梁望旺[1]2004年在《猪传染性胸膜肺炎ELISA诊断方法的建立及初步应用》文中研究指明胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious pleuropneumonia)的致病菌，该病是一种呼吸道疾病，影响着全世界养猪业的发展。猪感染此病后会呈现从急性的突然死亡到慢性感染及亚临床感染等症状。急性感染可表现为肺的纤维素性、出血性坏死，死亡率高；慢性感染的猪无明显的临床症状但生长缓慢。发病后存活下来的猪可成为病原的携带者，从而可能引起此病的再次爆发。所以，猪群APP血清抗体的检测对预防和控制该病的爆发具有十分重要的意义。 迄今为止，已报道的APP血清型共有15种，不同血清型之间没有或仅有弱的交叉反应，这给该病的诊断和预防带来了很大的困难。传统的血清学诊断方法，如CFT、IHA等，针对的是菌体抗原诱导产生的抗体，只能对同血清型的APP做出检测。免疫预防也存在着同样的问题，APP的灭活苗具有一定的保护力，但是，也只能对同血清型APP的感染产生保护。本研究主要是针对以上情况，旨在建立一种特异、敏感、能对所有血清型APP做出检测的血清学检测方法。 由于胸膜肺炎放线杆菌的毒素和转铁结合蛋白具有种特异性，所以有希望用于APP诊断方法的建立。 将含有猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ基因的质粒pET-ApxⅡ转化到大肠杆菌BL21(DE3)。挑选出表达量最高的克隆子，然后于37℃经IPTG诱导表达。对表达条件进行优化，并对包涵体进行了变性和复性。用复性后的蛋白作抗原，建立了检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。与间接血凝(IHA)检测结果作了比较，证明所建立的ELISA诊断方法具有较高的特异性和敏感性，并具有良好的稳定性和可重复性。利用建立的ApxⅡ-ELISA诊断方法对2503份临床送检的各地猪血清进行检测，测得猪传染性胸膜肺炎的阳性率平均为63％以上。 利用地方分离的APP血清型2型菌株，设计一对引物，用PCR的方法扩增了其转铁结合蛋白A基因(tbpA基因)，扩增片段的大小为2726bp，并克隆到pET-28b中构建了重组表达载体。经酶切鉴定及测序分析后，将此表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，SDS-PAGE和Western blotting结果表明该基因在大肠杆菌BL21中获得了表达。表达的蛋白经纯化后建立了Tbp-ELISA检测方法，并与IHA和ApxⅡ-ELISA进行了比较，表明该方法可用于APP血清抗体的检测。 上述研究为猪传染性胸膜肺炎血清抗体的检测提供了种特异性方法，为预防、控制乃至根除此病奠定了基础。
张志妮[2]2009年在《猪胸膜肺炎放线杆菌感染特异性诊断方法的建立：PCR和夹心ELISA》文中研究说明猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一种高度接触传染的呼吸道疾病,给集约化养猪业造成严重的经济损失,该病以出血性坏死性肺炎和纤维素性胸膜炎为特征,APP有两个生物型,15个血清型。猪传染性胸膜肺炎最急性型引致猪的急性死亡,无临床病症慢性感染猪往往是再次爆发和流行的潜在传染源,感染猪易引发其它病原的继发感染。所以APP感染的早期诊断成为防控该病的关键。APP致病机理非常复杂,有众多毒力因子,Apx(A. pleuropneumoniae-RTX- toxins, Apx)是最重要的毒力因子。其中apxⅣ基因只在活体内表达,体外培养则不表达该毒素,apxⅣ基因存在于所有血清型中且高度保守,具有种特异性。本研究致力于提高、完善APP感染的诊断技术,建立PCR诊断方法并开发研制夹心ELISA试剂盒。1、建立APP生物Ⅰ型的PCR诊断方法PCR是一种快速的病原学诊断方法,本研究据已发表的apxⅣ毒素基因序列(登录号:CS056137,位置:1543~2418)设计一对特异性引物,建立检测APP 1~12血清型的PCR方法。血清型1~12标准菌株和5株野毒株均能扩增出预期876bp片段,而副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、猪放线杆菌、猪霍乱沙门氏菌、奇异变形杆菌、支气管败血波氏菌、猪丹毒杆菌PCR扩增结果为阴性。可检出最低活菌数为2×102cfu/mL,最低检出DNA浓度为9pg。2、重组蛋白rApxⅣ的表达参照GenBank中已发表的apxⅣ序列(登录号:CS056137)设计一对特异性引物,扩增血清1型标准菌株apxⅣ基因963bp片段(位置:2518~3480),PCR产物经NdeI、NotI酶切处理后克隆到同样处理的质粒pET-22b(+)中,酶切鉴定和序列分析后将此重组质粒转化E. coli BL 21(DE3),0.1 mM IPTG诱导4h获得高效表达的重组蛋白His-ApxⅣ,SDS-PAGE、Western blot检测证实rApxⅣ分子量为35.3 KDa,以可溶状态存在,含His·Tag。融合蛋白经Novagen公司的固定化镍离子亲和层析试剂盒进一步纯化。3、单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立按常规方法制备单克隆抗体。以纯化的重组蛋白rApxⅣ免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以rApxⅣ和表达宿主菌的菌体蛋白为检测抗原,进行杂交瘤细胞的筛选,叁次亚克隆后挑选两株分泌稳定、为IgG的杂交瘤细胞:5B7、5C11,竞争性结合试验证明它们有不同的抗原结合表位。这两株单抗制得腹水的ELISA滴度分别为1:6.4×104,1:1.28×105,以(NH4)2SO4盐析法纯化单抗。纯化的5B7用标准生物素方法进行标记并测得标记效价为106。建立检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA方法,方阵滴定法确定捕获抗体最佳工作浓度为4μg/mL,Biotin-5B7最佳工作浓度为0.8μg/mL,rApxⅣ最低检出量为60pg/mL。将建立的PCR和双抗体夹心ELISA分别检测10份猪病变肺组织和血清样品,阳性6份,与细菌分离鉴定结果一致,叁种鉴定方法结果相符合。表明本研究建立的PCR和双抗体夹心ELISA方法都可用于APP感染的临床诊断。
陈砚[3]2008年在《胸膜肺炎放线杆菌血清7型apxⅡC~-/apxIA~+与TonB2-ELISA诊断方法的研究》文中研究表明猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)引起的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给当前世界养猪业造成了严重的经济损失。预防和控制该病的主要措施是疫苗免疫接种。目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌引起的临床症状并降低死亡率,但不能降低发病率、慢性感染和阻止肺部病变,对异源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保护。可以说,采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择,迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。与灭活疫苗和亚单位疫苗不同,APP的自然感染或试验感染能够诱导抗多种异源血清型的保护。而且弱毒活疫苗与传统疫苗相比有能够重复提呈抗原和持续性刺激免疫应答的优点。因此通过缺失毒力因子构建弱毒活疫苗已成为国内外疫苗研究的热点。由本实验室贝为成博士以本室分离鉴定的APP HB株血清7型菌为亲本株构建的胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株HBC~-/GFP~+,经免疫的Balb/C小鼠和仔猪能够抵抗APP同源血清型(7型)的攻击,对同血清7型APP的攻击保护率为100%,但对异源血清1型的攻击保护率只有75%。为了进一步提高HBC~-/GFP~+突变株对异源血清菌株的免疫效力,论文设想以该基因缺失菌株为载体表达apxⅠA基因,构建新的基因工程重组菌株。敏感、特异的诊断方法将有利于猪传染性胸膜肺炎的预防和控制。目前我国普遍应用的诊断方法为间接血凝试验(HIA),该方法具有血清型特异性,不适合于对APP进行普查。补体结合试验(CFT)特异性高,但敏感性低,而且有时产生假阳性结果,加上操作复杂,只适合于实验室应用,难以进行田间推广。乳胶凝集试验(LAT)是一种简便快速的检测方法,在应用过程中也出现了不同血清型之间的交叉反应。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法操作简便,结果易于判定,已成为广泛应用。TonB系统在胸膜肺炎放线杆菌在活体内铁的摄取具有重要作用,至今已有2种TonB系统在APP中报道,即TonB1和TonB2。而TonB2蛋白在APP所有血清型菌株感染过程中都能获得表达,且具有种特异性。因此,适合用于建立可以普查APP的诊断方法。鉴于上述背景,本研究我们开展了以下工作:1.apxⅠA基因的克隆及重组胸膜肺炎放线杆菌菌株apxⅡC~-/apxⅠA~+的筛选和鉴定依据GenBank中公布的apxⅠA基因序列(D16582),以APP血清1型基因组DNA为模板,设计特异性引物,采用PCR扩增3069bp apxⅠA基因序列,序列测定证实无误后连接到穿梭载体pJFF_NX中,获得重组穿梭质粒pJFF-IA。采用电转化将重组穿梭质粒DJFF-IA转化基因工程突变株HBC~-/GFP~+。首先在含氯霉素(1μg/ml)的TSA抗性平板上筛选过夜培养,然后经PCR鉴定到阳性克隆子,命名为apxⅡC~-/apxⅠA~+。通过生长试验和遗传稳定性试验对重组菌株的一些生物学特性进行了研究。2.ApxⅠA基因在基因工程突变株HBC~-/GFP~+中表达特性研究胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因编码ApxⅠ外毒素的结构蛋白。在TSB培养基中加入适宜的辅酶Ⅰ(NAD)以及钙离子后,培养重组菌过夜,离心后取上清,利用饱和硫酸铵沉淀法沉淀上清液,用PBS重悬沉淀,透析3天后进行鉴定,SDS-PAGE和Western-blot结果表明:ApxⅠA蛋白在基因工程突变株HBC~-/GFP~+中获得稳定表达。3.重组胸膜肺炎放线杆菌菌株apxⅡC~-/apxⅠA~+对仔猪的免疫效力研究为了评价基因工程重组菌株apxⅡC~-/apxⅠA~+对仔猪的免疫效力,将基因工程重组菌株apxⅡC~-/apxⅠA~+(活菌含量1×10~8CFU)通过气管和肌肉注射两种途径,间隔两周,免疫仔猪两次,同时设TSB为对照。用ApxⅠ-ELISA、ApxⅡ-ELISA检测毒素ApxⅠ、ApxⅡ抗体,第二次免疫2周后,连同TSB对照,用APP血清1型(活菌含量1×10~8CFU)通过滴鼻对免疫仔猪进行攻毒。结果表明:气管注射途径免疫基因工程重组菌株apxⅡC~-/apxⅠA~+的仔猪对APP血清1型菌攻击的保护率为100%(5/5),肌肉注射途径免疫的基因工程重组菌株apxⅡC~-/apxⅠA~+仔猪对APP血清1型菌的保护率为80%(4/5),基因工程重组菌株apxⅡC~-/apxⅠA~+免疫仔猪攻毒后没有表现出明显的临床症状,剖检肺部病变不明显;TSB对照组临床症状明显,剖检肺部严重出血。抗体检测和攻毒结果显示出基因工程重组菌株apxⅡC~-/apxⅠA~+免疫仔猪对于强毒APP1的感染后保护效果较亲本菌株HBC~-/GFP~+(75%)有显着提高,能显着降低临床发病,减轻肺部病变,有望研制成弱毒疫苗用于猪传染性胸膜肺炎的免疫预防。4.tonB2基因的克隆与及其在大肠杆菌中的表达根据GenBank上发表的猪胸膜肺炎放线杆菌tonB2基因序列(AY428647),设计并合成引物,通过PCR扩增tonB2基因全长858bp。将其克隆到原核表达载体pGEX-KG上,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,通过对表达条件的优化,TonB2蛋白以包涵体形式获得高效表达,经过Western blotting检测证明该表达产物具有良好的抗原性。5.TonB2-ELISA诊断方法的建立及初步应用以纯化后的表达产物作为诊断抗原包被酶标板,通过间接ELISA方阵滴定确定了抗原最佳包被浓度为1:160(4.03μg/mL)和最佳血清稀释倍数1:40。对338份临床送检血清及APP生物Ⅰ型12个标准阳性血清进行检测,同时与APP间接血凝检测试剂盒平行检测对比,阳性符合率为92.8%,阴性符合率为84.2%。该方法的初步应用结果表明,建立的TonB2-ELISA检测方法不仅具有很好的敏感性和特异性,而且可检测APP所有生物Ⅰ型血清型的感染,适合用于基层猪场APP普查。
贾凡[4]2007年在《胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及ELISA试剂盒的研制与应用》文中研究说明胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae，APP)是引起猪传染性胸膜肺炎(poreine contagious pleuropneumonia，PCP)的病原。给世界养猪业带来严重经济损失。目前，共有15个血清型，该病原菌的主要毒力因子包括CPS、LPS、OMP、TBP、粘附因子、内毒素、尿素酶等。Apx毒素是APP最主要的毒力因子，现证明不同血清型的菌株可产生4种Apx，ApxⅡ除血清型10和14以外，其它血清型都分泌；任何血清型都能在体内分泌毒素蛋白ApxⅣ，但体外培养的细菌却不能分泌该毒素。本研究包括如下叁方面的内容：1．胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定将病料接种培养基，经过24小时的培养后将细菌进行纯化，挑单菌落革兰氏染色、镜检，将细菌接种到细菌鉴定微量反应管，同时以细菌制备模板，做apxⅣ-PCR，然后经过琼脂扩散试验确定血清型。结果从患病猪的肺、关节分离到胸膜肺炎放线杆菌6株，其中，4株4型，1株3型，1株未定型。2．胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ-ELISA抗体检测试剂盒的研制及其应用根据ApxⅡ的特点，实验室已经建立了一种能够监测疫苗免疫后的抗体水平和对疫苗免疫效果进行评估的血清学方法ApxⅡ-ELISA；本研究将该诊断方法进一步研制成试剂盒，对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行了测试，与间接血凝试验试剂盒进行了对比研究，并用该试剂盒检测了来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清1453份，同时也制作了ApxⅡ的抗体削长规律曲线结果表明ApxⅡ-ELISA试剂盒具有很高的特异性和敏感性；叁批试剂盒的批内和批间的重复性良好(变异系数均＜15％)；试剂盒在2～8℃保存9个月内稳定性良好；检测来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清的阳性率分别为49.56％、85.51％、1.92％、73.33％、1.85％和100％。从ApxⅡ抗体消长规律的曲线可以看出，疫苗免疫后3周或者4周就可以监测到ApxⅡ抗体，抗体水平达到峰值时，其值为1∶1280。ApxⅡ-ELISA试剂盒能够有效的诊断猪传染性胸膜肺炎，同时也可作为一种评价猪群免疫后免疫效果的有效方法；3．胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA抗体检测试剂盒的研制及其应用根据ApxⅣ的特点，实验室已经建立了一种能够特异性的诊断猪传染性胸膜肺炎，并且能够有效的区分感染猪与免疫猪的鉴别诊断方法ApxⅣ-ELISA。本研究将该诊断方法进一步研制成试剂盒，对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行了测试，与间接血凝试验及IDEXX公司的CHEKIT-APP-APXⅣ试剂盒进行了对比研究，并用该试剂盒检测了来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清1453份，同时也制作了ApxⅣ的抗体削长规律曲线。结果表明ApxⅣ-ELISA试剂盒具有很高的特异性和敏感性，与CHEKIT-APP-APXⅣ试剂盒的检测符合率为91.37％；叁批试剂盒的批内和批间的重复性良好(变异系数均＜15％)；试剂盒在2～8℃保存9个月内稳定性良好；App感染后3周或者4周就可以监测到ApxⅣ抗体，抗体水平达到峰值时，其值为1∶640。检测来自中国、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的临床猪血清的阳性率分别为22.30％、39.72％、0.64％、42.22％、1.85％和93.94％。ApxⅣ-ELISA试剂盒能够有效区分APP感染猪与叁价灭活疫苗或亚单位疫苗免疫猪。目前，胸膜肺炎放线杆菌比较难以分离，其原因有待进一步研究。本研究分离出6株APP地方分离株，对我国猪传染性胸膜肺炎的病原学与流行病学研究积累了一定的菌株资源。同时，对ApxⅡ-ELISA和ApxⅣ-ELISA两种抗体检测试剂盒进行了产业化研究，其中ApxⅣ-ELISA达到临床应用水平，对猪传染性胸膜肺炎的诊断与防控具有十分重要的意义。
刘军发[5]2005年在《胸膜肺炎放线杆菌PCR定向突变系统的初步建立及胸膜肺炎放线杆菌OmlA-ELISA检测方法的建立》文中进行了进一步梳理猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。 该病由Pattison等于1957年首次报道，目前流行于世界各地。胸膜肺炎放线杆菌目前已经划分了15个血清型，利用本地主要流行的血清型免疫接种是预防和控制该病的主要措施，目前我国用于预防猪传染性胸膜肺炎的主要疫苗是灭活疫苗，对全国各地的流行情况进行调查，分离各地优势流行胸膜肺炎放线杆菌血清型，有助于有效的控制该病在我国的流行和爆发；但这种由优势血清型制备的灭活疫苗对于同种血清型的感染可降低死亡率，但不能降低发病率，不能阻止肺部病变和慢性感染，更不能对异型菌的感染提供有效的交叉保护，这就迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。 要研制有效的新型疫苗，就必须对该菌的致病机理进行研究，着就需要有效的研究工具，能够高效精确的对胸膜肺炎放线杆菌的致病机理进行研究，能够成功的克服胸膜肺炎放线杆菌比较强的修饰限制系统，从而为弱毒菌及其它新型疫苗的的研制打下坚实的基础。 胸膜肺炎放线杆菌目前发现的毒素共有四种，分别是毒素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和毒素Ⅳ，毒素毒素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的结构及功能已经基本上研究的比较清晰，但毒素Ⅳ的功能还没有完全研究清楚，特别是毒素Ⅳ的激活基因、作用方式、结构组成都还不是非常清晰。所以非常有必要对其功能进行更为彻底的研究。 鉴于上述背景，本研究从临床上分离了胸膜肺炎放线杆菌XT0404株，通过动物回归试验复制了猪的传染性胸膜肺炎；由于临床了检测的阳性率很高而细菌的分离率却很低，为了研究其原因，研究了链球菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌、变形杆菌和大肠杆菌对胸膜肺炎放线杆菌血清学检测的干扰；为提高检测的准确度，建立了基于融合表达的外膜脂蛋白上的ELISA检测方法；同时改进了链霉菌中的PCR定向突变系统，并将改进后的PCR定向突变系统应用的到胸膜肺炎放线杆菌中来失活毒素Ⅳ的ORF1，主要研究内容包括： 1．XT0404株的分离鉴定及动物回归试验 利用TSA培养基，从湖南湘潭一猪场的病料上分离出了胸膜肺炎放线杆菌，经鉴定为血清型2，命名为XT0404，研究了该菌的药物敏感性及小白鼠的半数致死量；还利用该菌人工感染胸膜肺炎放线杆菌抗体阴性的猪，复制出了典型的传染性胸膜肺炎，观测了发病猪的临床症状，制备了病理切片及电镜切片来观测其病理变化；对耐过胸膜肺炎放线杆菌XT0404株感染的猪又进行了其它血清型的人工感染试验。 2．PCR定向突变系统在胸膜肺炎放线杆菌中的建立 PCR定向突变系统是一个比较新的突变系统，主要是利用了PCR引物两端的缺
朱岩昆[6]2013年在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析》文中研究说明猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）引起猪的一种高度传染性呼吸道疾病，又称为猪接触性传染性胸膜肺炎。该致病菌引起的主要病症为肺出血、坏死和纤维素性渗出等。该病于1957年首次报道，自报道以来该病已在世界范围内广泛流行，并给许多国家的养猪产业造成了严重的经济损失。针对该病治疗的越早，经济损失也越少的特点，建立一种快速、灵敏、高效的诊断方法已成为新的研究热点。本研究根据胸膜肺炎放线杆菌表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA分别设计一对引物，可以特异性扩增出637bp和431bp的目的片段。运用多重PCR技术，建立一种检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。结果显示，已知的胸膜肺炎放线杆菌血清1型、3型、5a型、8型、10型均能扩增出特异性的目的片段。特异性检验时，血清型5a能扩增出目的片段，而其他对照细菌均未扩增出相应的目的片段；根据该多重PCR方法对临床分离的通过生理生化分析鉴定的5株疑似猪胸膜肺炎放线杆菌进行了分子鉴定，其中有4株鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌。以血清5a型作为待检菌进行灵敏性验证时，发现最低检出菌量为50个。表明通过表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA建立的多重PCR方法灵敏度高，特异性强。该PCR方法的建立，为猪传染性胸膜肺炎的诊断提供了一种快捷高效的方法。为了指导临床用药，筛选出合适的临床药物，对以前分离的通过生理生化分析等鉴定和本次多重PCR确认的App进行了药敏试验和最小抑菌浓度（Minimum InhibitoryConcentration, MIC）试验，确认的4株App仅对10种临床常用药物中的头孢噻呋、阿米卡星、左旋氧氟沙星敏感，其它7种药物不敏感。对敏感药物进行MIC分析发现，左旋氧氟沙星对xx-1、xx-2、xx-3、xx-5四株菌株的MIC值分别为6.25/2~2、6.25/2~1、6.25/2~3、6.25/2~3，阿米卡星的MIC值分别为6.25/2~2、6.25/2~1、6.25/2~2、6.25/2~3，头孢噻呋的MIC值分别为37.5/2~2、37.5/2~2、37.5/2~3、37.5/2~4。通过药敏试验和最小抑菌浓度试验给临床用药及防治提供参考。App的毒力因子主要包括外毒素（Apx）、荚膜多糖（CPS）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）、转铁结合蛋白（TBp）等，近年的研究热点主要集中在外毒素，所以本研究克隆并构建了pMD-ApxⅠA、pMD-ApxⅡA、pMD-OmpD15载体，为序列分析及其后续研究奠定基础。ApxⅠA和ApxⅡA蛋白结构分析发现，ApxⅠA毒素蛋白α螺旋存在于16~47aa，251~269aa，344~358aa，530~546aa，β折叠分布较均匀，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为1~185aa，407~979aa；ApxⅡA毒素蛋白α螺旋存在于70~90aa，172~190aa，248~275aa，207~431aa，446~469aa，812~834aa，β折叠除在361~406aa有较大折迭外其他折迭较小，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为418~918aa。毒力因子Omp D15（Omp D15）是App一个重要的的表面抗原蛋白，蛋白结构分析表明其存在的抗原表位比较多，具有一定免疫原性，适合作为抗原抗体检测的重要靶标。因此本文以构建的pMD-D15载体为基础，构建了pET32a-OmpD15表达载体并在Rostta细胞中得到了表达，重组蛋白以包涵体的形式存在，通过梯度透析法获得纯化的重组蛋白。用初步纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠获得抗血清，以破碎的App作为抗原用ELISA方法检测抗血清，结果显示抗OmpD15血清能识别App，且3号免疫小鼠效价最高；Western-blot分析发现该重组蛋白可与抗App血清型5a血清中的抗体发生特异性反应，结果表明本实验所获得的D15重组蛋白具有良好的抗原性。用最小致死量App攻毒Balb/c小鼠，以D15重组蛋白作为抗原，ELISA方法监测小鼠体内抗体水平变化，发现攻毒后第叁天即可在小鼠体内检测到OmpD15抗体的存在。通过OmpD15的原核表达、纯化及抗原性分析等的研究，为以表面抗原蛋白OmpD15开发亚单位疫苗、建立猪胸膜肺炎的ELISA诊断方法提供了理论基础及实验依据。
保雨[7]2016年在《猪呼吸道疾病综合征六种病原基因芯片检测方法的建立》文中认为猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)是由病毒、细菌、支原体、寄生虫及环境应激等多种因素引起,以呼吸困难、咳嗽、发热、生长迟缓等为临床特征的一类猪常见疾病。病原学分析发现,引起PRDC的主要病原包括猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)等,其中APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV六种病原在我国较为常见,规模化养猪中多病原的混合感染或继发感染大大增加了临床诊断的难度。目前,对APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV和CSFV六种病原的检测多进行单一病原的分离培养、血清学检测、PCR扩增等,缺少可同步鉴别检测六种病原的方法。因此,建立一种可同时检测PRDC六种重要病原的方法,节省成本,提高检测效率,对猪病的流行病学调查、疫病监控、进出境检疫等具有重要意义。本研究以APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV作为研究对象,建立了可同步鉴别检测六种病原的基因芯片,该方法具有较好的特异性和稳定性。其主要研究内容及结果如下:1.引物和探针的设计根据GenBank中登录的APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV的基因序列,使用生物学软件Mega5、Primer Premier 5.0和Oligo 6.0进行分析比对、设计6对特异性引物和多条探针。对六种病原核酸进行PCR扩增,构建T-克隆载体,基于电泳检测和测序比对结果筛选阳性质粒。2.探针筛选和单一病原基因芯片检测方法的建立参考GeXP的标记方法,对靶序列进行Cy3荧光标记,与固定于醛基基片表面的探针进行避光杂交,扫描杂交结果,筛选特异性高且荧光信号强的探针。在探针筛选的基础上,进行退火温度、外循环次数、杂交探针浓度、杂交液、杂交温度和杂交时间的优化,确定退火温度为56~58℃和外循环25~30次进行扩增,PCR产物与自配杂交液混合,42℃避光杂交3h。对单一病原基因芯片检测方法的特异性、敏感性、稳定性进行评估,结果显示:该方法具有较好的特异性和稳定性,其中敏感性分别为APP 2.97×102拷贝/μL、HPS 4.38×103拷贝/μL、Mhp 8.26×102拷贝/μL、PCV-2 3.78×102拷贝/μL、PRRSV 1.38×103拷贝/μL、CSFV 3.32×10拷贝/μL。该方法的检测敏感性与普通PCR扩增相比高10~100倍。3.六种病原基因芯片单管同步检测方法的建立和初步应用在单一病原基因芯片检测方法的基础上,通过正交试验优化六种病原特异性嵌合引物的浓度,初步建立六种病原同步检测的基因芯片方法。优化杂交温度和时间,进行方法评估。特异性试验:对伪狂犬病病毒、猪细小病毒、日本乙型脑炎病毒、猪水疱病病毒、水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒和沙门氏菌的核酸进行扩增杂交,验证构建芯片的特异性。结果显示,该方法与上述病原均无交叉反应。敏感性试验:将六种病原的阳性质粒进行混合后倍比稀释,以其为模板进行敏感性试验。结果显示:APP 5.8×102拷贝/μL、HPS 7.8×103拷贝/μL、Mhp 6.8×103拷贝/μL、PCV-2 6.3×102拷贝/μL、PRRSV 4.8×103拷贝/μL、CSFV 5.5×102拷贝/μL。因此,综合考虑六种病原的检出限,多病原单管同步检测基因芯片的敏感性为103拷贝/μL。重复性试验:选取同一批次制备的6张基片和不同批次制备的6张基片,进行组内和组间重复性试验。结果显示:组内组间试验均具有较高的可重复性。保存期试验:本试验进行了为期4个月的保存期试验,确定芯片的最优保存条件。结果显示:该方法制备的芯片至少可在-20℃条件下保存4个月。临床初步应用:对重庆地区采集的186份样品分别使用本研究建立方法与现行标准方法进行对比分析,结果显示:基因芯片方法检出单一病原感染34份,多病原混合感染11份;现行标准方法检出单一病原感染28份,多病原混合感染13份。将两种方法检出的阳性样品进行测序分析,测序结果与基因芯片方法检出结果一致,说明基因芯片方法可用于多种病原的临床鉴别检测。本研究建立了一种可同步鉴别检测APP、HPS、Mhp、PCV-2、PRRSV及CSFV六种重要病原的基因芯片方法,为基因芯片在动物疫病中的研究和应用提供理论基础,也为PRDC病原的鉴别检测提供技术支撑。
葛行义[8]2008年在《胸膜肺炎放线杆菌TbpB-ELISA的建立及zmp和arcA/arcB基因的初步研究》文中提出胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)的病原菌,引起猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成严重的经济损失。该病原菌的毒力因子主要包括外毒素、脂多糖、荚膜多糖、外膜蛋白、蛋白酶等。转铁结合蛋白(Tbp)是APP重要的膜蛋白,为所有血清型所共有,用于铁离子的获取。zmp基因编码的金属蛋白酶可在宿主体内表达,预测是APP重要的毒力因子,与APP在宿主呼吸道上皮细胞的吸附定殖过程中起重要作用。ArcA-ArcB二元调控系统参与APP厌氧呼吸相关基因的表达调控,可能对APP的代谢和毒力有重要的影响。本研究主要包括以下叁个方面内容:1.胸膜肺炎放线杆菌tbpB基因的克隆表达与间接ELISA方法的建立转铁结合蛋白(TbpA和TbpB)是胸膜肺炎放线杆菌重要的膜蛋白,其中TbpB位于细菌表面,在APP的致病性和免疫反应中起着重要的作用。本试验用PCR方法克隆了APP血清1型菌的tbpB基因的编码区(1,644bp),在大肠杆菌中进行了高效表达。用纯化的表达产物建立了ELISA检测方法,对其特异性、敏感性进行了测试,与间接血凝试验试剂盒进行了对比研究,并用该方法检测了临床血清980份。结果表明TbpB-ELISA方法有较好的敏感性,但特异性较差,检测的临床血清的阳性率为53.57%,所检测的阳性率尽管不能完全反映猪传染性胸膜肺炎的流行情况,但在一定程度上可以对猪传染性胸膜肺炎的流行情况提供参考。2.胸膜肺炎放线杆菌金属蛋白酶(zmp)基因的研究根据已知的APP血清1型的zmp基因序列,用PCR方法克隆了其全长编码序列(2,610bp),在大肠杆菌中获得了高效表达;用特异蛋白底物检测了重组蛋白的蛋白酶活性;先后尝试了叁种zmp基因缺失突变体构建方法,最终成功构建了APP血清1型zmp基因部分缺失突变株,并对突变株的生长特性进行了研究,对突变株与亲本株的毒力作了比较。结果表明重组蛋白在酪蛋白等特定底物存在时表现出相应的蛋白酶活性;zmp基因部分缺失突变株与亲本株的体外生长特性未见明显差异,提示zmp基因对APP体外生长影响不大;毒力比较表明zmp基因部分缺失突变株比亲本株的毒力有15-20倍下降,提示zmp基因对APP毒力有一定影响。3.胸膜肺炎防线杆菌ArcA-ArcB二元调控系统的研究根据已公布的APP基因组序列,通过与大肠杆菌等细菌基因组的比较,找出了APP基因组中存在的五组二元调控系统,并选择了厌氧呼吸控制系统ArcA-ArcB系统进行了研究。主要目的是构建单基因和双基因缺失突变株,并利用基因芯片的方法研究ArcA-ArcB系统所调控的基因,进而探讨其对厌氧呼吸条件下对APP与宿主相互作用的影响。在本论文中主要完成了前期分析工作,并构建了相应的同源重组缺失突变体载体,为后续研究作了准备。
刘亚娟[9]2016年在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌DNAH和LAMP检测方法的建立》文中研究指明猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)、沙门氏菌(Salmonella,Sal)叁种病原菌均能引起猪的重大传染性疾病,分别是猪呼吸道疾病综合征常见的原发性病原和继发性病原,引发的相关疾病具有高发病率和死亡率,给世界各地的养猪业造成严重的经济损失。早期诊断对疾病的防治非常关键,目前,针对上述叁种细菌的检测方法主要以传统检测方法为主,兼有PCR方法、基因芯片方法等,但都存在一定的不足,如检测周期长、敏感性较低等,无法满足大批量样品快速准确检测。因此,迫切需要建立高通量、简便快速、特异强、敏感性高、稳定性好的检测方法。本研究分别运用夹心DNA杂交技术(Sandwich DNA hybridization assay,DNAH)和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification assays,LAMP),针对上述叁种病原菌,各自建立了DNAH和LAMP两种快速检测方法,为APP、HPS、Sal病原菌的疫病早期诊断与治疗、疫情监控、流行病学调查等提供有效的技术保障,以减少传染病对养猪业的危害,促进养猪业健康稳定的发展。同时,作为一种新型的检测技术储备研究更具有重要的前瞻意义。本研究的试验方法和结果如下:1、参照Gen Bank中登录的不同血清型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的Apx IVA基因序列,副猪嗜血杆菌的16S r RNA基因序列以及沙门氏菌的inv A基因序列,通过MEGA5.0软件对序列进行比对与分析,利用primer 5软件进行夹心DNA杂交技术一条捕获探针和一条检测探针的设计,利用在线生物软件Primer Explorer V4进行环介导等温扩增技术6条引物的设计。将设计的叁种病原菌各自的探针和引物在NCBI上进行Blast比对,特异性均较高。2、通过对叁种病原菌进行探针浓度、核酸杂交液探针液配比以及杂交时间和杂交温度的优化,分别建立了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌的夹心DNA杂交检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性和稳定性试验。结果显示:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的夹心DNA杂交检测方法仅与目标病原菌有特异性的杂交反应,与其它相关病原菌均无特异性杂交;该方法的最低检测限为0.46 CFU/m L;不同样品重复测定的OD450值变异系数CVi在8.30%~10.29%之间,不同样品用不同批次的96孔板所测的OD450值变异系数CVo在16.78%~20.07%之间,具有良好的精确度。副猪嗜血杆菌的夹心DNA杂交检测方法具有良好的特异性,仅与目标病原菌发生特异性杂交,而与其它相关病原菌均无杂交反应,该方法的最低检测限为0.31 CFU/m L,批内变异系数CVi在10.97%~16.22%之间,批间变异系数CVo在18.32%~22.50%之间。沙门氏菌的夹心DNA杂交检测方法仅与叁种不同血清型的沙门氏菌发生特异性的杂交反应,而与其它相关病原菌均无特异性杂交反应,该方法的最低检出限为1.2 CFU/m L,批内变异系数CVi在16.53%~17.97%之间,批间变异系数CVo在16.33%~22.10%之间。3、通过对叁种病原菌进行反应温度、内引物浓度以及环引物浓度的优化,分别建立了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌的环介导等温扩增方法,并进行了相应的特异性、敏感性、重复性和稳定性试验。结果显示:猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的环介导等温扩增方法只对该细菌的DNA有特异性扩增,对其它相关病原均无特异性的扩增,最低检测限为0.307 fg/μL,具有良好的批内重复性和批间稳定性,变异系数CV分别为0.67%和2.21%;副猪嗜血杆菌的环介导等温扩增方法只对其目标菌DNA有特异性扩增,对其余病原菌无特异性扩增,最低检测限为0.175 fg/μL,批内重复性试验和批间稳定性试验的变异系数CV分别为0.76%和3.84%;沙门氏菌的环介导等温扩增方法只对叁种不同血清型的沙门氏菌DNA有特异性扩增,对其余病原体均无特异性扩增反应,检测敏感性为0.810 fg/μL,批内重复性试验和批间稳定性试验的变异系数CV分别为1.47%和2.45%。4、用本研究建立的两种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌快速检测方法与SN/T 1447-2011标准中猪传染性胸膜肺炎套式PCR检测方法,同时对204份临床疑似猪传染性胸膜肺炎发病猪的肺脏样品进行对比分析,结果显示:叁种方法对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检出率均为4.9%,符合率为100%,本研究建立的两种方法与标准公布的套式PCR方法相比,其检测时间大幅缩短。用本研究建立的两种副猪嗜血杆菌快速检测方法与NY/T 2417-2013标准公布的方法,同时对195份临床疑似感染副猪嗜血杆菌的病猪鼻拭子进行检测,结果显示:本研究建立的两种方法检测出的副猪嗜血杆菌阳性率均为4.62%,标准公布的PCR方法检出阳性率为3.08%,其阳性样品的检出低于本研究建立的两种方法,且检测时间也明显较长。用本研究建立的两种沙门氏菌快速检测方法与SN/T 1869-2007标准公布的沙门氏菌检测方法,同时对371份临床疑似感染沙门氏菌病猪肉样品进行检测分析,结果显示:本研究建立的两种方法检出沙门氏菌的阳性率均为6.2%,标准公布的沙门氏菌PCR方法检出阳性率为5.7%,表明DNAH和LAMP检测方法对沙门氏菌的阳性检出率比PCR方法高,且耗时比PCR方法短。综上所述,本研究分别针对叁种常见猪传染性疾病相关病原菌建立的两种快速检测方法,均有较高的特异性、敏感性和稳定性,并在较短时间内(DNAH和LAMP方法分别在1.5 h和1 h内完成检测)实现对单个病原菌感染的样品进行快速准确的鉴别。
刘建杰[10]2004年在《猪传染性胸膜肺炎新型基因工程类毒素菌苗的研究》文中提出猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养殖业造成了巨大的经济损失。该病急性以肺部广泛出血为特征，慢性以肺部局灶性坏死和胸膜炎由为特征。由Pattison等于1957年首次报道，目前遍及世界各地。免疫接种是预防和控制该病的主要措施，目前我国用于预防PCP的主要疫苗是灭活疫苗。这种灭活疫苗对于同种血清型的感染可降低死亡率，但不能降低发病率和慢性感染，不能阻止肿部病变，更不能对异型菌提供交叉保护，临床上迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。通过对胸膜肺炎放线杆菌毒力因子的研究，证实分泌毒素为其最重要的毒力因子，同时也是其最重要的免疫原性因子，加有类毒素的灭活疫苗保护力大为提高。鉴于此，本研究开展了APP类毒素菌苗的研究，旨在提高灭活疫苗的保护效力。主要研究内容包括： 1．APP7型菌生长曲线的测定 通过对比国内外培养胸膜肺炎放线杆菌常用的叁种培养基，发现胰蛋白酶大豆汤(TSB)最有利于APP的培养。利用浊度测定和细菌计数对APP 7型菌在TSB中的生长周期进行测定，发现其在7h～10h进入稳定期，世代间隔约为30min。而且，APP 7型菌在TSB中的生长具有明显的对数生长期(1h-4h)，在对数生长期其浊度和活菌量具有对应关系，可用于APP的攻毒试验。 2．Apx Ⅰ结构基因在大肠杆菌中的高效表达 根据Apx Ⅰ的结构特点，我们构建了原核表达Apx Ⅰ的质粒pET-Ⅰ CA和pET-Ⅰ A，在IPTG诱导下两种质粒均获得高效表达，表达的融合蛋白分子量均为110kDa，主要以包涵体形式存在。其中质粒pET-Ⅰ CA表达的Apx Ⅰ具有很好的溶血活性，Western blot检测证实表达产物具有良好的反应原性。 3．Apx Ⅰ表达产物免疫原性的研究 将大肠杆菌中表达的包涵体进行纯化与复性，和等量弗氏不完全佐剂乳化后免疫小鼠，同时免疫的还有天然毒素作和不经过纯化与复性的粗提包涵体。用APP 10型10×LD_(50)进行攻毒的结果显示，经过复性的表达产物和粗提包涵体都具有良好的免疫原性，可以取代天然毒素作为疫苗的添加成分。 4．基因工程类毒素菌苗对小鼠的保护效力研究 利用Apx Ⅰ、Apx Ⅱ和Apx Ⅲ的表达产物和我国最为流行的7型菌，和等量弗氏不完全佐剂乳化后制成类毒素菌苗免疫小鼠。利用天然毒素建立叁种毒素的ELISA检测方法，对小鼠抗体的检测发现，二次免疫后叁种毒素的抗体效价均显着升高。用5×LD_(50)的1型菌和7型菌进行攻毒，免疫小鼠对1型菌的保护力为83.3华中农业大学博士学位论文%(10/l2)，对7型菌的保护力为91.7%(11/12)。小鼠攻毒结果初步显示类毒素菌苗对于同型菌和异型菌都有很好的的保护效果，显示了良好的应用前景。5.类毒素菌苗对仔猪的效力研究 利用Apxl、ApxH和Apxln的表达产物和我国最为流行的7型菌，混合后和油佐剂乳化制成类毒素菌苗，间隔叁周两次免疫断奶仔猪，同时设叁价细菌灭活苗组和空白对照组。利用EUSA检测叁种毒素的抗体，利用间接血凝检测7型菌抗体。二次免疫两周后用3.2xl夕cFu的APPI型进行气管攻毒。类毒素菌苗组具有较高的毒素抗体和间接血凝抗体，但叁价细菌灭活苗只有间接血凝抗体。类毒素菌苗组攻毒后基本没有表现出临床症状，剖检肺部病变轻微;叁价细菌灭活苗组攻毒后体温升高，剖检肺部病变明显;空白对照组临床症状明显，剖检呈现典型的胸膜肺炎病变。抗体检测和攻毒结果显示类毒素菌苗对于强毒APP的感染保护效果优于叁价细菌灭活苗，能显着降低临床发病，减轻肺部病变，可以取代细菌灭活苗用于胸膜肺炎的免疫预防。攻毒结果还显示毒素抗体和保护力呈正相关。
参考文献：
[1]. 猪传染性胸膜肺炎ELISA诊断方法的建立及初步应用[D]. 梁望旺. 华中农业大学. 2004
[2]. 猪胸膜肺炎放线杆菌感染特异性诊断方法的建立：PCR和夹心ELISA[D]. 张志妮. 扬州大学. 2009
[3]. 胸膜肺炎放线杆菌血清7型apxⅡC~-/apxIA~+与TonB2-ELISA诊断方法的研究[D]. 陈砚. 华中农业大学. 2008
[4]. 胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及ELISA试剂盒的研制与应用[D]. 贾凡. 华中农业大学. 2007
[5]. 胸膜肺炎放线杆菌PCR定向突变系统的初步建立及胸膜肺炎放线杆菌OmlA-ELISA检测方法的建立[D]. 刘军发. 华中农业大学. 2005
[6]. 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析[D]. 朱岩昆. 河南师范大学. 2013
[7]. 猪呼吸道疾病综合征六种病原基因芯片检测方法的建立[D]. 保雨. 西南大学. 2016
[8]. 胸膜肺炎放线杆菌TbpB-ELISA的建立及zmp和arcA/arcB基因的初步研究[D]. 葛行义. 华中农业大学. 2008
[9]. 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌DNAH和LAMP检测方法的建立[D]. 刘亚娟. 西南大学. 2016
[10]. 猪传染性胸膜肺炎新型基因工程类毒素菌苗的研究[D]. 刘建杰. 华中农业大学. 2004
标签：畜牧与动物医学论文; 肺炎论文; 特异性论文; 猪传染性胸膜肺炎论文; elisa论文; 血清蛋白论文; 抗原抗体论文; 基因合成论文; 胸膜论文; 肺炎表现论文; 传染病论文; igg抗体论文;