小鼠酒精性脂肪肝模型的建立

小鼠酒精性脂肪肝模型的建立

张劲松1(通讯作者)吴铁2邹丽宜2

(1广东医学院实验动物中心523808;2广东医学院药理教研室523808)

【中图分类号】R575【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2011)30-0096-03

【摘要】目的探讨建立小鼠酒精性脂肪肝动物模型的方法。方法80只雄性昆明小鼠随机分成4组:NS组每天灌胃生理盐水和普通饲料喂养,HM组、MM组和LM组采用每天按照5g.Kg-1.d-1对小鼠灌胃浓度为60%(V/V)、30%(V/V)和10%(V/V)的乙醇的方法,连续6周,观察其肝脏病理改变、血液等指标的变化。结果造模6周后,模型组小鼠肝脏重量明显升高,与正常组比较有显著性差异;病理表现为广泛的脂肪变性,血清甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(AST)、总胆固醇(CH)升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)显著降低,与正常组比较差异有显著意义(P<0.05);透明质酸(HA)变化不大(P>0.05)。结论本造模方法与人类酒精性脂肪肝病变类似,方法简单易行,实验周期短,模型稳定可靠。

【关键词】酒精性脂肪肝动物模型高脂饲料小鼠

Establishmentofalcoholicfattylivermodelwithalcoholandfatemulsioninmice

【Abstract】AIM:TostudytheEstablishmentofalcoholicfattylivermodelwithalcoholinmice.METHODS:Eightymalemicewererandomlypidedinto4groupswith20ratspergroup:NSgroup(intragastricinfusionofsaline,5ml/kg,fedwithcommondiet)),hMgroup,mmgroupandLMgroup(intragastricinfusionofalcoholby60%V/V,30%V/Vor10%V/V,5ml/kg.Allmiceweresacrificedattheendofthe6thweek.Thepathologicoftheliverandthebiochemistryindexofplasmawereobserved.RESULTS:severefattydepositionwasappeared.serumTG,CH,ALTandASTofhMgroupandLMgroupwerehigherthanNSgroup(P<0.05).CONCLUTION:Thelesionofthealcoholicfattylivermodelinmiceissimilartothatinhumans.Theexperimentisverysimpleandtheexperimentcycleisshortandthe

【Keywords】alcoholicfattyliveranimalmodelmice

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1动物2月龄清洁级昆明种小鼠80只,雄性,体重(22±4)g,由广东医学院实验动物中心提供(广东省动物质量合格证编号:A2010068)。饲养室内温度保持在24℃~26℃,湿度维持在50%~60%,专室饲养,专人负责。

1.1.2药品、仪器与试剂100%分析纯乙醇(广州化学试剂二厂,批号:2007061201);丙氨酸氨基转移酶(ALT/GPT)测试盒,天冬氨酸氨基转氨酶(AST/GOT)和透明质酸(HA)测试盒均购于南京建成生物工程研究所,总胆固醇(TC)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒购于北京中生生物技术股份有限公司,LEICAQWIN图象分析仪(德国莱卡);UV-3010紫外分光光度计(日本岛津);梅特勒-托利多AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器公司上海分公司)。

1.2方法80只小鼠随机分为4组,分别为正常对照组(NS组)、高剂量模型组(HM组)、中剂量模型组(MM组)和低剂量模型组(LM组),每组20只。所有小鼠均于晚上10点后禁食不禁水,次日NS组每天灌喂生理盐水,HM组、MM组和LM组分别予60%(V/V)、30%(V/V)和10%(V/V)乙醇水按照5g.Kg-1.d-1灌胃,每天1次,连续6周,于第6周末禁食12小时后进行取材检测相应的指标。

1.3观察指标及测定方法

1.3.1酒精及高脂饮食对对小鼠一般情况及体重的影响每天观察小鼠的一般症状,进食变化等。

1.3.2酒精对小鼠血清学指标的影响采用摘眼球取血后,分离血浆检测TC、TG、HDL-C、BG(血糖)、AST、ALT和透明质酸HA水平。

1.3.3酒精对小鼠肝脏指数的影响抽血后,剪开右心房,尽量放出余血,迅速取出肝脏,在4℃预冷的生理盐水灌洗后,用滤纸吸干水分,迅速用电子天平称量肝脏的重量,计算肝脏指数。

1.3.4酒精对小鼠肝脏形态组织学的影响称重后的肝脏迅速置于冰上,在肝左叶取10mm×10mm大小肝组织行石蜡包埋切片及HE染色作病理检查,剩余肝组织分别切成小块,置于-70℃冰箱中待测肝组织MDA含量和CAT与SOD活性。

1.4统计学处理实验结果均以表示,应用SPSS11.0软件包进行统计分析,参数资料采用One-WayANOVA检验,非参数资料采用Ridit分析。

2结果

2.1酒精对小鼠一般情况及体重的影响

实验过程中每天观察动物的进食量和饮水量,每周称量体重,称重前禁食10-12小时。由表1可知,前两周动物的体重没有明显的变化,而实验4周后,模型组的体重明显比NS组增加(P<0.05),但第六周开始,HM组的体重明显下降。提示酒精可使小鼠的体重明显增加。

表1酒精对小鼠体重的影响(x-±s,g)

ComparedwithNS:a:P<0.05。

2.2酒精对小鼠血清肝酶和HA的影响

由表2可知,酒精喂养6周后,模型组3组小鼠血清的ALT和AST含量显著升高,与NS组比较,差异具有非常显著意义(P<0.01)。4组小鼠血清的HA含量差异无显著意义(P>0.05)。

表2酒精对小鼠肝酶和HA的影响(x-±s)

ComparedwithNS:a:P<0.05,b:P<0.01。

2.5酒精对小鼠肝脏形态组织学的影响

由表5可知,喂养6周后,与NS组比较,模型组小鼠的肝组织出现了明显的脂肪变性(P<0.05),各组动物的肝组织改变见附图。

表6酒精对小鼠肝脏形态组织学的影响(x-±s,n=10)

注:组间差异使用Ridit分析。

3讨论

本实验研究证明,酒精灌胃6周后,小鼠血清胆固醇和甘油三酯明显升高,而高密低脂蛋白胆固醇显著下降,肝脏的病例组织也显示,长期灌胃酒精的小鼠的肝脏发现明显的脂肪变,提示酒精长期灌胃可造成小鼠脂肪肝的动物模型。研究表明[1],进入体内的酒精90%在肝脏代谢,它能影响脂肪代谢的各个环节,最终导致肝内脂肪堆积,进入肝细胞的酒精,在乙醇脱氢酶和微粒体乙醇氧化酶系的作用下转变为乙醛,再转变为乙酸,还原性辅酶Ⅰ(NADH)与反应性辅酶Ⅰ(NAD)比值的升高可抑制线粒体三羧酸循环,使肝内脂肪酸代谢发生障碍,氧化减弱,使中性脂肪堆积于肝细胞中。另外,NADH的增多又促进脂肪酸的合成,从而使脂肪在肝细胞中堆积而发生脂肪变性,最终导致脂肪肝形成。精有特异性增加胆碱需要量的作用,而胆碱是合成磷脂的原料之一,而磷脂又是合成脂蛋白的重要原料,故磷脂的不足影响了脂蛋白的合成,从而影响了脂肪从肝中顺利运出而形成脂肪肝。大剂量乙醇刺激肾上腺及垂体肾上腺轴,从而增加脂肪组织分解率,源于此的脂肪酸又被肝脏摄取,使肝内甘油三酯合成率增加并堆积,又因极低密度脂蛋白(VLDL)缺乏载脂蛋白使其分泌有障碍,而产生脂肪肝。

参考文献

[1]肖楠,庄辉.酒精性肝病分子发病机制的研究进展.肝脏,2010,15(4):299-302.

[2]徐俊斌.酒精性肝病40例临床分析.医护论坛,2010,7(30):153-154.

[3]刘佚,黄根山,卫晶晶,等.部分生化指标对酒精性脂肪肝与非酒精性脂肪肝鉴别诊断意义的探讨.中国医学创新,2010,7(27):102-104.

[4]李德富,周小龙.酒精性肝病的危险因素研究现状,泸州医学院学报,20104(33):453-456.

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