导读:本文包含了种源筛选论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:性状,商陆,沙棘,物种,原体,锥栗,文冠果。
种源筛选论文文献综述
郁万文,罗佳亲,曹福亮,汪贵斌,谢嗣荣[1]（2019）在《高含量次生代谢产物叶用沙棘种源的筛选》一文中研究指出以沙棘自然分布区内5个省区的10个产地的一年生实生苗为研究对象,研究了不同种源沙棘叶生物量及叶中多糖和主要次生代谢产物含量的变化和地理变异,采用隶属函数法对10个沙棘种源一年生苗进行了综合评价,以期筛选出优良叶用沙棘种源。结果表明:沙棘种源间叶生物量及叶中次生代谢物质含量存在显着的地理变异。10个沙棘种源叶中总黄酮含量在7月达到峰值;叁萜含量在9月达到峰值;多糖含量在6月达到最高值,为沙棘叶片不同多糖和主要次生代谢产物最佳利用时间的确定提供参考依据。基于叶中各种多糖和主要次生代谢产物含量最高月份的单株叶生物量、多糖和主要次生代谢产物含量、单株多糖和主要次生代谢产物产量,利用隶属函数法筛选特用型叶用种源,其中排名前3的种源如下,黄酮高产种源为老白沟、固阳、龙凤沟,叁萜高产种源为固阳、老白沟、博克图,多糖高产种源为老白沟、固阳、龙凤沟。基于各指标最高月份的单株生物量、多糖和主要次生代谢产物含量进行综合优良叶用种源的筛选,排名前3的种源为老白沟、固阳、鄂托克。综上所述,无论从特用型还是综合优良型进行评价,固阳、老白沟种源的排名均位居前2位,表现为单株叶生物量大、次生代谢物质含量高和产量高,适合作为优良叶用种源推广。(本文来源于《北方园艺》期刊2019年12期）
王文君[2]（2019）在《物种特异性和保守性DNA序列筛选及其在畜产品种源成分鉴定中的应用》一文中研究指出动物源性成分是一类来源于动物具有种属代表性的物质,可以是核酸、蛋白,也可以是各种脂类和小分子物质等。近年来,各种畜产品的掺假掺杂事件层出不穷,欧洲―马肉风波‖、中国―假羊肉事件‖等肉类掺假事件,饲料中非法添加反刍动物成分引起的疯牛病全球性传播等,这些畜产品安全问题严重影响肉类市场秩序和畜牧业的健康发展。对食品和饲料中动物源性成分的定性、定量检测是解决这一问题的重要技术手段。目前主要的检测方法是基于线粒体DNA(mtDNA)的PCR方法。然而,由于mtDNA在组织和个体间的拷贝数差异和碱基高变异性,使其易出现假阴性检测结果,且难以实现准确的定量,因而迫切需要筛选新的物种特异性的DNA序列。此外,肉类掺假检测中多物种通用内参的缺乏或保守性差等问题也影响畜产品定量检测的准确性。本研究利用动物全基因组序列和转录组信息,通过比较基因组学分析策略分别筛选物种特异性核DNA序列和多物种保守的核DNA序列,建立肉和饲料中多种动物源性成分的定性、定量检测方法。为满足畜产品安全监管部门对动物源性成分鉴别的系统化、多元化、快速化的迫切需求提供技术支撑。取得的主要结果如下:1.物种特异性DNA序列的筛选及其分子特征分析为了获得新的物种特异性DNA序列,本研究基于物种的全外显子序列,以独创的动态E-value结合Identity%、Quary-cover%为筛选条件,通过与Nt数据库、非目标物种基因组和目标物种基因组的3次本地BLASTN序列比对分析,根据物种的分类地位,在11个科的19个物种中筛选各物种特异性外显子。随后,将各物种的特异性外显子分为完全特异的外显子序列(CESS)和部分特异的外显子序列(PESS),并对其进行分布、结构和序列特征的分析发现:物种的特异性外显子占物种总外显子的比例很低,且与染色体的大小无关。其中的CESS主要分布在CDS区,且序列内部含有大量重复元件;长度较短的、高GC含量的外显子更易发生片段的完全缺失或增加,且其形成与序列上下游的同向重复序列以及序列内部的短重复序列有关。进一步利用各物种特异性DNA序列设计引物,并在19个物种中进行PCR检测,验证了序列和引物的物种特异性,实验结果说明筛选的物种特异性DNA序列可作为种源成分检测的靶标。2.基于物种特异性DNA序列建立肉制品及动物源性饲料中种源成分的定性PCR检测方法为了解决种源检测中靶序列单一匮乏、特异性和保守性差等问题,基于筛选获得的物种特异性DNA序列,建立了肉制品中牛、羊、猪、鸡和鸭源性成分的定性PCR检测方法。通过在线BLAST和ClustalW多序列比对分析,将物种特异性DNA序列分别与包含动物、植物和微生物在内的4个界、11个纲、21个目、36个科、47个属的53个代表性物种的参考基因组进行序列比对分析,发现各序列均具有高度的种间特异性和种内保守性。通过物种特异性引物设计并进行反应体系、反应条件优化,建立了5个物种5对引物相同反应程序(退火温度均为60℃)的PCR检测方法,实现了肉中牛、羊、猪、鸡、鸭成分的同时检测。所建立的PCR检测方法在19个物种中进行验证,结果表明5个物种的种源检测PCR方法具有高度的物种特异性,仅在目标物种中具有扩增产物,其他物种中无任何产物;同时利用5个物种的44个个体进行PCR扩增都得到预期的扩增产物,通过对PCR产物进行测序,在同一物种中的序列具有一致性,说明这些物种特异性序列在物种内具有高度的保守性。所建立的PCR检测方法,灵敏度均可达到0.5ng。进一步对牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉的熟肉制品进行检测,得到与产品种源成分一致的检测结果,说明本方法可用于加工肉食中种源成分的检测。针对疯牛病的饲料源性传播问题,筛选了牛科特异性基因TAF4,该基因在牛和羊中存在18bp片段差异,针对该差异片段设计一对牛羊通用引物,但扩增产物大小不同,通过一次PCR反应即可同时检测和鉴别牛(125bp)、羊(107bp)源性成分,并在23个物种中表现出高度的物种特异性。对牛(黄牛、牦牛、瘤牛、水牛)、羊(绵羊、山羊)不同品种进行PCR扩增和测序比对分析,结果表明该序列在牛、羊中都分别具有高度保守性。所建立的PCR检测方法,灵敏度可达到0.2ng DNA。最后,对5份委托制作的动物源性饲料的检测结果说明该方法具有检测饲料样品中牛、羊源性成分的能力,具有重要的应用价值。3.筛选哺乳动物和鸟类中高度保守的单拷贝序列作为多物种通用内参并建立定量检测方法定量检测是对畜产品掺假情况进行准确评估的一个重要方法。而可靠有效的定量内参是解决这一问题的前提。本文从全基因组水平出发,利用11个科的13个哺乳动物和鸟类物种的外显子数据,通过比较基因组学和生物信息学方法筛选了在哺乳动物和鸟类中同源率>95%的高度保守的核DNA序列,并在保守区设计了多物种通用引物。通过在18个动物物种基因组中试验验证发现,该序列具有高度保守性、且为单拷贝序列。基于多物种定量内参,进一步建立和优化了一种种源成分定量检测方法,相对误差(R.E.)和相对标准偏差(R.S.D.)均小于25%。并通过引入基因组当量(GE)和校正系数k的概念,实现了DNA混合样品中牛、兔、狗、狐、貂成分的更加精准的定量检测。为畜产品中种源成分的准确定量提供了可靠的多物种通用的定量内参和检测方法。4.基于多物种通用内参建立肉制品中多种动物源性成分的多重定量检测方法针对欧洲―马肉风波‖问题,结合牛、马的特异性DNA序列和多物种通用内参,建立了牛(223bp)、马(197bp)和动物(129bp)源性成分的叁重定性和定量检测方法;针对我国―假羊肉事件‖,结合羊、狐、鼠的特异性DNA序列和多物种通用内参,建立了羊(237bp)、狐(211bp)、鼠(160bp)源性成分的多重定性和定量检测方法。所有物种特异性序列均与包含动物、植物、微生物在内的53个物种的参考基因组进行BLAST和ClustalW序列比对,并在碱基差异区设计物种特异性引物和探针。利用普通PCR和TaqMan荧光PCR在多个物种DNA中对序列、引物和探针的特异性进行验证,并进而验证了各物种特异性序列均为固定拷贝数的序列。多重PCR体系的建立说明各组引物和探针之间不存在交叉互作,确保了单一体系中多种种源成分的同时检测和定量。保守性试验表明各物种特异性序列和引物在各自目标物种内的高度保守性。灵敏度检测结果表明检出限(LOD)为0.05ng DNA,定量限(LOQ)达5%。并通过构建各物种特异性序列和内参序列的标准曲线,建立了GE与Ct值的计算关系,对多组DNA混合样品和不同质量比的混合肉样品进行多重定量检测,R.E.和R.S.D.均小于25%,表明所建立的多重定量检测方法的具有良好的检测准确度和精确度。本研究利用比较基因组学方法筛选物种特异性核DNA序列用于种源成分检测;筛选保守性核DNA序列作为多物种定量内参。进而建立了肉和饲料中牛、羊、猪、马、鸡、鸭、狐等多种种源成分的定性和定量检测方法,为种源成分检测提供了相应的方法和候选素材,为食品和饲料安全提供重要的技术支撑。(本文来源于《华中农业大学》期刊2019-06-01）
谢春[3]（2019）在《环境因子对莼菜生长的影响及优质莼菜种源筛选》一文中研究指出药菜(Brasenia schreberiJ.F.Gmel)是睡莲科药属的一种多年生浮叶植物,其水下幼芽及卷叶被一层极厚的胶质包裹,是我国重要的水生蔬菜。栖息地缩小、生境破碎化、人类活动干扰等原因导致莼菜野生种群所剩无几,目前存在的大多为人工维护的半自然栽培种群,被列为我国Ⅰ级濒危重点保护植物,为保护莼菜先后在利川、杭州建立了种质资源保护区。前人研究显示,我国莼菜种群遗传多样性很低,莼菜主要产区苏州、杭州、利川及石柱等地均面临种性退化、品质下降、产量减少等问题。近年来,全球出现气候变暖、水质恶化等一系列环境问题,环境因子对莼菜生长的影响机制未有深入研究;已有研究显示不同产区莼菜表型特征有差异,导致差异的机制需要进一步分析;此外,莼菜叶色(叶背颜色)具有多态性,鲜有研究关注叶色多态性的潜在功能。为探讨上述一系列问题,并为莼菜的保护和应用提供理论依据,我们进行了以下叁部分实验:(1)比较生长季苏州、杭州和利川半自然莼菜样地水质、底泥、气温和莼菜幼芽、叶片特征的差异;(2)对苏州、杭州、利川和石柱的莼菜种源(SZ-P、HZ-P、LC-P和ShZ-P)进行同质园栽培实验,比较分析不同种源的莼菜幼芽及叶片表型特征的变异程度;(3)根据叶色特征,将莼菜分为深红(dark-red)、浅红(light-red)、边缘红(edge-red)和绿色(green)4个品种,对其叶绿素荧光参数、光合色素组成、气孔特征等进行比较分析。主要研究结果如下:(1)根据冗余分析(RDA)的结果,在测定的环境参数中,水质高锰酸盐指数(CODMn)、总氮(TNw)、电导率(ECw)和溶解氧(DOw),底泥有机碳(SOC)和全氮(TNs)是影响莼菜生长和胶质积累的主要因子,共解释了莼菜胶质积累及相关性状变化的82.2%。莼菜胶质含量(MucC)、胶质厚度(MucT)和单芽重(SBW)与CODMn、TNw、ECw显着负相关,与SOC和TNs显着正相关,卷叶长度(RLL)与DOw显着正相关。夏季高温可能对莼菜生长有抑制作用。结果表明清洁水质及肥沃底泥能促进莼菜的生长及胶质积累。(2)同质园栽培条件下,SZ-P和HZ-P的幼芽表型性状(MucC、MucT和SBW)、叶片表型性状(叶色,叶面积,叶长、叶宽及叶片长宽比)相近,LC-P和ShZ-P的上述表型性状相近。整体上,SZ-P和HZ-P的胶质积累高于LC-P和ShZ-P,生长状况较好。方差分析结果显示不同种源的表型性状存在显着差异,大部分表型变异存在于种群内部(约为70%)。该实验表明莼菜种群的表型变异可能是环境适应和遗传分化的共同结果,SZ-P和HZ-P的环境适应性较强。(3)4种叶色莼菜中,边缘红的所有叶绿素荧光参数及ETR(电子传递速率)曲线的拟合参数均最高(光抑制系数除外),浅红最低(除最大光化学量子产量、非光化学淬灭外);光合有效辐射高于2000μmol m-2s-1时,4种叶色莼菜光合作用均受到抑制。深红的光合色素含量最高,边缘红次之。从深红到绿色,随着红色的降低叶片干鲜比呈下降趋势。边缘红气孔密度(Ds)最大,气孔器面积(aagc)和气孔面积(aap)最小,浅红与其相反,但边缘红和浅红的气孔覆盖度(fgc)和气孔导度(gs)无显着差异。综合得出,边缘红的高光合效率可能与其气孔特征有关,前人研究显示小气孔对光等环境变化的响应更快速。上述研究表明,莼菜生长需要清洁的水质和肥沃的底泥,应加强莼菜栖息地尤其是水质的保护。在南京等高温地区,SZ-P和HZ-P的环境适应性较强,是较优种源。不同叶色莼菜光合生理特征差异显着,边缘红莼菜光合效率最高,初步确定为优质种源,根据边缘红莼菜所剩无几的现状,应尽快采取措施对其加以保护。(本文来源于《南京大学》期刊2019-05-01）
王彩云,侯俊,王永,查钦,张翔宇[4]（2019）在《黔西北优质半夏种源筛选》一文中研究指出为筛选出适宜黔西北地区栽培的优质半夏资源,以解决本地长期留种导致的种源退化、产量降低、块茎腐烂病发生率增高等问题,从贵州、山东、湖北、河北等省引进了半夏资源10份,比较了各半夏资源的产量、平均径围、百粒质量、病害发生情况以及总酸、浸出物、水分、灰分含量等。结果表明:不同居群半夏的生态学性状、产量、质量间存在明显差异,其中贵州赫章半夏的产量最高,其次为湖北潜江半夏;湖北潜江及湖北荆州半夏无块茎腐烂病情况发生;贵州赫章半夏的百粒质量及平均径围最大,其次为河南内乡半夏;湖南湘西半夏的总酸含量最高,其次为贵州赫章半夏;山西新绛半夏的浸出物含量最高,其次为贵州赫章半夏。来自贵州赫章和湖北潜江的半夏可作为高产半夏资源进一步观察试验;湖南湘西、山西新绛半夏可作为优质半夏种源进行栽培研究。(本文来源于《北方园艺》期刊2019年07期）
于丹,毕泉鑫,赵阳,崔艺凡,句娇[5]（2019）在《文冠果地理种源变异及优良种源筛选》一文中研究指出为了解不同种源文冠果种子和苗期性状变异规律及其与地理气候因子的关系,选择适宜辽宁省阜新市彰武县育苗的优良种源,测定了文冠果24个地理种源种子性状,并在辽宁省阜新市彰武县进行不同种源苗期试验。结果表明:文冠果种源间种子及苗期性状差异极显着,各性状的重复力为60.1%～98.2%,其中,种宽、种厚和种长的重复力较高,均达到95%以上;种宽与地径呈显着正相关,苗期各性状间均呈极显着正相关,海拔与种长、种宽、单粒质量,呈显着负相关,年均日照时间与种厚、苗高呈显着负相关,年均气温、年降水量、无霜期均与种子、苗期性状无显着相关性;利用多性状综合评定方法,初步选出阜新王府、辽宁海城、内蒙古扎鲁特以及内蒙古奈曼4个适宜辽宁省阜新市彰武县育苗的优良种源。(本文来源于《东北林业大学学报》期刊2019年02期）
王合,任争光,潘彦平,冯术快,林彩丽[6]（2018）在《北京市区古枣树单株种源抗枣疯病测定与抗病品种(系)筛选》一文中研究指出【目的】调查北京枣树资源,了解城区古枣树对枣疯病的遗传抗性状况,为抗枣疯病品种的开发与利用提供基础数据。【方法】通过采集健康的古枣树单株接穗,利用嫁接传病的方法在北京疯枣园内开展抗枣疯病能力鉴定和抗病品系选育工作。【结果】自2012年始,在怀柔区经过对嫁接到发病砧木上的接穗的发病情况跟踪调查、数据统计分析和病原PCR检测,初步从147种接穗中筛选出具有一定抗病能力的接穗45种,其表现为嫁接接穗症状轻或无、病菌扩展与增殖慢、平均病情指数低等。2013年在昌平区的复筛试验中,进一步依据月度病情指数调查数据,从上述45种接穗中确定一批具有抗枣疯病能力稳定的品系。最后结合2014年的调查结果优先推选出7种正常生长结果、园艺学性状良好,具有利用价值前景的枣树品系。【结论】研究结果初步明确北京市古枣树中具有一定抗枣疯病能力的资源,筛选出具有一定抗病能力的古枣树株系,为今后抗枣疯病的枣树品种开发利用和病害防控提供重要资源和依据。(本文来源于《林业科学》期刊2018年08期）
龚斌,龚春,黄建建,唐仕斌,刘蕾[7]（2018）在《青钱柳地理种源生长差异及速生优良种源初步筛选》一文中研究指出本文对江西、湖南、湖北、广东及贵州等5省共15个青钱柳地理种源的生长差异进行分析,结果表明青钱柳种源的平均保存率为89.7%,在种源间存在极显着差异,其中保存率最高的为江西修水种源,为96.5%;保存率最低的为湖北五峰种源,仅为81.6%。调查结果还发现青钱柳在地径生长上,其变化幅度整体高于树高和冠幅;15个地理种源间,以湖北神农架种源的树高变异系数最大,说明该种源青钱柳个体间在幼林期表现更大的生长差异,万年青钱柳种源的树高变异系数最小,仅为7.28%,说明该种源个体间在树高生长上的分化程度更趋于一致;贵州凯里种源的地径及冠幅的变异系数最高,分别为35.10%、9.35%,说明该种源在幼林期时表现出较高的个体生长差异,遗传变异程度较高。综合考虑树高、地径及冠幅的生长指标,宜丰、万年及修水种源表现较好,其中宜丰种源表现最好。宜丰种源的平均树高、地径分别达到208.6 cm、27.729 mm,树高生长较万年种源和修水种源分别提高14.43%、20.86%;地径生长较万年种源和修水种源分别提高10.80%和16.20%;且该种源内的个体间生长差异较小,均匀度相对较高,是15个地理种源中造林时的首选种源。(本文来源于《南方林业科学》期刊2018年02期）
卢江泽,袁德义,肖诗鑫,邹锋,李建中[8]（2018）在《锥栗不同种源优株种仁褐变差异性分析及评价筛选》一文中研究指出【目的】挖掘种仁抗褐化能力强的锥栗资源,筛选出果实适合深加工型的锥栗良种。【方法】从96份笔者课题组前期调查的资源中优选30份不同锥栗种质资源的种仁,通过对其种仁褐变程度、总酚和维生素C含量的测定,根据不同优株果实种仁褐变差异性及其内含成分进行聚类分析和相关性分析。【结果】锥栗种仁褐变程度差异显着,种仁抗褐化能力与褐变指数呈负相关,在30份资源中,ZNL-1、JZPYS-1与ZNL-15褐变指数较小,分别为0.067、0.083与0.150,ZNL-4和ZNL-13褐变指数较大,分别为0.600与0.650;30份种仁总酚含量差异显着,种仁褐变与总酚的含量呈正相关,其中ZNL-15种仁中总酚含量最低,为27.91 mg·100 g~(-1),而ZNL-13的种仁中总酚含量最高,为229.65 mg·100 g~(-1),为最低的8.2倍,同时褐变程度也最高;维生素C含量差异较显着,种仁褐变与维生素C含量的相关性弱,其中ZNL-15维生素含量高达67.23 mg·100 g~(-1),是含量最低ZNL-2的2.1倍。【结论】种仁抗褐变的优株为ZNL-1、ZNL-15与JZPYS-1,可用作锥栗杂交培育新品种的亲本,向锥栗产品深加工与利用方面拓展挖掘。(本文来源于《果树学报》期刊2018年06期）
周恺麟,吕伟旗,汤晟凌[9]（2018）在《商陆水溶性浸出物、商陆皂苷甲含量变异规律与优良种源筛选》一文中研究指出目的:为商陆种质资源利用与优良品种选育提供依据。方法:收集全国主分布区商陆野生种质资源23份,考察其经纬度、海拔、农艺性状,用热浸法测定块根水溶性浸出物含量,用HPLC-ELSD法测定块根商陆皂苷甲含量,用DPS 6.55,Excel 2003软件进行单因素方差分析、相关性分析、主成分分析与聚类分析。结果:商陆不同种源间农艺性状存在显着差异(P<0.05),其中福建、广西种源生长势好,植株高大,茎粗,叶片大而多狭长,块根产量高;不同种源间水溶性浸出物、商陆皂苷甲含量也存在显着差异(P<0.05),2个成分变异规律相似,与种源地、经纬度、海拔、农艺性状存在相关性,其中陕西、浙江种源含量较高;与株高、茎粗、叶片长、叶片宽、叶柄长、块根纵径、块根横径、块根产量呈负相关关系,与根形指数、纬度、海拔呈正相关关系,与叶形指数、经度相关性较低;12个生长与成分性状指标可简化为5个主成分,累计贡献率达93.611 9%;23个种源可划分为5类。结论:高纬度、高海拔种植商陆有利于块根中水溶性浸出物与商陆皂苷甲含量积累;共筛选出5个农艺性状优良种源与4个高成分含量优良种源,可作为高产、优质商陆品种选育备选种质。(本文来源于《中国实验方剂学杂志》期刊2018年04期）
谢嗣荣[10]（2017）在《沙棘优良种源的初步筛选》一文中研究指出沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是集药用、保健、用材和观赏等多种价值于一身的生态经济型树种,具有极大的开发利用前景。本研究以沙棘自然分布区内5个省份(自治区)10个产地的种子及其一年生播种苗为研究对象,以优良种子品质和优良药用种源的筛选为目的,对不同种源的种子性状、1年生苗木的生长及叶片中药用成分的含量进行了系统的研究,采用隶属函数法对各种源的种子品质和1年生苗木进行了综合评价,为沙棘的良种选育进一步开展及沙棘的开发利用提供了理论依据。主要研究结果如下:(1)不同沙棘种源种子的性状、播种品质及主要营养成分含量差异均达到极显着水平。不同沙棘种源种子发芽率均很高,平均发芽率达到87%。各种源的种子性状,以龙凤沟和老白沟种源稳定性最高。(2)不同沙棘种源1年生苗木的苗高、地径生长和叶生物量的差异均达到极显着水平。各种源沙棘1年生苗木的苗高和地径生长规律都呈明显的“S”型生长曲线,且均在6月份时月增长量最高。固阳种源苗高年增长量和叶生物量最大,鄂托克种源地径年增长量最大。(3)不同种源沙棘1年生苗木的净光合速率、蒸腾速率和气孔导度的差异均达到极显着水平。苗木净光合速率与原产地海拔呈显着正相关,胞间CO2浓度与原产地纬度呈显着正相关。(4)各种源1年生苗木叶片中药用成分含量及产量的差异均达到极显着差异水平,但不同药用成分含量高低出现的时间不同。黄酮类化合物、Fe和Mg含量最高的时间为7月份,叁萜类化合物为9月份,多糖为6月份。(5)各种源沙棘1年生苗木叶片中,黄酮类、叁萜以及多糖的含量与地理环境因子没有显着的相关性。Fe的含量与原产地年均降水量呈显着负相关,Mg的含量与原产地纬度呈显着正相关。(6)综合评价结果表明,龙凤沟和老白沟种源种子品质最好,固阳和老白沟种源是苗期表现较为优良的药用种源。(本文来源于《南京林业大学》期刊2017-06-01）
种源筛选论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
动物源性成分是一类来源于动物具有种属代表性的物质,可以是核酸、蛋白,也可以是各种脂类和小分子物质等。近年来,各种畜产品的掺假掺杂事件层出不穷,欧洲―马肉风波‖、中国―假羊肉事件‖等肉类掺假事件,饲料中非法添加反刍动物成分引起的疯牛病全球性传播等,这些畜产品安全问题严重影响肉类市场秩序和畜牧业的健康发展。对食品和饲料中动物源性成分的定性、定量检测是解决这一问题的重要技术手段。目前主要的检测方法是基于线粒体DNA(mtDNA)的PCR方法。然而,由于mtDNA在组织和个体间的拷贝数差异和碱基高变异性,使其易出现假阴性检测结果,且难以实现准确的定量,因而迫切需要筛选新的物种特异性的DNA序列。此外,肉类掺假检测中多物种通用内参的缺乏或保守性差等问题也影响畜产品定量检测的准确性。本研究利用动物全基因组序列和转录组信息,通过比较基因组学分析策略分别筛选物种特异性核DNA序列和多物种保守的核DNA序列,建立肉和饲料中多种动物源性成分的定性、定量检测方法。为满足畜产品安全监管部门对动物源性成分鉴别的系统化、多元化、快速化的迫切需求提供技术支撑。取得的主要结果如下:1.物种特异性DNA序列的筛选及其分子特征分析为了获得新的物种特异性DNA序列,本研究基于物种的全外显子序列,以独创的动态E-value结合Identity%、Quary-cover%为筛选条件,通过与Nt数据库、非目标物种基因组和目标物种基因组的3次本地BLASTN序列比对分析,根据物种的分类地位,在11个科的19个物种中筛选各物种特异性外显子。随后,将各物种的特异性外显子分为完全特异的外显子序列(CESS)和部分特异的外显子序列(PESS),并对其进行分布、结构和序列特征的分析发现:物种的特异性外显子占物种总外显子的比例很低,且与染色体的大小无关。其中的CESS主要分布在CDS区,且序列内部含有大量重复元件;长度较短的、高GC含量的外显子更易发生片段的完全缺失或增加,且其形成与序列上下游的同向重复序列以及序列内部的短重复序列有关。进一步利用各物种特异性DNA序列设计引物,并在19个物种中进行PCR检测,验证了序列和引物的物种特异性,实验结果说明筛选的物种特异性DNA序列可作为种源成分检测的靶标。2.基于物种特异性DNA序列建立肉制品及动物源性饲料中种源成分的定性PCR检测方法为了解决种源检测中靶序列单一匮乏、特异性和保守性差等问题,基于筛选获得的物种特异性DNA序列,建立了肉制品中牛、羊、猪、鸡和鸭源性成分的定性PCR检测方法。通过在线BLAST和ClustalW多序列比对分析,将物种特异性DNA序列分别与包含动物、植物和微生物在内的4个界、11个纲、21个目、36个科、47个属的53个代表性物种的参考基因组进行序列比对分析,发现各序列均具有高度的种间特异性和种内保守性。通过物种特异性引物设计并进行反应体系、反应条件优化,建立了5个物种5对引物相同反应程序(退火温度均为60℃)的PCR检测方法,实现了肉中牛、羊、猪、鸡、鸭成分的同时检测。所建立的PCR检测方法在19个物种中进行验证,结果表明5个物种的种源检测PCR方法具有高度的物种特异性,仅在目标物种中具有扩增产物,其他物种中无任何产物;同时利用5个物种的44个个体进行PCR扩增都得到预期的扩增产物,通过对PCR产物进行测序,在同一物种中的序列具有一致性,说明这些物种特异性序列在物种内具有高度的保守性。所建立的PCR检测方法,灵敏度均可达到0.5ng。进一步对牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉的熟肉制品进行检测,得到与产品种源成分一致的检测结果,说明本方法可用于加工肉食中种源成分的检测。针对疯牛病的饲料源性传播问题,筛选了牛科特异性基因TAF4,该基因在牛和羊中存在18bp片段差异,针对该差异片段设计一对牛羊通用引物,但扩增产物大小不同,通过一次PCR反应即可同时检测和鉴别牛(125bp)、羊(107bp)源性成分,并在23个物种中表现出高度的物种特异性。对牛(黄牛、牦牛、瘤牛、水牛)、羊(绵羊、山羊)不同品种进行PCR扩增和测序比对分析,结果表明该序列在牛、羊中都分别具有高度保守性。所建立的PCR检测方法,灵敏度可达到0.2ng DNA。最后,对5份委托制作的动物源性饲料的检测结果说明该方法具有检测饲料样品中牛、羊源性成分的能力,具有重要的应用价值。3.筛选哺乳动物和鸟类中高度保守的单拷贝序列作为多物种通用内参并建立定量检测方法定量检测是对畜产品掺假情况进行准确评估的一个重要方法。而可靠有效的定量内参是解决这一问题的前提。本文从全基因组水平出发,利用11个科的13个哺乳动物和鸟类物种的外显子数据,通过比较基因组学和生物信息学方法筛选了在哺乳动物和鸟类中同源率>95%的高度保守的核DNA序列,并在保守区设计了多物种通用引物。通过在18个动物物种基因组中试验验证发现,该序列具有高度保守性、且为单拷贝序列。基于多物种定量内参,进一步建立和优化了一种种源成分定量检测方法,相对误差(R.E.)和相对标准偏差(R.S.D.)均小于25%。并通过引入基因组当量(GE)和校正系数k的概念,实现了DNA混合样品中牛、兔、狗、狐、貂成分的更加精准的定量检测。为畜产品中种源成分的准确定量提供了可靠的多物种通用的定量内参和检测方法。4.基于多物种通用内参建立肉制品中多种动物源性成分的多重定量检测方法针对欧洲―马肉风波‖问题,结合牛、马的特异性DNA序列和多物种通用内参,建立了牛(223bp)、马(197bp)和动物(129bp)源性成分的叁重定性和定量检测方法;针对我国―假羊肉事件‖,结合羊、狐、鼠的特异性DNA序列和多物种通用内参,建立了羊(237bp)、狐(211bp)、鼠(160bp)源性成分的多重定性和定量检测方法。所有物种特异性序列均与包含动物、植物、微生物在内的53个物种的参考基因组进行BLAST和ClustalW序列比对,并在碱基差异区设计物种特异性引物和探针。利用普通PCR和TaqMan荧光PCR在多个物种DNA中对序列、引物和探针的特异性进行验证,并进而验证了各物种特异性序列均为固定拷贝数的序列。多重PCR体系的建立说明各组引物和探针之间不存在交叉互作,确保了单一体系中多种种源成分的同时检测和定量。保守性试验表明各物种特异性序列和引物在各自目标物种内的高度保守性。灵敏度检测结果表明检出限(LOD)为0.05ng DNA,定量限(LOQ)达5%。并通过构建各物种特异性序列和内参序列的标准曲线,建立了GE与Ct值的计算关系,对多组DNA混合样品和不同质量比的混合肉样品进行多重定量检测,R.E.和R.S.D.均小于25%,表明所建立的多重定量检测方法的具有良好的检测准确度和精确度。本研究利用比较基因组学方法筛选物种特异性核DNA序列用于种源成分检测;筛选保守性核DNA序列作为多物种定量内参。进而建立了肉和饲料中牛、羊、猪、马、鸡、鸭、狐等多种种源成分的定性和定量检测方法,为种源成分检测提供了相应的方法和候选素材,为食品和饲料安全提供重要的技术支撑。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
种源筛选论文参考文献
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