利玛原甲藻微生物多样性及次级代谢产物的研究

论文摘要

原甲藻是典型的赤潮甲藻,对海洋生态环境有着重要的影响,因此一直引起人们的关注。同时它的代谢产物种类多样且具有很好的生物活性,其代表产物冈田软海绵酸（okadaic acid,OA）及其衍生物鳍藻毒素（dinophysistoxin-1,DTX-1）是导致腹泻性贝毒（diarrheic shellfish poisoning,DSP）的主要组分,通过在海产品中的积累会直接影响到人们的健康,并且可能会导致癌症的发生,然而它又具有一定的药用价值,因此原甲藻代谢产物成为了海洋天然产物领域的研究热点。为了后续研究微藻产毒与其共附生微生物间的关系,对利玛原甲藻（Prorocentrum lima）PL11通过Illumina高通量测序技术,分析了样品中共附生微生物的物种多样性和丰度信息。测序共获得42065条序列,68个OTU;稀释曲线表明测序深度足够;多样性指数Simpson值为0.097,Shannon值为2.807。PL11来源共附生菌包括5门,14纲,26目,38科及54属。其中优势门（>5%）为3个,包括变形菌门（Proteobacteria,75.5%）、拟杆菌门（Bacteriodetes,11.5%）以及浮霉菌门（Planctomycetex,8.5%）。优势纲（>5%）为4个,包括α-变形菌纲（Alphaproteobacteria,51.7%）、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria,31.8%）、鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia,9.9%）以及OM190纲（8.9%）;优势属（>5%）为6个,侏囊菌科下未分类属（norank Nannocystaceae,21.8%）、Pyruvatibacte属（11.6%）、Phaeodactylibacter属（9.4%）、生丝单胞菌科下未分类属（norank Hyphomonadaceae,8.5%）、OM190纲下未知属（8.1%）以及Roseovarius属（7.9%）。从PL11培养物中分离获得可培养细菌9株,分属于8个属,包括Ochrobactrum sp.（2株）及Microbacterium sp.、Algoriphagus sp.、Ponticoccus sp.、Hoeflea sp.、Labrenzia sp.、Sphingopyxis sp.、Erythrobacter sp.各1株。其中菌株PL11-1为潜在新种。菌株PL11-1与fan3-1可能与藻细胞产毒密切相关。对P.lima次级代谢产物进行研究。运用薄层层析、正相硅胶柱、反相硅胶柱、MCI柱、Sephadex LH-20凝胶柱、半制备HPLC以及重结晶等方法对提取物进行分离纯化,得到17个单体化合物;结合现代波谱学手段(LC-TOF MS、1H-和13C-NMR)和物理化学方法鉴定了其中15个结构（1–15）。从P.lima PL11、PL-L的代谢产物中分离鉴定了10个单体化合物（1–4,8,1012,14,15）;从P.lima PL01的代谢产物中分离鉴定了5个单体化合物（5–7,9,13）。其中毒素OA（1）及其衍生物OA甲酯（2）和环亚胺毒素prorocentrolide（3）分别是原甲藻特征性的腹泻性贝毒、环亚胺毒素类代谢产物,而化合物4-9、13、15等均为首次从该属微藻中报道。其中化合物（Z）-1,6,6-trimethyl-7-oxabicyclo[2,2,1]heax-2（9）-en-10-oic acid（4）、apo-9’-fucoxanthinone（5）和3,5-Dihydroxy-6,7-megastigmadien-9-one（6）具有独特的多取代六元环系及不饱和官能团,从生源上应该是来源于类胡萝素。化合物7–15分别为苯甲酸,3-吲哚甲酸,3-吲哚甲醛,胸腺嘧啶,胸腺嘧啶核苷,胞嘧啶,5-Hydroxy-3,4-di-methyl-5-pentyl-2（5h）-furanone,二十二碳六烯酸乙酯,5-氨基戊酸。为了研究毒素在贝类体内的代谢转化,选取华贵枳孔扇贝和贻贝为对象,使用LC-MS对原甲藻提取物以及贝肉组织提取物进行检测;实验前后,藻细胞的密度大幅增加。P.lima提取物含有环亚胺毒素prorocentrolide;暴露于密度分别为104、103cells/L的原甲藻中48h后,贻贝和扇贝组均没有检测到prorocentrolide;在扇贝组S1,S2中检测到OA衍生物3-Hydroxy-2-methylenepropyl ester。除了毒素产物,原甲藻提取物中还有三种主要成分,分子质量分别为678.89（v%为24.95）,791.57（v%为21.80）以及904.67（v%为7.31）。主成分1、2在贻贝中的积累量大于扇贝,不同浓度组之间没有明显差异。主成分3在各组间均无明显差异。P.lima是典型的产毒赤潮甲藻,充分研究其次级代谢产物,发现其中可能含有的活性良好的毒素以及结构新颖的化合物。对其在贝类中的代谢转化进行进一步探索,对我国海产品的食用安全问题具有十分重要的意义。

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摘要

ABSTRACT

引言

第一章原甲藻次级代谢产物研究进展

1.1 聚酮类

1.2 甾醇

1.3 OA及其衍生物的产生机制

1.4 影响原甲藻产毒的因素

1.4.1 营养因素

1.4.2 物理因素

1.5 生物活性

1.5.1 对PP1和2A的特异性抑制

1.5.2 细胞毒作用

1.5.3 对神经系统的作用

1.5.4 对免疫系统的作用

1.5.5 肿瘤促进和致癌性

1.6 结论和展望

第二章利玛原甲藻共附生菌多样性研究

2.1 材料与仪器

2.1.1 材料

2.1.2 仪器

2.2 实验方法

2.2.1 藻培养

2.2.2 高通量测序及数据分析

2.2.3 可培养共附生菌株的分离及鉴定

2.3 结果与分析

2.3.1 样品信息统计

2.3.2 利玛原甲藻的共附生菌多样性分析

2.3.3 利玛原甲藻可培养共附生菌的系统发育进化分析

2.4 本章小结

第三章利玛原甲藻次级代谢产物的研究

3.1 材料与仪器

3.1.1 材料

3.1.2 仪器

3.2 实验方法

3.2.1 收集藻细胞

3.2.2 浸提

3.2.3 次级代谢产物的分离与纯化

3.3 结果与分析

3.3.1 结构鉴定

3.3.2 化合物分析

3.4 本章小结

第四章利玛原甲藻代谢产物在贝类中的代谢转化

4.1 材料与仪器

4.1.1 材料

4.1.2 仪器

4.2 实验方法

4.2.1 原甲藻的培养

4.2.2 原甲藻代谢产物的提取

4.2.3贝类暴露实验

4.2.4 贝肉样品中化合物提取

4.2.5 化合物检测

4.3 结果与分析

4.3.1 扇贝和贻贝对藻的摄食情况

4.3.2 代谢产物在贝类体内的积累转化

4.4 本章小结

第五章结果与展望

5.1 结果讨论

5.2 展望

参考文献

附录

附录一英文缩略语

附录二化合物谱图

论文发表情况

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李月月

导师: 樊成奇

关键词: 利玛原甲藻,共附生微生物,次级代谢产物,分离纯化,贝类代谢

来源: 上海海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 上海海洋大学

分类号: Q945

DOI: 10.27314/d.cnki.gsscu.2019.000125

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