枯草芽孢杆菌中dlt操纵子对多粘菌素E抗性的影响机制研究

论文摘要

多粘菌素作为抗多重耐药革兰氏阴性菌的最后一道防线,现在已经被广泛应用于革兰氏阴性菌的治疗。近年来,越来越多的研究表明,阳离子抗菌肽多粘菌素同样可以作用于革兰氏阳性菌。而随着多粘菌素的应用,革兰氏阳性菌中已经发现了应对这种阳离子抗菌肽的抗性机制。dlt操纵子可通过对革兰氏阳性菌细胞壁的丙酰化,对细胞表面的正电荷进行修饰,从而增加对多粘菌素E的抗性。本文着眼于多粘菌素E和枯草芽孢杆菌的相互作用,对dlt操纵子在多粘菌素E的抗性机制中的作用展开研究。本文选取枯草芽孢杆菌WB800来源的dlt操纵子基因和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pWBUC01,设计XhoⅠ和MluⅠ为双酶切位点,经酶切连接在大肠杆菌BW25113中构建dlt操纵子重组质粒pWOP。随后,通过Spizizen化学转化法,将重组质粒pWOP转入枯草芽孢杆菌SCK6中,成功获得dlt操纵子过表达的枯草芽孢杆菌SCK6-2。通过比较多粘菌素E对枯草芽孢杆菌SCK6/pWBUC01（枯草芽孢杆菌SCK6-1）和枯草芽孢杆菌SCK6-2的MIC值,发现SCK6-2比SCK6-1菌株更耐受多粘菌素E,说明dlt操纵子过表达有助于提高枯草芽孢杆菌对多粘菌素E的耐受性。通过比较SCK6-1和SCK6-2菌株在多粘菌素E处理下的生长曲线及CFU,发现dlt操纵子过表达能提高多粘菌素E处理下枯草芽孢杆菌的存活率。为了进一步研究dlt操纵子过表达提高枯草芽孢杆菌对多粘菌素E耐受性的原因,我们比较了多粘菌素E处理下菌株培养上清液的OD260nm和OD280nm下吸光度及NPN荧光值变化,发现dlt操纵子可减弱多粘菌素E对枯草芽孢杆菌通透性的影响。随后,使用阳离子蛋白质细胞色素c表征dlt操纵子过表达后细胞表面净负电荷的变化,发现dlt操纵子的过表达会降低枯草芽孢杆菌与细胞色素c的结合,表明dlt操纵子的过表达可增加枯草芽孢杆菌表面的正电荷,降低净负电荷量,从而减弱带正电荷的多粘菌素E对细胞的静电结合作用。由于多粘菌素E生产菌多粘类芽孢杆菌不含dlt操纵子,dlt操纵子在多粘类芽孢杆菌中表达有望提高其抗性,从而提高多粘菌素E的产量。为此,本实验考察了枯草芽孢杆菌源dlt操纵子在多粘类芽孢杆菌中的表达及其影响。首先优化了多粘类芽孢杆菌ATCC842和多粘类芽孢杆菌C12的电转化条件,建立了最优的电转化体系。接着,构建了含dltA基因的重组质粒pWDA。然后,在电转化最优体系下,将pWDA和pWOP分别电转化多粘类芽孢杆菌ATCC842,发现pWDA能被成功转化,但效率比较低;而pWOP不能被成功转化至菌株ATCC842。可能的原因是多粘类芽孢杆菌电转化效率本身比较低。另外,dlt操纵子比dltA大的多,这进一步增加了pWOP电转化难度。后续实验中,需要进一步提高电转化效率,另外也可以建立更有效的多粘类芽孢杆菌转化方法。由此,进一步研究dlt操纵子表达为提高多粘类芽孢杆菌对多粘菌素E抗性的可能性及其机制,为今后增加多粘菌素E的发酵产量提供新的思路。

论文目录

摘要

ABSTRACT

符号和缩略符

第一章绪论

1.1 多粘菌素与多粘类芽孢杆菌概述

1.1.1 多粘菌素概述

1.1.2 多粘类芽孢杆菌概述

1.2 多粘菌素对革兰氏阳性菌的杀菌机制

1.2.1 多粘菌素对细胞膜的破坏

1.2.2 多粘菌素对细菌呼吸链的胁迫作用

1.2.3 多粘菌素对Exportal的破坏

1.3 革兰氏阳性菌对多粘菌素的抗性机制

1.3.1 graXSR三组分系统对于多粘菌素的抗性

1.3.2 dlt操纵子介导的对多粘菌素的抗性机制

1.3.3 MprF蛋白介导的对多粘菌素的抗性机制

1.4 枯草芽孢杆菌SCK6 概述

1.5 选题意义、研究内容及技术路线

1.5.1 选题意义

1.5.2 研究内容及技术路线

参考文献

第二章 dlt过表达枯草芽孢杆菌的构建

2.1 前言

2.2 材料与试剂

2.2.1 菌株与质粒

2.2.2 仪器与设备

2.2.3 主要药品与试剂

2.2.4 培养基与缓冲液

2.3 实验方法

2.3.1 构建含dlt操纵子的重组质粒p WOP

2.3.2 构建dlt操纵子过表达菌株Bacillus subtilis SCK6-

2.4 结果与分析

2.4.1 构建dlt操纵子过表达质粒p WOP

2.4.2 大肠杆菌BW25113 重组菌株的鉴定

2.4.3 dlt过表达枯草芽孢杆菌SCK6-2 的构建

2.5 本章小结

参考文献

第三章枯草芽孢杆菌中dlt操纵子对多粘菌素E的抗性机制的研究

3.1 前言

3.2 材料与试剂

3.2.1 主要菌株与引物

3.2.2 仪器设备

3.2.3 主要药品与试剂

3.2.4 培养基与缓冲液

3.2.5 实验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 dlt操纵子在多粘菌素E处理下对枯草芽孢杆菌生长的影响

3.3.2 dlt操纵子对多粘菌素E的 MIC影响

3.3.3 dlt操纵子对多粘菌素E抑菌圈的影响

3.3.4 dlt操纵子对多粘菌素E处理下枯草芽孢杆菌的CFU的影响

3.3.5 dlt操纵子对多粘菌素E处理下枯草芽孢杆菌外渗物变化影响

3.3.6 dlt操纵子对多粘菌素E处理下枯草芽孢杆菌的膜渗透率影响

3.3.7 dlt操纵子对枯草芽孢杆菌表面电荷影响

3.3.8 枯草芽孢杆菌dlt操纵子的敲除探索

3.4 本章小结

参考文献

第四章 dlt在多粘类芽孢杆菌中的异源表达

4.1 前言

4.2 材料与试剂

4.2.1 菌株与质粒

4.2.2 引物

4.2.3 仪器设备

4.2.4 主要药品与试剂

4.2.5 培养基与缓冲液

4.3 实验方法

4.3.1 多粘类芽孢杆菌C12 和多粘类芽孢杆菌 ATCC842 生长曲线的测定

4.3.2 多粘类芽孢杆菌感受态细胞的制备

4.3.3 多粘类芽孢杆菌的电转化

4.3.4 多粘类芽孢杆菌转化子的验证

4.3.5 多粘类芽孢杆菌电转化效率

4.3.6 重组质粒转化多粘类芽孢杆菌的探索

4.4 结果与分析

4.4.1 多粘类芽孢杆菌生长曲线

4.4.2 多粘类芽孢杆菌菌龄对电转化效率的影响

4.4.3 电场强度对电转化效率的影响

4.4.4 海藻糖浓度对电转化效率的影响

4.4.5 复苏时间对电转化效率的影响

4.4.6 重组质粒转化多粘类芽孢杆菌的探索

本章小结

参考文献

第五章总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

附录

附录1 pWBUC01 质粒序列

附录2 基因示意图

1.dlt操纵子基因示意图

2.pWBUC01 质粒示意图

3.pWBUC01 线性化基因片段示意图

致谢

作者简介

1 作者简历

2 攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 傅佳女

导师: 余志良

关键词: 多粘菌素,枯草芽孢杆菌,操纵子,多粘类芽孢杆菌,抗性机制

来源: 浙江工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 浙江工业大学

分类号: Q93

DOI: 10.27463/d.cnki.gzgyu.2019.000969

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枯草芽孢杆菌中dlt操纵子对多粘菌素E抗性的影响机制研究

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