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柑橘CitERF108转录子的克隆及抗旱功能研究

2020-12-02阅读(240)

柑橘CitERF108转录子的克隆及抗旱功能研究

论文摘要

柑橘是我国重要的水果类作物,经济价值高,种植面积大。由于我国柑橘主要种植在丘陵山区,因此常面临干旱胁迫,影响其产量和品质。为抵御逆境胁迫,植物进化出大量抗逆相关基因,其中转录因子尤为重要,如:NAC、ERF、CAMTA、MYB、MYC、bZIP等。ERF是植物特有的一类转录因子,广泛参与生长发育和抗逆胁迫,近年来在拟南芥、水稻和番茄等模式植物上关于ERF抗逆性研究较多,但在柑橘中却很少报道。可见,解析柑橘ERF成员在抗逆中的生物功能,对改良柑橘抗逆性具有重要理论意义。本试验从资阳香橙（Citrus junoscv.“Ziyang”）中克隆获得CitERF108基因及其启动子（Q108）序列。利用生物信息学对CitERF108的基因结构、亲缘关系、预测蛋白特性等进行了分析,同时对Q108上的顺式作用元件进行了预测。采用基因表达、亚细胞定位和遗传转化等手段,研究了CitERF108在抵抗干旱胁迫中的生物功能和响应机制。主要结果如下:（1）从资阳香橙中克隆获取柑橘CitERF108（ID:Ciclev10001138）全长,运用生物信息学对其预测蛋白分子量、等电点、不稳定系数、结构域等分析,结果表明该基因含1个内含子,可编码448个氨基酸。CitERF108属于亲水蛋白,含有ERF家族特有的AP2保守结构域,且AP2保守结构域内第14和第19位分别是丙氨酸和天冬氨酸,含有WLG、YRG、RAYD保守元件;聚类分析发现,CitERF108与拟南芥AtERF111亲缘关系较近,推测柑橘CitERF108可能参与了ABA依赖型应激反应,并能增强植株的抗旱、抗盐性;亚细胞定位表明:CitERF108位于细胞核中。（2）基因表达分析结果表明,CitERF108在根、叶、子叶、果皮和种子中均有表达,其中在种子中表达量最高,而在茎中几乎不表达;激素和非生物胁迫处理结果表明,在根中该基因受SA、ETH、6-BA、IAA、ABA、JA、GA3以及非生物胁迫干旱和盐害的诱导;在叶中受ETH、JA诱导,而在SA处理条件下是呈现先上升再下降又上升的趋势,其中3h时表达量最高,6h、12h表达量急剧下降,24h时又上调;在6-BA、ABA、GA3条件下是先上调后下调的表达模式,都是在24h时表达量下降,其中,在6-BA和ABA处理条件下都是在6h时达到峰值,GA3处理条件下是在3h时达到最高点;在IAA处理条件下呈现出先下降后上升的趋势,在3h时表达量下降,6h时又开始逐步上升,在盐害处理条件下,3h、6h、12h时上调趋势不明显,24h时骤然上调达到最高点,在干旱处理条件下,3h时略有下降,6h时有所上升,12h达到峰值,上述结果表明,CitERF108在柑橘的生长发育和逆境响应中发挥着重要作用。（3）将CitERF108转化烟草,获得T0代转基因植株。转基因植株较野生型表现出更强的抗旱性。在干旱处理后,转基因株系叶片中脯氨酸含量高于野生型,其中,野生型株系脯氨酸含量为109.5μg,而转基因的三个株系达到117.3μg、221.5μg和112.3μg;在转基因株系中NtSOD和NtCAT的表达量明显高于野生型,表明CitERF108调控了抗旱相关基因的表达;台盼蓝染色结果表明,干旱处理后的转基因植株叶片显色较野生型浅,表明野生型株系细胞膜的完整性较转基因差。上述结果表明,CitERF108主要通过提高转基因植株的脯氨酸含量和抗氧化能力来抵御干旱逆境。（4）对启动子顺式作用元件预测发现,Q108启动子序列中含有响应水杨酸、生长素、茉莉酸、脱落酸、乙烯以及温度和光等顺式作用元件;构建携带GUS基因的Q108表达载体,并转化烟草,通过GUS组织化学染色显示,6mmol/L的ACC溶液处理24h后,叶脉部位被染成蓝色,但蓝色较深的部位在叶缘;1mmol/L的ABA溶液处理24h后,叶脉部位被染成蓝色,且染色较为均匀;4℃冷害处理3h后,叶脉部位被染成蓝色;20%PEG6000处理24h后染色部位均在烟草腺体顶端,而无处理及对照处理均未被染成蓝色。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 文献综述
  •   1.1 植物转录因子
  •     1.1.1 植物转录因子的结构
  •     1.1.2 植物转录因子的种类
  •     1.1.3 植物转录因子的生物功能
  •   1.2 AP2/ERF超基因家族
  •   1.3 ERF转录因子
  •     1.3.1 ERF结构特点
  •     1.3.2 植物ERF基因家族的亲缘关系
  •     1.3.3 ERF的生物功能
  •       1.3.3.1 非生物胁迫应答
  •       1.3.3.2 ERF与植物抗病性
  •       1.3.3.3 ERFs对植物生长发育的调控
  • 第2章 引言
  •   2.1 研究背景
  •   2.2 研究目的和意义
  •   2.3 主要研究内容
  •   2.4 研究目标
  •   2.5 研究的技术路线
  • 第3章 柑橘CitERF108的克隆与表达分析
  •   3.1 试验材料与方法
  •     3.1.1 柑橘CitERF108的生物信息学分析
  •     3.1.2 植物材料的采集及处理
  •     3.1.3 实验仪器
  •     3.1.4 RNA的提取
  •     3.1.5 cDNA的合成
  •     3.1.6 引物及合成
  •     3.1.7 荧光实时定量PCR
  •   3.2 结果与分析
  •     3.2.1 CitERF108基因全长的克隆与预测蛋白特性分析
  •     3.2.2 CitERF108基因保守性分析
  •     3.2.3 CitERF108基因的组织特异性
  •     3.2.4 CitERF108对激素的响应
  •     3.2.5 CitERF108对非生物胁迫的响应
  •   3.3 讨论
  • 第4章 柑橘CitERF108的定位及抗旱功能分析
  •   4.1 试验材料与方法
  •     4.1.1 实验材料
  •       4.1.1.1 植物材料
  •       4.1.1.2 宿主菌及载体
  •       4.1.1.3 酶、试剂及培养基的配置
  •       4.1.1.4 仪器及激素配置
  •     4.1.2 实验方法
  •       4.1.2.1 pBI121-CitERF108超表达载体的构建
  •       4.1.2.2 转化DH5α 大肠杆菌
  •       4.1.2.3 质粒的提取
  •       4.1.2.4 转化农杆菌EHA105
  •       4.1.2.5 W38烟草的遗传转化
  •       4.1.2.6 转基因材料的鉴定
  •       4.1.2.7 转基因材料抗旱性处理
  •       4.1.2.8 台盼蓝染色
  •       4.1.2.9 脯氨酸测定
  •       4.1.2.10 转基因烟草抗旱基因的表达分析
  •       4.1.2.11 pCambia1301-GFP- CitERF108表达载体的构建
  •       4.1.2.12 pCambia1301-GFP-CitERF108质粒转化农杆菌EHA105
  •       4.1.2.13 农杆菌介导的烟草瞬时转化
  •       4.1.2.14 荧光观察
  •   4.2 结果与分析
  •     4.2.1 CitERF108超表达转基因烟草植株的获取与验证
  •     4.2.2 转基因植株的抗性分析
  •     4.2.3 CitERF108基因的亚细胞定位
  •   4.3 讨论
  • 第5章 CitERF108启动子克隆与分析
  •   5.1 材料与方法
  •     5.1.1 实验材料
  •     5.1.2 试验方法
  •       5.1.2.1 启动子顺式作用元件的预测分析
  •       5.1.2.2 Q108载体的构建
  •       5.1.2.3 质粒的提取及转化农杆菌EHA105
  •       5.1.2.4 农杆菌介导的烟草遗传转化
  •       5.1.2.5 转基因材料的鉴定
  •       5.1.2.6 烟草材料的处理
  •       5.1.2.7 GUS组织化学染色方法
  •   5.2 结果与分析
  •     5.2.1 Q108序列的克隆与分析
  •     5.2.2 启动子Q108的遗传转化
  •     5.2.3 启动子Q108对激素与逆境的响应
  •   5.3 讨论
  • 第6章 结论与展望
  •   6.1 结论
  •   6.2 展望
  • 参考文献
  • 在学期间发表的文章及参研课题
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 潘小婷

    导师: 谢让金

    关键词: 柑橘,转录因子,逆境,启动子,基因表达

    来源: 西南大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,园艺

    单位: 西南大学

    分类号: Q943.2;S666

    总页数: 89

    文件大小: 4010K

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