淀粉磷酸化酶和淀粉分支酶多克隆抗体的制备及蛋白复合体的相互作用研究

论文摘要

淀粉作为植物中重要的贮藏多糖,是植物种子的主要成分。淀粉可以为食物提供80%的能量,是食物的重要组成部分。淀粉是促成各种作物植物产量的主要成分,也是许多工业应用的可持续原料。淀粉的合成与分解受一系列酶的催化调控,包括淀粉磷酸化酶（Starch phosphorylase,SP）、淀粉合酶（Starch synthases,SS）、淀粉分支酶（Starch Branching Enzymes,SBEI）、淀粉去分支酶（Starch-Debranching Enzymes,DBE）、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase）等。淀粉磷酸化酶和淀粉分支酶都是植物淀粉生物合成过程中的一个起重要作用的酶,SP在植物淀粉贮藏器官中,能够参与支链淀粉侧链修饰反应。SBE能通过催化切开多聚糖链的α-1,4糖苷键,并在葡萄糖链的特定糖基上形成α-1,6糖苷键连接切短的糖链,从而催化形成淀粉的分支结构,并且另外的非还原末端用于进一步合成淀粉。前人对淀粉合成及代谢过程中的SBEI和SPI的功能开展了大量研究,但其直接相互作用的蛋白还无定论,在蛋白水平组织分布也未见报道。本研究制备了SBE1和SPI多克隆抗体,弄清了其组织表达分布。用免疫沉淀（IP）、酵母双杂交方法,研究了SBE1和SPI的相互作用蛋白;在玉米中淀粉合成过程中提出新的多酶复合体组合方式。主要获得了以下结果:（1）构建pGEX-6T-1-SPI-C（768-984aa）和pGEX-6T-1-SBEI-C（649-823aa）原核表达载体。以四川农业大学玉米研究所选育的中国西南地区玉米骨干系08-641（R08）为材料,制备cDNA,设计引物,参照NCBI序列PCR克隆出完整的SPI（全长2955 bp）和SBEI（全长2472 bp）编码区序列。由于SPI和SBEI基因较长,较难在微生物中表达蛋白;为了制备SPI和SBEI的抗原,构建了其带GST标签C端结构域原核表达载体pGEX-6T-1-SPI-C（768-984aa）,SPI基因C末端结构域基因片段651 bp;pGEX-6T-1-SBEI-C（649-823aa）,SBEI基因C末端基因片段525 bp,进一步的测序验证,表明表达载体构建成功。（2）制备和评价SBEI和SPI兔源多克隆抗体。以构建成功的原核表达载体转化BL21（DE3）,IPTG诱导其蛋白表达并GST纯化。以纯化的GST-SBEI-C和GST-SPI-C融合蛋白作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备SBEI和SPI多克隆抗体。以此抗体进行Western blot检测,结果表明制备的SBEI和SPI抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白。用免疫前血清和免疫后血清以及将SPI和SBEI作为抗体对授粉后20天的玉米胚乳蛋白进行Western blot检测。结果表明免疫前血清检测不到SBEI和SPI蛋白,免疫后血清可以检测SBEI和SPI蛋白,证明抗体成功制备。SBEI和SPI抗体免疫沉淀授粉后的20天胚乳蛋白,并进行Western blot检测,结果显示抗体能够免疫沉淀其蛋白。综上,表明成功制备了SBEI和SPI抗体,抗体可用于Western blot检测和免疫沉淀（IP）实验。（3）SPI和SBEI在玉米授粉后不同组织的表达。在体外,SPI和SBEI抗体能识别其抗原,但是否能识别玉米体内其他组织的蛋白还不清楚。为了选取合适的玉米组织进行抗体体内的验证,首先对SPI和SBEI进行qRT-PCR,分析其在授粉后15天的胚乳、籽粒以及根、茎、叶等不同组织中的表达,结果显示在mRNA水平上,在15天籽粒和胚乳中表达量较高,根茎叶中表达量较低,且胚乳又高于籽粒,表明SPI和SBEI主要在胚乳中表达。为进一步验证SPI和SBEI抗体能否识别玉米内源SPI和SBEI蛋白,提取了玉米08-641授粉后15天胚乳和籽粒总蛋白并进行Western blot实验,结果表明SPI和SBEI在授粉15天籽粒、15天胚乳、茎及叶中都能检测到蛋白条带,而在根中表达量很少,SPI蛋白分子量约112 kD,SBEI蛋白分子量约84 kD,与mRNA水平检测结果一致;因β-actin上样量对照较籽粒低,因此胚乳表达量稍高于籽粒,表明SPI和SBEI主要在胚乳中表达,且主要在胚乳积累。以上结果表明SPI和SBEI多克隆抗体能特异识别玉米体内的SPI和SBEI蛋白,且SPI和SBEI蛋白在组织表达上具有特异性。（4）SPI和SBEI在玉米授粉后不同时期的表达。SPI和SBEI抗体具有较好的特异性,但在mRNA和蛋白水平,其蛋白表达和组织的表达分布还不清楚。为弄清玉米体内蛋白表达和组织的表达分布,首先通过qRT-PCR对SBEI和SPI授粉后5-35天的胚乳进行mRNA水平的表达分析,结果表明在授粉后5-20天,胚乳中SPI和SBEI mRNA表达增加,20-35天逐渐下降。其次分离授粉后不同阶段的胚乳,提取总蛋白并进行Western blot检测,结果表明在授粉10天内SPI蛋白含量很少,10-15天之间SPI和SBEI蛋白的表达量剧增,在15天、20天的信号最强,随后逐渐减弱,这一结果与mRNA水平表达模式相符,同时与淀粉的积累模式也相符。（5）对淀粉合成过程中多酶复合体的研究。以酵母双杂实验研究蛋白质-蛋白质相互作用,设计重组酵母引物,将构建好的载体质粒转化到酵母中,使得每个蛋白质组与GAL4-AD或GAL4-BD进行融合,另外,将每个基因的融合质粒与空质粒组合作为阴性对照,并将1034-AD和q146-BD作为阳性对照。前人研究报道,SSI、SSIIa和SBEIIb组成异源三聚体,并且SSI与SSIIa、SBEIIa和SBEIIb相互作用的大蛋白复合物也以磷酸化依赖性方式存在,但是蛋白复合物之间的结合关系并不清楚,实验研究表明了SBEIIa和SBEIIb、SBEIIa和SSI、SBEI和SSI、SBEIIb、SSIIa和SBEIIb有相互作用。说明在淀粉合成过程中,SSI、SSIIa、SBEI、SBEIIa和SBEIIb以SBEI-SSI-SBEIIa-SBEIIb-SSIIa复合体的形式存在,此复合体中不存在SPI。

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摘要

Abstract

缩写表

1.文献综述

1.1 玉米淀粉的基本性质与分类

1.2 淀粉的生物合成

1.3 淀粉磷酸化酶（Starch phosphorylase,SP）

1.4 淀粉分支酶（starch Branching enzyme,SBEI）

1.5 研究目的意义

1.6 技术路线

2.材料与方法

2.1 材料与试剂

2.2 SPI和 SBEI抗体的制备

2.2.1 构建原核表达pGEX-6T-1-SPI、pGEX-6T-1-SBEI载体

2.2.2 目的基因的纯化回收

2.2.3 大肠杆菌感受态的制备

2.2.4 目的基因连接转化

2.2.5 重组质粒的筛选鉴定

2.2.6 质粒的提取

2.2.7 SPI C端和SBEI C端 GST融合蛋白的诱导纯化

2.2.8 SDS-PAGE检测

2.2.9 多克隆抗体的制备

2.3 抗体纯化

2.4 抗体的体外评价

2.5 玉米胚乳组织蛋白的提取及定量

2.6 Western blot检测

2.7 免疫沉淀（IP）

2.8 组织特异性分析

2.8.1 植物组织RNA的提取

2.8.2 RNA反转录

2.8.3 荧光定量PCR和半定量RT-PCR

2.8.4 Image-J灰度分析Westernblot结果

2.9 构建酵母表达重组载体

2.9.1 重组基因片段的扩增

2.9.2 重组连接酵母表达载体

2.9.3 酵母感受态细胞的制备及重组质粒的转化

3.结果与分析

3.1 原核表达载体的构建

3.1.1 pGEX-6T-1-SPI-C（768-984aa）原核表达载体的构建

3.1.2 pGEX-6T-1-SBEI-C（768-984aa）原核表达载体的构建

3.2 融合蛋白的表达纯化

3.3 兔抗血清制备及特异性检测

3.4 SPI和 SBEI在玉米授粉后不同组织的表达

3.5 SPI和 SBEI在玉米授粉后不同时期的表达

3.6 酵母双杂验证蛋白-蛋白相互作用分析

4.讨论与结论

4.1 SPI和 SBEI抗体特异性分析

4.2 淀粉合成关键酶SPI、SBEI、SBEIIa、SBEIIb、SSI、SSIIa相互作用分析

结论

参考文献

附录

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 申蕾阳

导师: 余国武,宋军

关键词: 玉米,淀粉磷酸化酶,淀粉分支酶,蛋白复合体

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 四川农业大学

分类号: Q946

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000799

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淀粉磷酸化酶和淀粉分支酶多克隆抗体的制备及蛋白复合体的相互作用研究

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