解脂耶氏酵母非同源基因组整合方法的建立及其在琥珀酸合成中的应用

论文摘要

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中毕赤巴斯德酵母（Pichiapastoris）、多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）和乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）等非常规酵母通常具有独特的生理和代谢特征,是包括生物柴油、重组蛋白和燃料乙醇等在内重要产物的微生物合成宿主,被广泛应用于工业发酵领域。由于缺乏有效的遗传操作手段,非常规酵母的代谢途径改造及非天然化合物的生产依然十分困难。解脂耶氏酵母是一种重要的工业微生物,具有安全性高、耐酸能力强、分泌多种代谢产物和能够利用多种碳水化合物等优点,它被视为潜在的生物工程菌株,受到越来越多的关注。与酿酒酵母不同,解脂耶氏酵母在DNA损伤修复过程中更倾向于利用非同源末段连接（NHEJ）而不是同源重组（HR）。这一特点造成了解脂耶氏酵母遗传工具的匮乏,代谢途径改造费时费力。尽管很多的基因操作工具已经在解脂耶氏酵母中得到发展,大片段DNA的基因组整合依然十分困难。此外,用于生物合成途径优化的多基因表达文库构建策略在解脂耶氏酵母中同样缺乏。为了检测解脂耶氏酵母对线性DNA片段的转化效率,本论文首先将一个完整LEU2表达盒导入该酵母并在相应选择培养基中计算转化子数量。每转化1 μg DNA能够获得高达1.6x104个菌落,说明解脂耶氏酵母能够高效吸收外源线状DNA。有趣的是,利用限制性内切酶HinCⅡ将LEU2片段切割成两个片段,同时转化解脂耶氏酵母后二者能够精确连接并整合基因组。提取整合菌株基因组,并进行PCR验证,结果发现外源DNA以非同源依赖方式高效且随机地插入解脂耶氏酵母基因组。NHEJ修复途径中关键基因ku70的敲除造成转化子数量急剧减少。在筛选标记的帮助下,非同源依赖基因组整合方法能够实现多达三个DNA片段的一步转化和基因组整合,允许高达12.5 kb DNA片段的高效转化,整合效率约为1.7×103菌落/μg DNA。随着整合片段数量的增加,整合效率呈现下降趋势。本论文将报告基因hrGFP与LEU2基因表达盒融合并转化到解脂耶氏酵母菌株中,获得一系列转化子并用于荧光强度的检测。与游离表达菌株相比,基因组整合菌株的hrGFP表达强度存在0.24至3.02倍的表达水平差异。随后,本论文通过Genome walking方法获得6株hrGFP整合菌株的基因组位点信息。hrGFP基因插入位点分布于不同的染色体上且彼此互不相关,进一步证实了非同源依赖基因组整合方式的随机性。随后,本论文使用三种浓度梯度的潮霉素（400 mg/L、800 mg/L和1600 mg/L）来筛选潮霉素抗性基因和hrGFP共同高表达菌株。相对荧光强度和基因拷贝数与筛选压力强弱呈正相关,而整合效率呈负相关。低筛选压力下大多数整合菌株含有单拷贝hrGFP基因,而从较高的潮霉素浓度获得的25号整合菌株插入了多达8个拷贝的hrGFP。这些结果表明非同源的随机基因组整合会造成蛋白质表达水平差异,该现象是受基因插入位点和拷贝数的综合影响。为拓展NHEJ介导随机基因组整合方法的应用领域,本论文以脂酶和β-胡萝卜素的优化合成为例进行了初步探究。首先,在高浓度潮霉素筛选压力下构建解脂耶氏酵母内源性脂酶LIP2的超表达文库,经过酶活筛选获得一系列脂酶生产菌株。其中工程菌株Polf LIP2-2的脂酶活性能够达到1967 U/mL,是游离表达对照菌株的5.3倍。针对由多个基因参与的β-胡萝卜素生物合成途径,本论文依据代谢特征将其模块化处理并分别构建了三个整合片段。单个模块化片段M3的整合和表达验证结果表明,绝大多数转化子呈现红色或者橙色表型,同时不同菌落间的颜色深浅有明显差异。随后,三个模块化片段一步转化解脂耶氏酵母野生菌株,构建获得一个β-胡萝卜素生产菌株文库。通过检测β-胡萝卜素产量发现,整合菌株间的β-胡萝卜素生产能力最多可相差27倍,其中最高产量可达12.1 mg/g DCW。本论文对β-胡萝卜素途径相关基因的转录水平进行了分析,各整合菌株基因的转录水平存在很大差异。40号p-胡萝卜素高产菌株中大多数途径相关基因表现出高转录水平。通过比较高产量菌株（菌株30、34和40）与低产量菌株（菌株1和12）,发现模块3的高水平表达可能对β-胡萝卜素的高产至关重要。琥珀酸又称丁二酸,被美国能源部选为十二种最具商业价值的平台化合物之首。目前,琥珀酸的微生物合成主要依赖各种细菌,但是细菌对酸和渗透压力耐受性低,发酵过程中需要不断加酸碱剂调节pH。而酵母可以进行低pH的生物发酵,除去菌体后的发酵液可以直接蒸发结晶,降低下游工业处理成本。从长远来看,如果解决了酵母生物转化的得率和生产力较低的问题,酵母比细菌更适于琥珀酸的生物制造。本论文系统探究了解脂耶氏酵母的乙酸合成途径,发现丙酮酸脱羧酶PDC的失活对乙酸积累没有明显影响,过表达肠炎沙门氏菌（<Salmonella enteric）来源的SeACSL641P能够使得乙酸浓度降低至4.7g/L。通过挖掘文献资料和菌株改造验证,本论文首次发现CoA转移酶编码基因Ylach的敲除可以有效解除SDH缺陷型菌株的乙酸代谢溢流。在此基础上,通过组合优化增强琥珀酸合成相关的还原羧化、氧化TCA和乙醛酸途径代谢通量来进一步提高琥珀酸生产能力。单独过表达酿酒酵母来源的ScPCK时,摇瓶中琥珀酸产量达到30.2 g/L,相比对照提高了 150.2%。协同过表达琥珀酰CoA合酶亚基YlSCS2和ScPCK可以将琥珀酸产量进一步提高24%,至37.0 g/L。在分批补料发酵中,本论文发现高浓度初始甘油的添加会造成赤藓糖醇和甘露醇等还原性物质的积累,影响琥珀酸合成效率。通过调整初始甘油浓度,在不调节pH情况下,最终工程菌株PGC202琥珀酸产量、生产力和得率分别可以达到110.7 g/L、0.8 g/L/h和0.5 g/g甘油。为了验证工程菌株PGC202工业化生产琥珀酸的潜能,分别进行了小试和中试发酵。以葡萄糖为唯一碳源的小试发酵过程中,琥珀酸产量达到45.4 g/L。中试发酵结果与2.5L和50L发酵罐结果基本一致,经过56h补料培养琥珀酸产量可以达到123.9g/L,同时琥珀酸得率（0.76 g/g甘油）和生产力（2.2 g/h/L）有大幅提升。由此说明,该解脂耶氏酵母琥珀酸生产菌株PGC202的发酵工艺较为稳定,具有一定应用前景。本论文系统探究了解脂耶氏酵母中非同源片段的基因组整合现象,据此开发快速、高效的表达文库构建方法并用于构建高产高价值化合物的微生物菌株。理性改造解脂耶氏酵母氧化TCA途径,解决琥珀酸发酵过程中副产物溢流问题,最终实现了低pH条件下的琥珀酸高效生物合成。

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摘要

ABSTRACT

缩略词表（ABBREVIATION）

第一章绪论

1.1 解脂耶氏酵母概述

1.2 解脂耶氏酵母的生理和代谢特征

1.3 解脂耶氏酵母表达系统

1.3.1 菌株

1.3.2 表达载体

1.3.3 筛选标记

1.3.4 启动子和终止子

1.4 解脂耶氏酵母遗传操作工具

1.4.1 同源重组依赖的遗传操作

1.4.2 CRISPR-Cas9介导的基因组编辑

1.5 解脂耶氏酵母的工业生产应用

1.5.1 油脂

1.5.2 脂肪酸衍生物

1.5.3 有机酸

1.5.4 糖醇

1.5.5 萜类化合物

1.5.6 扩展底物利用范围

1.6 琥珀酸概述

1.6.1 琥珀酸的应用及市场需求

1.6.2 琥珀酸合成相关代谢途径

1.6.3 琥珀酸的分离纯化方法

1.7 真核微生物代谢工程提高琥珀酸合成研究进展

1.7.1 丝状真菌为宿主

1.7.2 酵母为宿主

1.8 本论文的研究内容及意义

第二章非同源依赖的基因组整合方法的开发和利用

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 培养基配方

2.1.3 主要溶液配方

2.1.4 分子生物学常用酶

2.1.5 常用试剂盒

2.1.6 常用生化试剂

2.1.7 仪器和设备

2.2 实验方法

2.2.1 菌种保藏

2.2.2 PCR扩增

2.2.3 Gibson组装和验证

2.2.4 解脂耶氏酵母醋酸锂LiAc转化方法

2.2.5 随机整合文库的构建

2.2.6 酵母菌落PCR

2.2.7 酵母基因组提取方法

2.2.8 基因组定位方法

2.2.9 基因拷贝数检测

2.2.10 脂酶LIP2的发酵和检测

2.2.11 SDS-PAGE凝胶配制及蛋白电泳检测

2.2.12 β-胡萝卜素的发酵和检测

2.2.13 β-胡萝卜素合成途径基因转录水平测定

2.3 实验结果

2.3.1 异源DNA片段以非同源依赖的方式高效转化解脂耶氏酵母

2.3.2 大片段、多片段DNA的一步基因组整合

2.3.3 NHEJ介导的整合导致基因表达水平差异

2.3.4 通过构建随机整合文库筛选脂酶LIP2高产菌株

2.3.5 β-胡萝卜素生物合成途径的一步模块化整合与优化

2.4 本章小结

第三章高产琥珀酸解脂耶氏酵母工程菌株的构建

3.1 实验材料及方法

3.1.1 菌株和质粒

3.1.2 培养基和试剂

3.1.3 质粒构建

3.1.4 培养条件

3.1.5 分析方法

3.1.6 ACH1酶活测定

3.2 实验结果

3.2.1 解脂耶氏酵母SDH缺陷菌株中乙酸溢流关键因素的发掘

3.2.2 重构解脂耶氏酵母中心代谢途径调节副产物形成

3.2.3 还原羧化和氧化TCA途径的协同过表达增强玻珀酸积累

3.2.4 低pH值条件下的琥珀酸分批补料发酵

3.2.5 高产菌株PGC202的琥珀酸小试和中试生产

3.3 本章小结

创新性成果与展望

创新性成果

展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

攻读学位期间获得奖励与荣誉

外文写作

学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 博士论文

作者: 崔志勇

导师: 祁庆生

关键词: 解脂耶氏酵母,非同源依赖的基因组整合,随机表达文库,琥珀酸生物合成

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 山东大学

分类号: TQ921;Q78

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