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纤维水解辅助蛋白SwoⅠ的结构域功能及应用

2020-12-02阅读(882)

纤维水解辅助蛋白SwoⅠ的结构域功能及应用

论文摘要

木质纤维素是地球上含量最丰富,最有潜力的可再生资源之一,但其复杂的网状结构阻碍了它的高效酶解与利用,因此,提高木质纤维素酶解糖化效率是降低木质纤维降解转化成本的首要任务,而辅助蛋白可以提高降解木质纤维素过程中的酶解效率。本研究针对可降低纤维素结晶度的里氏木霉来源的辅助蛋白Swollenin,对其结构域功能及其与纤维素酶的融合蛋白的应用进行探究研讨。经生物信息学方法分析,辅助蛋白SwoⅠ由纤维素结合模块（CBM）、Linker区域、类似糖苷水解酶45家族的结构域（Expansin-like-GH45）和类似花粉过敏源A-区域的结构域（Expansin-like-pollen-A）四个部分组成。通过RT-PCR方法获得Expansin-like-GH45 编码基因（swob）、Expansin-like-pollen-A 编码基因（swoc）、SwoⅠ去除CBM和Linker区域后的编码基因（swobc）以及去除信号肽的SwoⅠ编码基因（swo/）。经密码子优化后,在毕赤酵母内异源表达SwoB、SwoC、SwoBC和SwoⅠ蛋白。水解实验表明,SwoⅠ全长及其结构域,对滤纸纤维结构有不同程度的疏松和崩解;当SwoB、SwoC、SwoBC和SwoⅠ蛋白协助纤维素酶水解羧甲基纤维素钠时,还原糖产量分别提高了 13%,5%,25%和33%。分析EG Ⅱ与SwoⅠ结构域的蛋白结构,将EG Ⅱ与SwoⅠ结构域设计成融合蛋白,以（GGGGS）2柔性连接肽连接。通过重叠延伸PCR,将egⅡ与swoI结构域基因融合成目的基因e-b、e-c、e-bc、e-s,并成功在毕赤酵母内异源表达融合蛋白E-B、E-C、E-BC、E-S。研究表明,融合蛋白的酶学性质与融合前相似,水解CMC时,融合蛋白E-B、E-BC与E-S产生的水解活性比融合前分别提高了约13%、18%和25%,其中E-C中的内切纤维素酶活性几乎不变,可能是折叠时活性位点被覆盖。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1 前言
  •   1.1 木质纤维素
  •     1.1.1 纤维素
  •     1.1.2 半纤维素
  •     1.1.3 木质素
  •   1.2 木质纤维素降解酶类
  •     1.2.1 纤维素酶
  •     1.2.2 半纤维素酶
  •     1.2.3 木质素酶
  •   1.3 纤维素降解辅助蛋白
  •     1.3.1 碳水化合物结合模块（CBM）
  •     1.3.2 裂解性多糖单加氧酶（LPMO）
  •     1.3.3 植物扩张蛋白（Expansins）
  •     1.3.4 膨胀素（Swollenin）
  •   1.4 SwoⅠ结构域功能及应用
  •     1.4.1 SwoⅠ结构域的研究
  •     1.4.2 SwoⅠ结构域的应用
  •   1.5 课题的立题背景和研究内容
  •     1.5.1 立题背景
  •     1.5.2 研究内容及技术路线图
  • 2 材料与方法
  •   2.1 材料与仪器
  •     2.1.1 主要试剂
  •     2.1.2 主要仪器
  •     2.1.3 菌株和质粒
  •     2.1.4 主要培养基
  •     2.1.5 主要溶液
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 生物信息学方法分析蛋白
  •     2.2.2 目的基因的获取
  •     2.2.3 重组质粒的构建
  •     2.2.4 毕赤酵母表达菌株的筛选
  •     2.2.5 蛋白的纯化与透析
  •     2.2.6 SwoⅠ结构域的作用及协同性研究
  •     2.2.7 融合蛋白的酶学性质及水解特性
  •   2.3 分析方法
  •     2.3.1 SDS-PAGE分析
  •     2.3.2 蛋白质浓度测定
  •     2.3.3 DNS法测定还原糖
  •     2.3.4 内切纤维素酶酶活测定
  • 3 结果与讨论
  •   3.1 蛋白生物信息学分析
  •     3.1.1 SwoⅠ编码基因密码子优化
  •     3.1.2 SwoⅠ结构分析与预测
  •     3.1.3 小结
  •   3.2 SwoⅠ结构域克隆表达及协同活性分析
  •     3.2.1 里氏木霉总RNA的提取
  •     3.2.2 SwoⅠ结构域与内切纤维素酶编码基因的克隆
  •     3.2.3 SwoⅠ结构域与内切纤维素酶重组载体的构建与验证
  •     3.2.4 SwoⅠ结构域与内切纤维素酶酵母转化子的转化与验证
  •     3.2.5 SwoⅠ结构域与内切纤维素酶的诱导表达及分析
  •     3.2.6 SwoⅠ结构域蛋白功能研究
  •     3.2.7 小结
  •   3.3 融合蛋白克隆表达及活性分析
  •     3.3.1 融合基因的获取
  •     3.3.2 融合蛋白重组载体的构建与验证
  •     3.3.3 融合蛋白毕赤酵母的转化与验证
  •     3.3.4 融合蛋白的诱导表达及表达产物分析纯化
  •     3.3.5 融合蛋白酶学性质及水解特性
  •     3.3.6 小结
  • 4 结论
  • 5 展望
  • 6 参考文献
  • 7 硕士在读期间发表论文情况
  • 8 致谢
  • 附录

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 郭高杰

    导师: 肖冬光

    关键词: 木质纤维素,协同活性,融合蛋白,结构域,蛋白,毕赤酵母

    来源: 天津科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 天津科技大学

    基金: 天津市自然基金

    分类号: Q811.4

    DOI: 10.27359/d.cnki.gtqgu.2019.000403

    总页数: 68

    文件大小: 6516K

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