南充市中心医院
目的：观察京尼平交联羊膜对兔角膜急性碱烧伤的治疗效果为该新型生物材料的临床应用提供动物实验依据。方法：将60只急性角膜碱烧伤大白兔分为三组，每组20只，A组移植普通羊膜，B组移植京尼平交联羊膜，C组为对照组。结果：京尼平交联羊膜与普通羊膜脱落时间差异有统计学意义；术后14、28、42天，京尼平交联羊膜组CNV评分及角膜混浊度评分与对照组比差异有统计学意义，术后14d，京尼平交联羊膜组与普通羊膜组角膜浑浊度评分与对照组差异均无统计学意义。结论：治疗角膜化学性碱烧伤，京尼平交联羊膜与普通新鲜羊膜相比在抑制新生血管以及减轻角膜混浊方面效果更显著。
[abstract]Objective：tostudytheeffectofanewbiomaterial-genipincrosslinkedamnioticmembrane（GAM）forcornealalkaliburn.Methods：usecrosslinkedHAMtotreat60cornealalkaliburnnewZealandRabbitschecktheeyesofthecorneaedemaandconjuctivehyperaemiaeveryday.Results：TheaveragetimeofgenipincrosslinkedHAMdissolvedisissignificantdifferencebetweenthedissolvedtimeofG-HAMandAM.thescoreofCNVshowedsignnificentdifferencebetweenG-HAMandcontrolgroup.Conclusion：Comparedwithordinarymembrane，genipin-crosslinkedHAMshowedbettereffectforcornealalkaliburn.
[Keywords]Humanamnioticmembrane；Genipin；crosslink；Ocularsurfacedisease；Tissueengineering
碱烧伤对眼表上皮、角膜、角膜缘干细胞，结膜会产生持续的损伤，最终导致单眼或双眼的视力下降。角对碱烧伤来说，成功的关键在于减轻对角膜缘干细胞和结膜细胞的损害，除此之外，减轻炎症反应，阻止组织进一步的溶解也十分重要[1、2]。基于前期的实验研究，本实验主要研究京尼平交联羊膜对碱烧伤角膜的治疗效果，并探讨其用于眼表重建的可行性。
1材料与方法
1.1材料、试剂与仪器
新鲜人羊膜，京尼平、胰酶、乙二胺四乙酸、新西兰大白兔，戊巴比妥钠，托百士眼膏，手术器械、显微镜。
1.2G-HAM的制备
将新鲜获取羊膜脱上皮细胞并浸入0.5%的京尼平溶液中30min[8]进行交联。
1.3动物实验及分组
60只健康新西兰大白兔，均无眼部病变。以右眼造碱烧伤模型（重度）后随机分成3组，每组20只。所有动物均遵循动物医学伦理规范。A组：烧伤后移植G-HAM。B组：烧伤后移植甘油保存AM。C组：不做任何处理，对照组，仅点眼药水
1.4实验方法
1.4.1手术方法及取材
将G-HAM/AM平整覆盖于角膜表面注意贴合紧密，在角巩膜缘将羊膜与结膜、表层巩膜用10/0尼龙线8针缝合固定。术后第14、28、42d每个时间点观察动物后按分组随机处死5只动物，取角膜行HE染色。
1.4.2实验观察指标及检测标准
术后每日观察结膜充血水肿、分泌物、羊膜脱落溶解等情况，第14、28、42d，将兔全麻后于裂隙灯下观察角膜混浊、新生血管，并对两者进行记录评分。而后处死兔，摘除眼球，剪下角膜，HE染色观察角膜切片。
2.结果
2.1大体观察
术后7-30天，肉眼下三组羊膜移植后眼表修复大体图
2.1.1
羊膜溶解脱落情况
术后4~5天，普通羊膜开始溶解，部分观察眼移植的普通羊膜完全脱落，而京尼平交联羊膜未观察到明显变化。至术后10天，京尼平交联羊膜开始显示溶解征兆，其完全脱落的平均时间为20.00±10.418d，普通羊膜为9.20±10.618d，溶解时间差异有统计学意义（p<0.01）。
2.1.2角膜混浊度评分
术后14天，G-HAM角膜混浊度评分（3.87±0.743）、AM组角膜浑浊度评分（4.01±0.632）与对照组（4.07±0.704）相比差异均无统计学意义（p>0.05），两者之间差异也无统计学意义（p>0.05）；术后28、42天，G-HAM组角膜浑浊度评分分别为：（3.13±0.516）、（2.33±0.724）与对照组的（4.27±0.458）和（4.33±0.816）相比差异有统计学意义（p<0.01）
2.1.3角膜新生血管评分
术后第14、28、42天，G-HAM组角膜新生血管评分均值分别为：（1.731±0.704）、（2.472±0.834）、（1.930±0.704）与对照组相应值：（3.233±0.676）、（3.531±0.641）、（3.601±0.548）相比均有显著差异（P<0.01），AM组角膜新生血管评分均值在术后14、28、42天分别为：（2.801±0.676）、（3.332±0.516）、（3.131±0.603），在42天时差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2组织病理学观察
术后14d，HE染色下见所有标本烧伤区角膜上皮坏死脱落伴炎症浸润。G-HAM组，炎性细胞主要集中在角膜上皮下，基质中也存在，但较少，AM组和对照组于角膜上皮下及基质均可见大量炎性细胞浸润；术后28d，G-HAM组，烧伤区形成2-3层上皮，排列整齐规则，少量炎性细胞浸润。AM组和对照组，烧伤区新生的角膜上皮约1-2层，排列紊乱，角膜上皮及基质仍可见大量炎性细胞浸润，对照组更重；术后42d，G-HAM组，5-7层复层上皮细胞可见，排列整齐，紧服于角膜基质上，基本上不见炎性细胞，胶原组织呈规则。
3.讨论
通常的治疗包括局部或全身应用柠檬酸盐、抗坏血栓盐、激素等；佩戴角膜接触镜或进行大直径角膜移植以及羊膜移植。近年来，研究发现碱烧伤后早期致炎因子可能参与免疫反应，介导免疫损伤[3-6]，因此，根据这个结果推论碱烧伤后早期行羊膜移植可能发生通过调节炎性因子的表达而发挥抗炎和免疫调节作用。
在本实验中，移植京尼平交联羊膜的角膜最后都恢复了一定程度的透明性，新生血管及疤痕程度均比对照组明显减轻，新生成的角膜上皮也比较规则，厚度正常，比较稳定，因此效果是肯定的。本实验结果显示，在羊膜移植后，早期角膜透明性及角膜上皮修复速度上京尼平交联羊膜组、普通羊膜组无显著差异，但在后期京尼平交联羊组对角膜新生血管的抑制优于普通羊膜组。通过本实验我们认为，京尼平交联羊膜由于能较长时间含有活性因子，角膜碱烧伤后移植可以减轻眼表碱烧伤急性期的炎症反应，阻止眼表的进行性溃烂和融解，加速眼表的稳定和修复；在烧伤初期减少炎症细胞浸润，进而减少角膜新生血管的形成，并将其局限在角膜周边部，对于严重的眼表烧伤可以为后续的角膜复明手术打下良好的基础。
参考文献：
[1]DanisJW.Skintransplantationwithareviewof550casesatJohnsHopkinsHospital[J].JohnsHopkinsMedJ，1910，15：307-312
[2]KimJC，TsengSC.Transplantationofpreservedhumanamnionticmembraneforsurfacereconstructioninseverelydamagedrabbitcorneas.Corean，1995，14：473-484
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[6]李莉，陈健.一种新型人工食道用生物材料的制备及其性能研究[J]医疗卫生装备，2008，29（10）：1-3，9