人精氨酸酶Ⅰ基因的表达及其多克隆抗体的制备

论文摘要

精氨酸酶I（Arginase I,ARGI）作为肝脏中尿素循环的关键酶,具有多种重要的生物学功能,其与肿瘤、高血压、衰老、缺血再灌注损伤和糖尿病等许多疾病的发生发展密切关联,因此已成为人类代谢功能研究的热点。精氨酸酶I能够将L-精氨酸水解为L-鸟氨酸和尿素,而L-鸟氨酸能被进一步产生多胺和脯氨酸等代谢产物,从而影响细胞的生长和结构蛋白的合成。此外,在脉管系统中也存在有精氨酸酶,脉管系统中的精氨酸酶与一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase,NOS）竞争底物L-精氨酸,从而抑制一氧化氮（Nitric oxide,NO）的合成,进而导致血管内皮细胞或平滑肌细胞功能的障碍。近年来的研究表明精氨酸酶在多种恶性肿瘤组织中高表达,尤其是精氨酸酶作为肝癌的特异性标志物在肝癌的诊断和治疗中也具有重要作用。因此精氨酸酶I有望成为新型的肿瘤治疗靶点,也能够逆转血管内皮细胞和平滑肌细胞功能的障碍,具有预防血管性疾病的作用。深入探讨精氨酸酶I的结构与功能,有助于确认精氨酸酶Ⅰ与相关疾病发生和发展中的作用关系,制备能够有效识别生理及病理状态下的ARG Ⅰ的抗体,可帮助进行相关疾病的诊断和治疗。本研究开展人精氨酸酶Ⅰ基因的表达及其多克隆抗体的制备,并比较分析蛋白质免疫、DNA免疫及DNA初免-蛋白质加强免疫等多种途径在抗体制备方面的异同,获得一种有效制备人精氨酸酶Ⅰ多克隆抗体的技术体系。为制备抗人精氨酸酶Ⅰ（Human-ARGI）的抗体,首先要克隆获得人精氨酸酶I基因及构建重组表达质粒,制备免疫动物的质粒抗原和蛋白质抗原。根据NCBI数据库提供的人精氨酸酶Ⅰ基因序列分别设计三对特异性引物,以pCDNA3.0 Flag-Arginase Ⅰ为模板PCR扩增目的基因,并将人精氨酸酶I基因分别连接到pCMV-MYC,pEGX-4T-1和pED-1三种质粒载体上,构建获得真核表达载体pCMV-MYC-ARGI 和原核表达载体 pEGX-4T-1-ARGI 及 pED1-ARG I,并通过酶切鉴定和测序验证其构建的正确性。为获得人精氨酸酶I蛋白抗原,将原核表达载体pEGX-4T-1-ARG I和pED1-ARG I分别在大肠杆菌进行原核诱导表达,纯化获得带有不同标签的精氨酸酶I融合蛋白GST-ARGI和His-ARG Ⅰ,对融合蛋白的特异性进行分析,并选择GST-ARGI作为免疫动物的蛋白质抗原。结果表明利用原核表达载体pEGX-4T-1-ARG Ⅰ和 pED1-ARG Ⅰ诱导获得融合蛋白 GST-ARGI（约 64kDa）和 His-ARG I（约36kDa）,确定优化诱导条件,结果表明以25℃,0.6mmol ·L-1,异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）和16h为最佳诱导表达条件。融合蛋白通过亲和纯化之后纯度能够达到90%以上,His-ARG I融合蛋白能够与GST-ARG Ⅰ抗血清特异性结合,并在36kDa处出现了特异性结合条带。纯化获得的人精氨酸酶Ⅰ融合蛋白可以作为抗原用于免疫接种小鼠。为得到能有效识别人精氨酸酶Ⅰ的多克隆抗体,并对不同免疫策略在产生抗体方面的的异同进行比较。按照DNA单独免疫、蛋白质单独免疫和DNA初免-蛋白质加强免疫等策略免疫动物,并在第3次加强免疫后收集各组血清及检测其效价,从中挑选出蛋白质单独免疫组和DNA初免-蛋白质加强组小鼠的血清进行纯化,进一步鉴定抗体的效价和特异性。此外,将真核表达质粒pCMV-MYC-ARGI转染至哺乳动物细胞293T里面,并检测该基因在哺乳动物细胞里面的表达情况。实验结果表明纯化后的抗体纯度达到了 98%以上,抗体效价也有了明显的提高,达到了 1:100000,并且所得到的抗体具有较高的抗原特异性。磷酸钙细胞转染实验结果证实了重组质粒pCMV-MYC-ARGI能够在哺乳动物细胞里面高效表达,产生具有生物活性的人精氨酸酶工蛋白。通过制备抗原特异性的高滴度抗人精氨酸酶Ⅰ多克隆抗体,不仅建立了高效制备抗体的免疫策略,也为精氨酸酶Ⅰ结构与功能的深入研究以及相关疾病的诊断提供了有效的检测工具。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 叶尔那扎尔·努尔吐热

导师: 张富春,张茂祥

关键词: 人精氨酸酶,基因表达,融合蛋白,多克隆抗体,免疫,蛋白质免疫

来源: 新疆大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 新疆大学

分类号: Q78

总页数: 75

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