周琳璘[1]2008年在《小麦雄性不育育性相关基因的克隆及表达分析》文中研究说明利用雄性不育现象是作物杂种优势利用的一个重要途径,雄性不育小麦在小麦杂种优势研究和利用方面具有重要价值。本研究选取了3种不同类型小麦雄性不育系及其保持系及两种温敏不育系为研究材料,在其中克隆了MADS box转录因子和Ras-GTPase激活蛋白(G3BP)基因。并分析不育系与保持系间序列的差异及不同类型的材料之间序列的差异。另外采用半定量RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR)技术对这两个基因在其幼穗中的表达模式进行分析。旨在进一步探讨上述两个基因的表达与小麦雄性不育育性转换的关系。获得的主要研究结果如下:1.以3种不同类型小麦雄性不育系和保持系幼穗cDNA为材料,以YS型小麦温敏雄性不育系A3017的不育SSH-cDNA文库中与MADS-box转录因子基因同源的EST序列(EST-ID:36925702,GenBank登录号:DY543239)为信息探针,设计引物克隆均得到660bp左右的cDNA片段。Blast比对及结构域分析显示,所获得的片段均为目标基因。序列多重比较分析表明,3种类型的不育系和保持系幼穗中扩增的cDNA片段差异较小,存在多个单碱基差异。序列聚类分析显示,不育系和保持系的序列分别聚类在一起,说明该基因在不育与可育条件下的表达的确存在差异。由于所扩增的cDNA片段仅为该基因的部分序列,因此,推测导致该基因表达差异的主要原因可能是该基因其他编码区的序列差异,或者是启动子序列的差异等原因,还需进一步研究证实。半定量RT-PCR扩增结果表明,MADS box转录因子基因的表达在3种不同类型的小麦不育系和保持系的幼穗中存在明显差异,在不育系的幼穗中表达量较高,而在相应保持系的幼穗中表达量较低。该基因的表达确与小麦雄性不育的育性有关,该基因的大量表达与其不育性密切相关。2.以3种不同类型小麦雄性不育系和保持系幼穗cDNA为材料,以YS型小麦温敏雄性不育系A3017的可育SSH-cDNA文库中与Ras-GTPase激活蛋白基因同源的EST序列(K346)为信息探针,设计引物,克隆均得到1300 bp左右的cDNA片段。Blast比对及结构域分析显示,所获得的片段均为目标基因。序列多重比较分析表明,3种类型的不育系和保持系幼穗中扩增的cDNA片段差异较小,存在多个单碱基差异。Ras-GTPase激活蛋白基因的半定量RT-PCR扩增,结果表明,Ras-GTPase激活蛋白基因的表达在3种不同类型的小麦不育系和保持系的幼穗中存在明显差异,在不育系的幼穗中表达量较低,而在相应保持系的幼穗中表达量较高。该基因的表达确与小麦雄性不育的育性有关。在育性转换中,该基因的大量表达,可能将细胞质雄性不育系花药发育中的基因表达缺陷修复过来,进而导致育性发生变化。3.以YS型小麦温敏雄性不育系A3017的可育SSH-cDNA文库中与Ras-GTPase激活蛋白基因同源的EST序列(K346)为信息探针,设计引物,在材料基因组DNA克隆均得到2700 bp左右的DNA片段。Blast比对及结构域分析显示,所获得的片段均为目标基因。多重序列比对分析,序列差异较小,不同类型间,不育与可育材料间均存在差异。mRNA序列同基因组序列比对分析3种不同类型的不育系和保持系均有8个外显子,编码区与对应的cDNA中的序列相同,但两者之间外显子的可变剪切较多,这其中不排除测序的偏差。另外,不育系与其对应的保持系其外显子分布相似,存在较小的差异,可能正是基因在编辑的过程中发生了少量碱基的突变而导致育性的转换。对基因组的序列进行聚类分析,结果不育系和保持系分别聚类在一起,说明该基因在不育与可育条件下的表达差异由其基因序列决定。
李红梅[2]2003年在《小麦光周期相关cDNA片段的克隆及鉴定》文中提出人类赖以生存的食品，直接或间接都来源于植物。植物适时或不适时开花，会严重地影响产量。开花是高等植物个体发育的中心环节，温度和光周期是调节成花启动的2个主要环境因子。近年来通过对模式植物拟南芥突变体的遗传研究、基因分离及功能分析，使人们对光周期诱导开花的分子机制有了新的认识。但对小麦开花的分子生物学研究不是太多，研究成果也不丰富。小麦是重要的粮食作物，研究其开花的机理将对生产有重要的意义。本实验以冬性小麦（Triticum aestivum）“抗倒680”为材料，提取总RNA纯化后，运用mRNA差异显示技术，比较了长日照下（16 Light）光周期的零时间与第12小时的叶片中基因转录水平的差异，并对差异表达的cDNA片段进行了克隆分析，进一步通过Northern blot着重研究了表达差异的PZ35片段的表达特点，并通过5′RACE技术对该片段进行了全基因的克隆，但只得到一段很短的序列。主要结果如下：1.对26条随机引物筛选后，只有16条能扩增出带，与3种锚定引物T11N（N=A,C,G）构成了48种组合进行DDRT-PCR扩增，其中以T11G为锚定引物的扩增效果最好。2.差异显示银染后，得到100条只在光周期的零时间表达的带，回收后再次PCR扩增，再扩增率为90％，产物为单条带的共计55条，通过反向Northern点杂交验证，得到2个阳性带。3.对2个阳性带克隆测序，分别命名为PZ35、PZ56。在Genbank中通过同源性比较，发现PZ35片段与大麦COL基因HvCO3、HvCO1编码区的3′端同源性分别为98％、73％，与水稻COL基因OsB、OsA（Hd1）编码区的3′端同源性分别为87%、73％，PZ56片段与拟南芥的部分COL基因同源性高于50％。我们把PZ35片段命名为TaCOL。4.Northern分析表明TaCOL的转录表达水平具有昼夜节律性，其转录表达高峰在光照后的零时间－第4小时之间，证明该基因是一种光周期调控基因，可能与小麦的开花时间有关；TaCOL在根、黑暗处理3天的幼<WP=6>苗中均无表达，证明其在连续黑暗条件下不表达；不同时间的低温处理（4℃）后TaCOL也不表达，说明它不受春化作用的诱导；分别用SA, GA, ABA处理长日下生长的幼苗，TaCOL的转录水平与无处理的对照相比几乎没有变化，证明它的表达不受SA，GA，ABA的诱导。以上结果表明TaCOL基因对光周期开花途径是特异的，与春化开花途径、赤霉素开花途径不相关。Southern分析发现，TaCOL在小麦基因组中的拷贝数多于3个，推测该基因属于多基因家族。
Truong, Xuan, Sinh（张春生）[3]2012年在《燕麦光周期不敏感基因克隆与分析》文中提出燕麦是禾本科(Gramineae)燕麦属(Avena)的重要粮食兼饲草作物，世界各国种植的燕麦以普通栽培燕麦（Avena sativa L.）为主，为六倍体（2n=6x=42）品种,同时燕麦也是一种营养价值很高的作物。燕麦在世界各地广泛栽培种植，中国燕麦的栽培历史已有2100年之久，主要分布在华北、西北和西南。燕麦生长需要一定的自然条件，其中光周期是最重要影响因素之一，其不仅影响燕麦的生育期，同时影响产量，因此优良品种的选育和引进就显得非常重要。燕麦属于长日照作物,一般品种在苗期必须经过长日照阶段才能正常开花结实,这一特性使其在地理分布和播种时间受到限制。种植实践中发现有一部分燕麦在短日照下可以正常开花结实，因此这一部分燕麦属于光周期不敏感品种。由光周期不敏感品种培育出的极早熟燕麦，有效的利用了无霜期前后燕麦生长时期，使燕麦由原来的一年一熟变为一年双熟，单位面积产量升高，极大的提高了燕麦的种植效益。本研究将不同来源的11个燕麦品种同时种在网室观察燕麦的生长情况，结果表明各品种开花时间不尽相同，选择白燕10号（早开花），VOA-8（中开花），AC-Navan和白燕1号（晚开花）种在光照培养箱中分长短日照进行光周期模拟实验，结果表明燕麦品种VOA-8在长短日照条件都开花,因此VOA-8的基因组中可能带光不敏感基因。将VOA-8与白燕1号2个燕麦品种种植在长短日照条件下，利用cDNA-AFLP技术对燕麦光周期相关基因表达差异进行研究分析，两个品种间发现了大约1987条TDF(Transcript-derived fragments)，其中323条TDF是差异表达的，占16%左右，两个品种的基因型差别比较大。对回收的108条TDF序列进行分析，有28条TDF与已知功能基因有较高的同源性，这些基因分别参与了光合作用和能量(7,6.48%)、信号转导(5,4.63%)、代谢(4,3.70%)、转录(3,2.78%)、翻译(3,2.78%)、次生代谢(2,1.85%)、转座子元件(2,1.85%)、防御响应(1,0.93%)和转运(1,0.93%)。其中TDF140是短日照下从燕麦品种VOA-8分离出来的，与小麦光周期Ppd-D1基因同源性较高，突变体Ppd-D1a是光周期不敏感基因，认为VOA-8基因组携带的Ppd基因可能与光周期不敏感性状有关。为了进一步验证这一结果，采用Real-time qRT-PCR技术对9个相关的TDF进行研究分析，结果表明品种VOA-8在短日照下的TDF140表达量比白燕1号增高了3-7倍，且与小麦光周期基因同源性较高，初步证明品种VOA-8带有光周期相关基因（Oats Photoperiod–OPpd）。根据OPpd表达量结合VOA-8品种的表现型（长短日照都正常开花）可以认为OPpd能诱导VOA-8品种在短日照条件下正常开花，这表明OPpd可能是一个燕麦光周期不敏感基因（Oats Photoperiodinsensitive-OPpdi），我们将该光照不敏感新基因命名为OPpdi。为了获得燕麦光照不敏感基因OPpdi，我们采取了RACE方法对未知基因OPpdi进行扩增，通过3’RACE和5’RACE已获得了特异性较高的条带，拼接3’端和5’端序列最终获得了2669bp全长的基因序列，通过比对与已知TDF140序列一致。ORF分析得到1983bp完整的开放阅读框，推测编码660个氨基酸，这一结果证明该片段已有完整的基因编码区，可以进一步进行基因功能分析。BLAST分析表明OPpdi基因的氨基酸序列与小麦、大麦等植物的PRR氨基酸同源性很高，PRR是植物的光周期调控蛋白，在小麦和大麦中这个蛋白是由光周期基因Ppd编码，Ppd的突变体是光周期不敏感基因，可使小麦大麦在长短日照条件下都早开花。保守区分析及多重序列比对表明OPpdi基因蛋白与PRR蛋白有很高的一致性。系统进化树分析表明这个基因的蛋白与小麦大麦的PRR蛋白关系很近，因此认为本研究克隆的燕麦光周期不敏感OPpdi基因与小麦和大麦的光周期基因（Ppd）具有同样的功能和作用。燕麦VOA-8光周期不敏感基因OPpdi的克隆，对燕麦光周期变化的理解和认识提供了重要信息，对今后利用光周期不敏感基因培育一年双熟燕麦品种具有重要的理论价值和应用价值。
宋国琦[4]2006年在《YS型小麦温敏雄性不育系A3017不育和可育条件下基因表达谱的比较分析》文中研究说明小麦光温敏雄性不育系具有一系两用、恢复源广、较易选配出优良的杂交组合等优点,因此在小麦杂种优势利用中占有十分重要的地位。本研究通过人工气候箱控温的方法,比较分析了YS型小麦温敏雄性不育系A3017在不育和可育两种温度条件下花粉的育性及发育特点;并利用cDNA-AFLP技术和抑制消减杂交(SSH)技术,分析了来自同一遗传背景在不育和可育条件下的不育幼穗和可育幼穗,相同发育时期基因表达的差异。旨在探索在YS小麦温敏雄性不育系的发育过程中,温度调控雄性育性的分子机理。获得的主要研究结果如下:1.对YS型小麦温敏不育系A3017-310和A3017-312不育和可育温度条件下的花粉育性分析表明,不育和可育温度条件下花粉的育性存在明显的差异。不育温度条件(昼16℃/夜12℃)下,花粉粒多数败育,I2-KI染色不着色,染色不均匀,约1/3花粉粒发育至单核中后期或双核早期发生败育,大部花粉粒发育到二核后期或叁核期而发生败育(染败),两个系花粉粒碘染的败育率分别为98.7%和99.0%;花粉萌发势分别为0.7%和0.5%;表现花药不开裂、不散粉,自交结实率均为0。可育条件下(正常分蘖穗为昼22℃/夜18℃,再生分蘖穗为昼25℃/夜20℃),花粉粒多数正常,花药能正常开裂、散粉,花粉粒在两种可育温度条件下碘染的败育率无差异,均约20%;花粉萌发势随温度升高而增加,A3017-310由60.7%增为71.5%,A3017-312由27.4%提高为63.1%;自交结实率为34.6%～113.7%(国际法)。2.利用cDNA-AFLP技术,分析了YS型小麦温敏雄性不育系A3017不育(昼16℃/夜12℃)与可育(昼25℃/夜20℃)温度条件下不同发育时期幼穗的基因表达差异。64对引物组合获得差异片段1160个。统计分析表明,单核期表达的差异片段数最多,这一时期可能是育性转换的关键时期。对其中12个在不育或可育条件下表达的差异片段进行回收、克隆、测序,经BLAST序列比对分析,可育条件下的4个EST、不育条件下8个EST中的5个EST在GenBank具有高度同源序列,功能分析表明,它们与基因表达调控、物质和能量代谢及信号传导过程有关。3.以人工气候箱控温条件下YS型小麦温敏不育系A3017的不育幼穗和可育幼穗为材料,分别构建了不育和可育条件下基因特异表达的抑制消减杂交cDNA文库。在不育和可育cDNA文库中分别随机挑选100个阳性克隆进行测序,共获得139条高质量的cDNA序列;经BLASTx序列比对分析,共获功能已知EST 78条。根据序列的BLASTx
袁秀云[5]2009年在《普通小麦春化基因的克隆及表达特性分析》文中指出小麦的春化特性是决定小麦种植区划、引种用种及栽培技术的重要因素之一,小麦品种冬春性的强弱直接影响到小麦的穗分化进程及其对低温冻害的耐受能力,开展小麦春化分子调控机理的研究具有重要的理论和实践意义。本研究以具有不同春化特性的9个代表性小麦品种为试验材料,系统分析了它们的发育特性、春化基因组成及表达特性,主要研究结果如下:1、小麦春化基因VRN1的组成与春化发育特性在供试的9个品种中,低温春化处理在不同程度上均可缩短小麦的幼穗分化进程和苗穗期,且小麦品种的春性越强,其对低温的敏感性越低,冬性越强则对低温春化的敏感性越高。在不同低温春化处理条件下,辽春10号(Vrn-A1,Vrn-B1,Vrn-D1)和新春2号(Vrn-A1,vrn-B1,vrn-D1)苗穗期的变异系数在5%以下,为春性品种,辽春10号的春性最强;豫麦18(vrn-A1,vrn-B1,Vrn-D1)和郑麦9023(vrn-A1,Vrn-B1,vrn-D1)苗穗期的变异系数在5%～10%以下,为弱春性品种;周麦18(vrn-A1,vrn-B1,vrn-D1)和豫麦49-198(vrn-A1,vrn-B1,vrn-D1)苗穗期的变异系数在20%～24%之间,为半冬性品种;京841(vrn-A1,vrn-B1,vrn-D1)新冬18(vrn-A1,Vrn-B1,vrn-D1)和肥麦(vrn-A1,vrn-B1,vrn-D1)苗穗期的变异系数在25%～32%之间,为冬性品种,肥麦的冬性最强。通过基因组特异性PCR鉴定及序列分析,小麦品种的春化发育特性与春化基因Vrn1的显隐性组成密切相关,当Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1均为显性时,品种的春化发育特性为强春性,低温春化效应极低;当Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1为隐性时,品种的春化发育特性为半冬性到强冬性,低温春化效应从弱到强;当Vrn-A1或Vrn-B1或Vrn-D1为显性时,品种的春化发育特性为春性,Vrn1显性基因的春性效应表现为Vrn-A1＞Vrn-B1>Vrn-D1的趋势,与品种的春性强弱趋势表现一致。2、小麦春化基因VRN1的克隆和表达特性通过PCR特异扩增技术克隆了春化基因VRN1的cDNA片段,序列分析显示该基因的A、B和D等位基因间有差异,B和D基因组差异较小,A基因组与B和D基因组差异较大;VRN1基因在不同品种间差异较小,其序列有较高的保守性。通过特异性半定量RT-PCR技术对VRN1的叁个等位基因的表达特性分析显示,强春性品种(辽春10号)的3个等位基因在1叶期(圆锥期)就有较低水平的表达,从3叶期(二棱期)开始保持高水平表达至开花期;春性品种新春2号、弱春性品种豫麦18和郑麦9023中,均有一个显性等位基因(分别为Vrn-A1、Vrn-D1和VRN-B1)在1叶期(圆锥期)就启动表达,而另外两个等位基因的表达则较滞后,这与其基因组成(分别为Vrn-A1vrn-B1vrn-D1、vrn-A1vrn-B1Vrn-D1和vrn-A1Vrn-B1vrn-D1)相一致;在半冬性(周麦18和豫麦49-198)和冬性品种(京841和肥麦)中,叁个等位基因均对低温春化高度敏感,低温春化的诱导效应具有vrn-A1＞vrn-B1＞vrn-D1的趋势。结果表明,VRN1基因的表达启动与等位基因的显隐性组成密切相关,显性等位基因的表达启动较早,而隐性等位基因则较滞后;低温春化能够诱导VRN1的表达;在通过春化阶段后VRN1维持高水平的表达,并一直持续至开花期。3、小麦春化基因VRN2的克隆和表达特性通过PCR特异扩增技术克隆了春化基因VRN2的两个成员ZCCT1和ZCCT2,序列分析显示该基因可编码包含CCT结构域的功能蛋白,基因组结构分析发现该基因包含1个1249bp～1449 bp的内含子。表达特性分析显示,在强春性品种辽春10号中未检测到其表达;在春性品种新春2号、弱春性品种豫麦18和郑麦9023中,只有1叶期(圆锥期)有表达;在其它检测的半冬性和冬性品种中,VRN2基因的表达与VRN1的表达互为消长,即在通过春化阶段以前表达,而在通过春阶段后则停止表达,停止表达时间与幼穗发育通过二棱期一致;VRN2基因的表达受低温春化的抑制,因此在普通小麦中,不需要春化(强春性品种)或当春化发育阶段(春性、冬性品种)通过时,该基因即不表达或表达量极低。4、小麦春化基因VRN3的序列特征和表达特性对VRN3基因的克隆和序列分析显示,该基因在普通小麦中至少存在3个成员;其cDNA序列分析显示该基因编码的蛋白属于磷脂结合蛋白(phospholipid-binding proteins)家族成员,基因组结构分析显示,该基因包含2个内含子,且内含子序列在品种间存在较大差异。通过特异性半定量RT-PCR技术对VRN3的表达特性分析显示,VRN3的表达特性有叁种类型:即在圆锥期表达起始(辽春10号和豫麦18);在伸长期或单棱期开始表达(新春2号、郑麦9023、京841和新冬18);在二棱期之后起始表达(周麦18和豫麦49-198和肥麦)。结果表明,所有品种VRN3的表达持续至开花期;低温诱导能够诱导或增强小麦VRN3的表达5、小麦春化基因的时空表达特性VRN1在小麦根、茎秆、叶片、花药、胚珠、发育过程的种子中均有不同水平的表达,而在于种子和种子萌发过程中不表达,不过在冬性品种中该基因的表达特性受春化进程的影响。VRN2的表达与小麦的春化进程密切相关,仅在小麦通过二棱期前的叶片中表达,而在其它发育时期的叶片及其它组织中均未检测到其表达;VRN3的表达除了在根系中未检测到外,其时空表达特性与VRN1相似。从叁个春化相关基因的表达特性来看,VRN1基因随小麦发育进程及低温诱导而表达,冬性越强,促进表达所需要低温诱导的时间越长;VRN3的表达滞后于VRN1的表达,并与VRN1有相同的表达趋势;VRN2基因在强春性品种中不表达,其它品种仅在幼穗分化通过二棱期前有较高水平的表达,二棱期后不管是冬性品种还是春性品种,该基因均不表达,而VRN1和VRN3均有较高水平的表达;推断VRN1和VRN3基因是生殖生长阶段或开花过程必须的基因,其表达产物在生殖生长中起重要作用。本研究的创新性主要体现在:(1)首次明确了我国不同小麦生态区代表品种的VRN1基因的显隐性组成,及不同品种中3个春化基因VRN1、VRN2、VRN3的表达特性与小麦春化发育特性的对应关系,发现叁个显性Vrn1等位基因具有春性累加效应,而且春性特性表现为Vrn-A1＞Vrn-B1＞Vrn-D1,是控制小麦春性强弱的分子基础。(2)明确了不同品种间3个春化基因VRN1、VRN2和VRN3基因序列的差异特征,发现VRN1基因编码区具有较高的保守性,在不同基因组和品种间VRN1序列差异主要在内含子区,内含子区差异是进一步开发春化发育的分子标记和品种特性鉴定的关键。(3)进一步明确了普通小麦中3个春化基因互作机理,显性Vrn1控制春性发育特性,隐性vrn1控制冬性发育特性,VRN1和VRN3基因是生殖生长阶段或开花过程必需的基因,其表达产物在生殖生长中起重要作用;显性Vrn-A1不受VRN2的抑制表达较早,隐性vrn1的表达受VRN2的抑制,VRN2对VRN1和VRN3具有负向调节作用,VRN3正向调节VRN1。VRN1和VRN3基因都受低温诱导而表达,VRN2受低温诱导而被抑制,从而使小麦表现出低温春化的效应。
张锐[6]2014年在《棉花COL家族基因的鉴定、表达与进化分析》文中提出棉花是全球性的重要经济作物之一,植物学分类属于被子植物门(Angiospermae)、双子叶植物纲(Dicotyledoneae)、锦葵目(Malvales)、锦葵科(Malvaceae)、棉族(Gossypieae)、棉属(Gossypium)。棉属共50个种,包括45个二倍体及5个四倍体种。四倍体棉种包括3个野生棉,即毛棉、黄褐棉及达尔文氏棉,此外陆地棉和海岛棉是目前世界上栽培面积最广的两个栽培种。栽培种由野生种驯化而成,由于长期栽培、驯化及选择作用,野生棉伴随着对光周期敏感的多年生短日照生长习性转变为光周期不敏感的一年生生长习性。发掘棉花光周期相关基因,研究光周期开花途径的作用机制,对于棉花适应多样性的环境及种植面积的扩展十分有益。CO(CONSTANS)及COL(CONSTANS-LIKE)基因是调控植物光周期开花的一个重要转录因子。CO受上游生物钟相关基因(GIGANTEA)G1的影响,并激活下游的成花素FT(FLOWERING LOCUST)的表达.对于特定基因或位点的选择作用,会导致栽培种群体内核酸多样性水平降低、基因频率的降低或升高而偏离中性期望及连锁不平衡的增加。目前水稻中已经证明COL基因是选择的靶标基因。鉴于COL家族基因在光周期开花途径中的保守功能,棉花中COL家族基因信息的局限性以及驯化选择中作用未知。本研究根据拟南芥、水稻的COL家族基因信息从全基因组水平分离棉花的COL家族基因,对其进行分类、结构特征、定位、组织表达、昼夜节律表达及分子进化等系统分析,主要研究结果如下:1.利用比较基因组学,根据拟南芥、水稻的COL家族基因信息,比较雷蒙德氏棉数据库,鉴定了23个棉花COL家族基因。根据系统进化分析,该家族基因分为3类,其中Ⅰ类基因包括COL1-8,均含有两个外显子和一个内含子。AA分析显示有2个B-box及1个CCT结构域(COL8除外);Ⅱ类基因包括COL9-11,也包含两个外显子和一个内含子,有1个B-box及1个CCT结构域;Ⅲ类基因包括COL12-23,该类基因包含一个完整的B-box,一个分化的锌指结构及一个CCT结构域。该类基因结构比较多变,包括2个或3个内含子。2.利用实时荧光定量PCR技术,研究了20个COL家族基因在棉花TM-1根、茎、叶、花药、花瓣等不同组织及0DPA、10DPA及20DPA纤维发育不同阶段的表达特性。结果显示,Ⅰ类中的八个基因中,COL1-5,COL8等六个基因在叶中高表达,COL6和COL7在花中优势表达。此外,COL2-5在纤维中表达也较高。Ⅱ类中叁个基因均在叶中优势表达。Ⅲ类中九个基因,除COL14、COL20及COL22分别在茎、叶及纤维中优势表达外,其余六个基因均是组成型表达。3.在LD或SD条件下,分别处理陆地棉TM-1及海岛棉H7124,连续48h取叁叶一心期叶片进行COL家族基因表达特征分析。结果显示已分析的20个基因中有18个基因的表达表现为昼夜节律性,表明棉花COL家族基因参与棉花光周期调控的开花途径,在棉花的光周期开花途径中起重要作用。4.选择包括野生棉、陆地棉及海岛棉等25个棉材料及外类群长梗肖槿为研究材料,对CO/Hd1所在的Ⅰ类中8个基因进行分子进化相关分析。通过各基因基因组与cDNA进行多序列比对分析,结果表明这8个COL基因非常保守,均含有两个外显子和一个内含子。8个COL基因其DNA全长变异范围为1,030bp-1,611bp,内含子长度的变异范围为77bp-680bp。通过比较不同棉种间同一亚组其同源基因的变异发现,COL2,COL6,及COL8在供试材料间的内含子或外显子Ⅱ区发生插入/缺失,导致长度变异。而同一材料其A-及D亚组部分同源基因的结构变异表明,COL4和COL7在外显子Ⅰ或外显子Ⅱ发生插入/缺失,导致At及Dt间长度变异。5.系统进化分析表明,A组供体阿非利加棉与异源四倍体棉A亚组聚在一起,D组供体与异源四倍体棉D亚组聚为一类。184个成对比较中,其A vs.D、At vs.Dt成对比较的进化速率高于A vs.At及D vs.Dt进化速率占到98.37%。进一步分析证明A vs.D与At vs.Dt进化速率之间表现极高的正相关,最小的相关系数r值为0.797。说明异源四倍体中,8个COL家族基因的A-及D-亚组间是独立进化的。6.通过成对比较8个COL家族基因组合,以及每个基因在所有四倍体棉种及A、D基因组间的核酸多样性(π)。结果表明8个基因组合中,D vs Dt核酸多样性(0.01051),显着大于A vs At的核酸多样性(0.00586)(P=4.9E-21)。单个基因分析表明,COL2-COL5,COL7及COL8这6个基因在Dt中的进化速率显着快于At,COL6是在At的进化速率显着快于Dt,而COL1基因的进化速率在At和Dt之间无显着差异。综上所述,8个COL家族基因在At及Dt间的进化速率不同,大部分基因其Dt的进化速率快于At。7.分别分析野生棉、陆地棉及海岛棉的8个COL基因位点其核酸多样性πtotal,结果显示野生棉的πtotal,显着高于陆地棉(0.00369 vs 0.00139)(P=0.001)及海岛棉(0.00369 vs 0.00035)(P=7.3E-7),表明陆地棉及海岛棉在驯化过程中存在瓶颈效应。进一步比较B-box,Var及CCT这叁个结构域在不同棉种中的核酸多样性,发现B-box(0.00284 vs 0.00119,P=0.028)及Var(0.00243 vs 0.00119,P=0.014)结构域的核酸多样性显着高于CCT结构域,B-box及Var结构域间的核酸多样性无显着差异。说明B-box及Var结构域在进化过程中发生较大变异,而CCT结构域在不同棉种间高度保守,功能上也比较保守。8.通过对8个COL家族基因进行Tajima's D,Fu and Li's D和F中性检验,表明陆地棉在COL1及COL2中存在大量的低频率位点,这与陆地棉最近发生的正选择作用相一致。COL8Dt在陆地棉种中,Fu and Li's D和F值在0.1水平上为显着的正值,表明在COL8中存在大量中等频率的等位基因,可能是由平衡选择引起的。中性检验表明,COL1、COL2及COL8在陆地棉的驯化过程中经受了更大的选择压,可能是受选择的靶标候选基因。
任洪艳[7]2012年在《光周期途径菊花成花相关基因的筛选及其表达分析》文中提出菊花（Chrysanthemum morifolium）是我国传统名花，也是世界四大切花之一，其产量和销量均位于世界花卉前列。本研究以目前国内外市场销量最大的切花菊品种‘神马’[Chrysanthemummorflorium（Ramat.） Kitam.‘Jinba’]为材料，利用cDNA-AFLP技术，对不同光周期处理的菊花茎尖基因表达图谱进行分析，分离并鉴定差异表达的基因，通过克隆测序，BLAST分析，获得了6个可能与开花相关的基因片段，为从分子水平上了解菊花花芽分化的分子机理，通过基因工程技术培育不同目标花期的菊花新品种奠定基础。主要研究成果如下：1、建立了适合菊花的cDNA-AFLP分析体系TRNzol法提取的RNA较完整，纯度较高；采用Oligo（dT）18Primer及经过改造和优化的BeyoRT M-MuLV反转录酶得到ds cDNA，将1μg的cDNA利用EcoR Ⅰ/MseⅠ快速双酶切5min，连接产物稀释10倍作为预扩增反应的模板，扩增30个循环，其检测结果较理想；预扩增产物稀释50倍作为模板，采用Touchdown程序，选用64对AFLP引物进行选择性扩增；扩增产物经6%的PAGE电泳后采用改进的快速银染体系，得到了清晰可辨的cDNA-AFLP凝胶图谱。本研究建立的反应体系适用于菊花功能基因的cDNA-AFLP研究。2、利用所建立的cDNA-AFLP技术体系，筛选菊花开花相关基因64对引物组合检测到2917个cDNA片段，获得差异表达的TDF共835个，其中584个为上调表达，251个为下调表达。对克隆测序成功的50个差异表达TDF进行分析，结果表明，36个TDF可以在NCBI数据库中找到同源序列。其中31个TDF为已知功能的基因（dbEST登录号：JG700127-JG700157），5个TDF未找到同源序列。按照其功能分类，将31个差异表达基因分为7类：信号转导、分化发育、转录调控、蛋白质代谢、能量与代谢、抗病与防御等相关基因、未知或假定蛋白基因及未知基因。3、6个与开花相关的TDF的RT-PCR验证对选取的6个与开花相关的TDF进行半定量RT-PCR验证，结果表明，6个基因片段在短日照条件下均特异表达或表达上调，而在长日照下均未见表达或表达下调，这与cDNA-AFLP表达谱结果相一致。本研究利用cDNA-AFLP技术筛选了菊花花芽分化期多个与菊花开花相关的基因片段，这些基因片段将进一步用于功能鉴定和转基因利用。
秦娜[8]2006年在《小麦温敏核不育基因片段的克隆和籽粒加工品质的配合力分析》文中认为本实验以小麦(Triticum aestivum L.)温敏核雄性不育系BS210为材料,在北京和安徽阜阳种植,分叁个阶段进行小麦穗部取样:雌雄蕊原基分化期-药隔形成期,药隔形成期-四分体期,四分体期-单核前期,选用锚定引物和8种随机引物进行PCR扩增,从mRNA差异显示电泳图谱中,选择差异cDNA片段进行反向Northern斑点杂交验证,并克隆阳性片断。通过分析不同时期两种环境中基因的表达情况,从中初步筛选出峰图良好和插入片段长度大于200bp的序列。并采用BLASTX及BLASTN对18个EST序列进行了对比分析,对比结果表明:其中叁个基因片段与已知序列同源性较高,小麦穗发育过程中类激酶受体基因、玉米细胞死亡抑制蛋白基因和一粒小麦磷脂酰丝氨酸脱羧酶基因高度同源,分别为92%、70%和89%,其余14个序列为新基因片断。该研究为以后获取相关基因提供了重要的序列信息,为分子水平上探讨雄性不育机理奠定了研究基础。以不育系BS210和BS366作母本,63个常规品种作父本获得杂交一代。选用揉面仪,测定了亲本及其F1全麦粉面团流变学特性参数,明确了全麦粉代替面粉用来分析加工品质以进行早代选择的可行性。稀懈值和峰值黏度的配合力分析结果表明:母本BS210一般配合力相对效应值较高。特殊配合力较高的组合有:BS210×周麦18;BS210×豫农91322;BS210×簇乞麦改良;BS366×濹176。
丛倩倩[9]2010年在《二穗短柄草的遗传转化及INDETERMINATE1基因的克隆》文中研究指明INDETERMINATE1 (ID1)基因是从玉米中首先发现的一个控制营养生长向生殖生长转变的基因,ID1功能缺失表现出成花转变过程推迟。同时,在其他禾本科植物水稻、高粱等植物中也发现了其同源基因,通过对玉米和水稻中同源基因的研究初步证明该类基因控制的开花,是独立于光周期开花途径之外的另一条开花途径,在控制营养生长到生殖生长的转变中发挥重要作用。水稻和玉米是典型的短日照植物,其成花转变过程不需要春化作用,而小麦是长日照植物,其开花转变需要春化作用,在小麦中是否也存在类似的成花转变分子机理目前还不清楚。如果也存在类似的机理,该信号转导途径与春化作用的关系是怎样的以及该途径功能的缺失是否能被春化作用所弥补而开花是我们关心的问题。曾经尝试在小麦中克隆该基因,但未取得成功,因此决定选择麦类作物的模式植物二穗短柄草作为研究对象,阐明其成花转变的分子机理,以指导后续实验。本文以二穗短柄草Bd21为实验材料,首先分析了Bd21的生长特性,摸索了短柄草的组培转化体系,然后在Bd21中克隆得到ID1同源基因(BdID1),对其进行了序列比对,表达特性分析,并对其功能进行了初步的鉴定;同时利用EMS对二穗短柄草种子进行了诱变,希望获得一些与开花时间有关的突变体,利用Tilling技术筛选看是否能发现BdID1基因的点突变,为进一步研究该基因的功能及作用机理奠定基础。主要研究结果如下:1、通过观察Bd21在不同的春化和光周期处理条件下的生长反应,初步得出Bd21为典型的长日照植物,且具有弱冬性和弱休眠特性。2、利用同源序列比对设计引物,通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从二穗短柄草Bd21中克隆得到一个ID1基因,命名为BdID1。其全长1661bp,编码一个429氨基酸的蛋白质,5’和3’非编码区全长分别为140bp和231bp。序列分析发现,BdID1也具有由四个锌指元件组成的ID domain,该保守区存在典型的保守基序TRDFLG。BdID1同来源与水稻、玉米和高粱的ID1在氨基酸水平上具有较高的同源性,同源性高达56-65%。cDNA序列与基因组序列比对后发现BdID1基因组序列内存在两个内含子。3、半定量RT-PCR分析发现,BdID1基因在整个生长周期内都有表达,在幼叶中表达量最高,而在老叶,茎干,根,芽顶端分生组织中则表达量较低。4、摸索了短柄草的组培流程,并尝试农杆菌介导法转化pSQ5带有GFP和潮霉素双重筛选标记的质粒载体,经紫外光照射辅助筛选阳性转基因苗。同时将BdID1构建了正义、反义和RNAi植物表达载体,采用农杆菌介导的方法,转化短柄草,经潮霉素筛选获得抗性再生植株。5、利用EMS对二穗短柄草种子进行了诱变,M2代种子已经收获,获得了几株与开花时间有关的突变体。
戴建军[10]2003年在《甜菜当年抽苔差异表达基因的克隆及特性研究》文中提出糖用栽培甜菜(Beta Vulgaris L)是二年生作物，通常情况下第一年进行营养生长，第二年经春化后块根发芽、抽苔、开花、结实。但是，由于某些原因也可见到甜菜当年抽苔的现象。在甜菜生产及育种试验田中，甜菜当年出现抽苔、开花、结实植株统称为当年抽苔植株。由于该植株把大量光合产物消耗于生殖生长过程，影响块根增长和糖分积累，致使块根产量比正常甜菜产量减少10％～20％，含糖率降低0.8％～1.6％，工艺品质差，不耐贮藏，抽苔越早，减产越多，含糖量降低越显着。严重影响甜菜的生产并给育种试验结果带来很大的误差，因此有必要分析甜菜抽苔的原因，采取相应的抗抽苔措施。分析引起甜菜当年抽苔的原因，国内外研究认为遗传与环境因素都能影响甜菜抽苔。可分为内因和外因。具体地说，内因是由控制甜菜一年或二年生习性的基因决定的，而外因则是生态条件即当年能满足其生殖生长的环境条件，那么就会出现当年抽苔的现象，该条件主要是春化和光周期：即低温和长日照。此外营养条件、激素水平等也影响甜菜当年抽苔。无论是光周期、赤霉素还是低温这些环境条件都是外因，都要通过内因，也就是必须通过对基因的作用才能起作用。因此，要想研究二年生甜菜当年抽苔的机理，就必须分离克隆抽苔基因，弄清基因结构，表达调控等，这样才能从分子水平解释抽苔机理。本试验研究低温诱导甜菜抽苔的差异表达基因，探讨二年生甜菜当年抽苔的分子机理。主要研究结果如下：1．试验在Conviron E15型人工气候室人工控制温度、日长进行。采用马凤鸣等试验条件(长日照16h、4℃、72d，抽苔率100％)诱导“甜研材料”幼苗抽苔；采集不同时期和各处理的茎尖，提取总RNA，置换合成双链cDNA。合成3对接头引物，用代表性差示分析(Representational Difference Analysis of cDNA，cDNA-RDA)分离抽苔差异表达基因片段。将分离到的差异片段克隆，测序，获得323bp差异片段DP3序列。GenBank中的注册号为AY326073。2．根据cDNA-RDA获得323bp差异片段DP3序列，设计引物。用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)即3′-RACE和5′-RACE法进行cDNA3′端和5′端快速扩增，应用DNAMAN 4.0 Sequence Assembly程序将3′RACE和5′RACE测序结果与靶序列DP3的进行双拼接，获得693bp片段序列。3．根据RACE双拼接结果设计一对引物，以Ty7的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增回收的片段命名为Ty7Br600。将其克隆，测序，获得609bp差异片段序列。在GenBank中注册，登录号为AY324115。将获得的cDNA序列通过查询互联网，利用BlastN与GenBank库中的核苷酸序列比较，结果没有发现Ty7Br600基因同源序列；在拟南芥(Arabidopsis)的基因库中比较也未发现同源序列。因此我们认为这个cDNA序列有可能来自一个未曾分离克隆的新基因。东北农业大学农学博L学位论文 4.分别以’fy7和TA33的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增回收的片段分别命名为7少7/]1夕夕奸11荆.丈价厂600。将其克隆，测序，分别获得6Ogbp和855bp基因片段序列。通过国际互联网在GenBank中注册，厅朋z认匆DNA登录号为AY3241 14。别刃功，彬夕登录号为AY324113。应用DNAMAN4.osequenceAlignment程序将cDNA差异片段Ty夕召尹‘ooeDNA和珍7B四卯基因组DNA序列比较发现有1个235bP的内含子(iniron)，其左边界为GT，右边界为AG，与通常植物基因中的内含子边界一致。与别刀B巧00基因组DNA序列比较发现，一年生(当年抽苔)品种的TA33 Br600基因组DNA序列没有内含子，另外，二者同源性为99.8%，只有在513处有l个碱基差异。这种单核普酸的微小变化，可能与一年生品种TA33当年抽苔机制有关。 5.综合DNAMAN、PHD、sosul软件、GLOBE等儿种软件预测结果，可以推测妙7B巧00基因编码部分的蛋白可能是一种分子量约为15KD，等电点PI为5.85，具有紧凑的球状膜蛋白(eompaet，globular，nembrane protein)· 6.对厅刀介万夕口基因进行RT一PCR分析，结果表明，低温诱导72天的甜菜幼苗，取出6小时后有较弱表达，至4S小时达到最高，72小时后稍有减弱。因此，厅刀介石口口基因是一种诱导表达型基因。分别用。一32P一A1，P放射标记按随机引物标记法标记探针，进行Northem杂交。Northem杂交实验结果显示，在低温诱导培养的甜菜幼苗的RNA群体中，出现较强的杂交条带，而在未诱导培养的甜菜幼苗的RNA群体中，则儿乎没有阳性杂交条带出现。因此，这一序列有可能是二年生甜菜幼苗经低温诱导处理之后被诱导表达的与抽苔相关的新基因序列。Southern杂交结果发现，在每一组酶切中至少有2~3条条‘{1李，且有1条带的强度明显高于其他条带，表明这些cDNA差异片段确为甜菜基因组片段，也同时表明该基因在甜菜基因组中以2个拷贝或低拷贝形式存在。 7.构建原核表达载体，转化JM109菌株，IPTG诱导蛋白表达，SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳检测。结果电泳图谱上出现清晰的诱导表达条带，外源蛋白的表达量占细菌总蛋白的12%左右，融合蛋白相?
参考文献：
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[8]. 小麦温敏核不育基因片段的克隆和籽粒加工品质的配合力分析[D]. 秦娜. 内蒙古农业大学. 2006
[9]. 二穗短柄草的遗传转化及INDETERMINATE1基因的克隆[D]. 丛倩倩. 山东农业大学. 2010
[10]. 甜菜当年抽苔差异表达基因的克隆及特性研究[D]. 戴建军. 东北农业大学. 2003