氧化物酶空间构象方面起着非常重要的作用。与胞质APX和过氧化物体APX相比,叶绿体基质APX和类囊体膜结合APX分子中另有一个突环结构。组成突环的氨基酸残基中,所有极性不带电荷氨基酸位于突环结构的内部,且在ASC结合位点的附近形成了一个极性、中性的微环境,这种极性、中性的微环境有利于叶绿体基质APX和类囊体膜结合APX在光下偏碱性(pH8左右)的基质溶液中进行催化反应。通过对胞质APX2基因和类囊体膜结合APX8基因的原核表达研究表明,APX2蛋白和APX8蛋白的分子量分别为28.2kD和44.7kD。动力学分析表明,APX酶催化的生化反应是双底物(ASC和H202)乒乓反应,APX2酶和APX8酶对ASC和H202底物分别有不同的Km值。进一步研究APX酶在不同pH反应液中酶催化活性的变化,发现APX2酶和APX8酶的最适pH分别在6-7和7-8左右。APX8酶的最适pH在7-8左右,进一步证明由突环构建的极性、中性微环境,对叶绿体APX在偏碱性基质中完成催化反应的保护作用。逆境下ASC的氧化还原状态(ASC/DHA比值)的变化是MDHAR基因/酶、DHAR基因/酶、GLDH基因/酶、APX基因/酶共同作用、以及叶绿体和线粒体等细胞器协调作用的结果。综上所述,本文从转录、转录后等不同水平上研究了ABA-紫黄质循环、氧化还原平衡介导的ROS清除系统之间的关系,并筛选候选基因进一步在生物化学和分子生物学水平上探明这种关系。这对于通过基因工程手段辅助植物育种、培育抗氧化逆境的优良种质具有重要意义。
娄永峰[10]2016年在《毛竹光保护及相关基因功能研究》文中指出强光条件下,植物产生光抑制是一种普遍存在的现象。植物中存在着多种防御机制以防止或减少光抑制,其中叶黄素循环是植物应对光抑制的重要保护机制之一。玉米黄质环氧化酶(ZEP)和紫黄质脱环氧化酶(VDE)是叶黄素循环中的两个关键酶,能够催化叶黄素循环组分紫黄质(V)、玉米黄质(A)和玉米黄质(Z)间的相互转化,其中Z含量增加能够提高植物的光保护能力。本研究以毛竹(Phyllostachys edulis)为材料,在研究了强光条件下毛竹叶片的光抑制特征和叶黄素循环在毛竹叶片光抑制防御中作用的基础上,克隆获得了叶黄素循环关键基因ZEP和VDE同源基因,并对其进行了功能研究。同时也对毛竹Psb S基因及其上游启动子区域进行了初步研究。主要结果如下:1、应用叶绿素荧光技术,研究强光胁迫下毛竹的光抑制特征和叶黄素循环在毛竹叶片强光破坏防御中的作用。结果表明,在夏天中午的强光下或人为强光胁迫下,毛竹叶片最大光化学效率(Fv/Fm)均降低(p<0.01),非光化学淬灭(NPQ)均增加;但下午光强减弱或弱光条件下,Fv/Fm可恢复。叶黄素循环抑制剂二硫苏糖醇(DTT)可以抑制紫黄质脱环氧化酶的活性,DTT处理毛竹叶片,抑制其NPQ,使强光下毛竹叶片的Fv/Fm、光化学淬灭(qP)等荧光参数下降幅度明显加大(p<0.01),表明叶黄素循环在毛竹叶片光保护机制中具有重要的作用。2、为筛选毛竹光保护相关基因,在基于强光胁迫下毛竹叶片Fv/Fm和NPQ的变化趋势及自然环境中强光照射时间,选择强光胁迫0 h、0.5 h和8 h后3个时间点进行转录组测序。分析结果表明,共计获得了1293个差异表达基因,其中上调基因中包括OHP、SEP、Elip和Psb S等LHC-like基因以及叶黄素循环关键基因ZEP和VDE,这为后续深入研究毛竹光保护相关基因的功能奠定了基础。3、通过RT-PCR和RACE技术,克隆获得了毛竹中编码玉米黄质环氧化酶基因的全长cDNA序列(GenBank No.KP274885),命名为Pe ZEP,并对其进行了功能分析。该基因cDNA全长2532 bp,编码一个含有670个氨基酸残基的多肽。序列分析表明:PeZEP具有ZEP家族的特征结构域,与水稻(Oryza staiva)等禾本科植物的ZEP高度相似(90%以上)。组织特异性表达分析表明,Pe ZEP在根、茎、叶片、叶鞘中均表达,其中叶片中的表达量最高。在毛竹叶片中,强光和干旱能诱导Pe ZEP的表达上调,而4℃低温胁迫和外源ABA则抑制其表达。Pe ZEP在拟南芥中的功能分析显示,过量表达PeZEP增加了转基因拟南芥对强光的敏感性,同时能增加转基因植株的耐旱性。4、利用实时定量PCR技术研究了Pe VDE在不同胁迫条件下的表达情况。结果表明,强光、42℃高温和干旱等胁迫能诱导毛竹叶片中Pe VDE基因表达的增加,而4℃低温胁迫和外源脱落酸(ABA)在短期内诱导Pe VDE的表达,但随着处理时间增加,其表达受到明显抑制。利用拟南芥vde突变体npq1对毛竹编码紫黄质脱环氧化酶基因Pe VDE的功能进行了研究。结果显示,Pe VDE能够异源互补拟南芥突变体npq1,恢复其NPQ能力,且过量表达Pe VDE可以提高拟南芥的NPQ能力,同时减少强光或低温弱光对其造成的光抑制程度。5、在毛竹中Psb S至少存在2个同源基因(Pe Psb S和Pe Psb S1),两者的开放读码框(ORF)分别长810 bp和807 bp,各自编码269和268个氨基酸多肽,具有91.8%的相似性;两者具有相同的基因结构:4个外显子和3个内含子。基因表达分析显示:Pe Psb S和Pe Psb S1具有相似的表达模式,都在毛竹绿色组织中表达,且受强光诱导表达。利用拟南芥突变体npq4对毛竹PsbS基因功能进行了研究,结果显示,Pe Psb S和Pe Psb S1都能够异源互补拟南芥突变体npq4,恢复其NPQ能力,且过量表达Pe Psb S和Pe Psb S1都可以提高拟南芥在强光下的NPQ和Fv/Fm。6、利用与报告基因GUS融合瞬时表达的方法研究了Pe PsbS和Pe PsbS1的上游启动子的活性。利用毛竹基因组数据,设计引物,克隆了Pe Psb S和Pe Psb S1的上游启动子区域,分别位于起始密码子ATG上游2373 bp和1500 bp。进一步序列分析显示,2个基因的启动子区域均存在大量光响应元件。分别将Pe PsbS和Pe PsbS1启动子与报告基因GUS融合,在烟草中瞬时表达,结果表明2个启动子均可启动GUS基因表达,具有生物学活性。本研究为深入了解毛竹的光保护机制奠定了基础,为解释竹子在自然界广泛分布的环境适应性提供了的参考依据,同时也为开发利用毛竹基因资源提供了良好的借鉴。
参考文献：
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