带有β-tail的QueF-Like酶的表达及纯化研究

论文摘要

古细菌（Archara）又被称之为古生菌。它们与原核生物既有很多的相似之处,同时也拥有真核生物的某些特征。古菌分两大类,广古菌（Euryarchaeota）以及泉古菌（Crenarchaeota）。古嘌苷（Archaeosine,G+）是在古菌tRNA中被发现的一种高度修饰的核苷。经研究发现,在泉古菌中参与古嘌苷合成途径中的QueF-like酶与细菌的QueF酶具有同源性。人们在细菌中克隆了 QueF基因,并且通过对QueF的催化活性的研究,发现了 QueF具有腈类还原酶活性。而腈类还原酶具有良好的应用前景。因此研究来自泉古菌的QueF-like酶的活性也具有重要意义。根据报道,带有β-tail的融合蛋白可以在细菌中表达,与β折叠纤维化短肽混合时,可以共同诱导组装成纳米纤维结构,进而提高酶的催化效率及稳定性。所以本实验选取泉古菌Pvrobaculum calidifontis的QueF-like基因,在其C-端加上β-tail的编码序列,由大连的宝生物公司合成全序列。本研究通过基因重组技术,把已合成的全序列从pUC-19中切除,然后插入到载体pET-28a上,重新构建了重组表达载体pET-28a-QueF-Like-β-tail,然后在大肠杆菌中对带有β-tail的QueF-like酶蛋白进行了表达,并对其进行了纯化。SDS-PAGE电泳检测表示,目的蛋白已成功表达。此研究为后续的QueF-like酶的纳米纤维的组装打下了基础。

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摘要

Abstract

缩略语表

1. 引言

1.1 古菌的介绍与分类

1.2 古菌的研究意义和进展

1.2.1 泉古菌的介绍及来源

1.2.2 古嘌苷的介绍

1.2.3 QueF以及QueF-like

1.2.4 腈类

1.2.5 腈类的还原研究及其意义

1.2.6 β-tail

1.3 本试验研究的目的与意义

2. 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 目的基因序列及氨基酸序列

2.1.3 pUC-19质粒

2.1.4 主要试剂

2.1.5 主要仪器

2.1.6 引物

2.1.7 培养基配置

2.1.8 主要溶液的配置

2.2 实验方法

2.2.1 质粒提取

2.2.2 目的基因与pET-28a空质粒的双酶切

2.2.3 双酶切产物的回收连接

2.2.4 连接产物pET-28a-QueF-like-β-tail的转化

2.2.5 重组质粒pET-28a-QueF-like-β-tail的提取

2.2.6 重组质粒pET-28a-QueF-like-β-tail的菌落PCR鉴定及测序

2.2.7 诱导表达

3 结果与分析

3.1 目的基因及pET-28a质粒的双酶切结果

3.2 重组质粒pET-28a-QueF-like-β-tail的转化结果

3.3 重组质粒pET-28a-QueF-like-β-tail提取结果

3.4 重组质粒pET-28a-QueF-like-β-tail的鉴定

3.4.1 重组质粒双酶切鉴定

3.4.2 菌落PCR鉴定

3.4.3 pET-28a-QueF-like-β-tail的基因测序

3.5 重组质粒pET-28a-QueF-like-β-tail转化到BL21（DE3）

3.6 重组蛋白带有β-tail的QueF-like酶的诱导表达

3.7 重组蛋白带有β-tail的QueF-like酶的纯化

4. 讨论与结论

4.1 讨论

4.1.1 选择β-tail的意义

4.1.2 载体和宿主细胞的选择

4.1.3 带有β-tail的QueF-like酶的诱导表达及其纯化

4.2 结论

致谢

参考文献

附录

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 果冲

导师: 宝力德,邰丽华

关键词: 古细菌,表达,纯化

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古农业大学

分类号: Q78

DOI: 10.27229/d.cnki.gnmnu.2019.000495

总页数: 43

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带有β-tail的QueF-Like酶的表达及纯化研究

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