论文摘要
LIS1（Lissencephaly 1,也叫PAFAH1B1）对于动力蛋白Dynein所介导的胞内物质运输及高尔基体、胞内体、溶酶体和线粒体的正确定位是必需的。Lisl基因也是第一个被确认与神经元迁移疾病有关的基因,它在人体中的杂合缺失会导致严重的大脑畸形疾病,该疾病主要表现为脑回的缺失,灰质体积的增加以及白质体积的减少,因而称之为无脑回畸形疾病。近几年来,对于Lisl基因的功能研究主要集中在大脑神经系统发育以及无脑回疾病致病机理上,而对于Lisl基因在其他组织器官发育中的功能知之甚少。为了探究Lisl基因在组织器官发育过程中的相关功能,我们分别建立了肺上皮细胞Lisl基因特异性敲除小鼠模型以及四肢间充质细胞Lisl基因特异性敲除小鼠模型。通过对E18.5的小鼠胚胎的表型分析,我们发现Lis1 KO小鼠胚胎肺和四肢未形成。对小鼠早期胚胎肺和四肢进行TUNEL以及pHH3染色,我们发现Lisl KO小鼠胚胎肺上皮细胞和四肢间充质细胞中存在大量的细胞凋亡,而细胞增殖却与对照小鼠无差异。进一步通过对小鼠胚胎进行原位杂交实验,我们发现FGF信号通路下游靶基因在Lisl KO小鼠胚胎肺和四肢中的表达位置存在异常,并且其表达强度也低于对照小鼠。此外,对E10.5时期Lisl KO小鼠前肢进行RNA Seq测序分析,我们发现Lisl基因的敲除的确会影响FGF信号通路的正确转导。与此同时,通过利用KrasLSL-Gl2D/+转基因小鼠模型来激活FGF信号通路下游的MAPK信号通路,我们发观ShhCre;Lislf/f;KrasLSL-Gl2D/+以及Prxl Cre;Lislf/f;Kras LSL-Gl2D/+小鼠胚胎肺和四肢的发育缺陷会得到部分的修复。这个结果进一步说明Lisi KO小鼠的肺与四肢中FGF信号通路被抑制。为了在细胞及分子水平研究Lis1基因如何调控FGF信号通路,我们分离并建立了永生化的Lislf/f MEF（小鼠胚胎成纤维）细胞,在细胞水平上进一步验证发现当Lisl基因在MEF细胞中被敲除后,FGF信号通路的转导会出现阻滞。通过免疫共沉淀实验,我们发现LIS1及其相互作用蛋白NDE1/NDEL1与FGF受体在体内存在一定的相互作用。并且,免疫荧光以及Western Blotting实验结果也显示LIS1能够调控FGF受体在胞内的定位以及蛋白质稳定性。值得注意的是,FGF信号通路的激活还能促进NDE1酪氨酸磷酸化,随后,进一步导致LIS1/NDE1复合物发生解离。因此,我们的研究结果表明,LIS1对于小鼠胚胎肺和四肢的正常发育至关重要。并且,我们的研究也确定了LIS1/NDE1复合物是FGF信号通路的一个重要调节因子,为FGF受体在细胞内转运机制和内吞作用的双向调节提供了新的见解,更重要的是,我们的研究也为阐明LIS1/NDE1突变所导致相关遗传疾病的分子机制提供了一个新的方向。
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致谢中文摘要Abstract缩略词清单第1章 引言 1.1 LIS1的研究概况 1.1.1 LIS1与无脑回疾病的关系 1.1.2 LIS1的蛋白结构及其相关生理功能 1.1.3 LIS1与肿瘤发生的关系 1.2 小鼠肺的研究概况 1.2.1 小鼠呼吸系统及其相关结构 1.2.2 小鼠肺的发育过程 1.2.3 小鼠肺发育过程中的信号调控 1.2.4 小鼠肺发育过程中的转录调控 1.3 小鼠肢体的研究概况 1.3.1 小鼠肢体的发育过程 1.3.2 小鼠早期肢体规范的形成 1.3.3 小鼠肢体发育过程中的信号反馈回路 1.4 FGF信号通路的研究概况 1.4.1 FGF信号通路概述 1.4.2 FGF信号通路与早期胚胎发育 1.4.3 FGF信号通路与癌症第2章 实验材料与研究方法 2.1 实验材料 2.1.1 菌种 2.1.2 细胞系 2.1.3 小鼠模型 2.1.4 质粒 2.1.5 抗体 2.1.6 试剂与试剂盒 2.1.7 实验仪器 2.1.8 实验溶液及其配制 2.2 研究方法 2.2.1 质粒DNA的构建与制备 2.2.2 细胞的复苏、培养与冻存 2.2.3 细胞转染 2.2.4 shRNA慢病毒的包装 2.2.5 RNA的分离与提取 2.2.6 RNA的逆转录 2.2.7 实时荧光定量PCR 2.2.8 蛋白质免疫印迹法检测蛋白的表达 2.2.9 组织的石蜡包埋与切片 2.2.10 冰冻切片的制备 2.2.11 组织的H&E染色 2.2.12 阿尔新蓝/茜素红S染色 2.2.13 免疫组织化学 2.2.14 免疫组织化学荧光染色 2.2.15 贴壁细胞的免疫荧光染色 2.2.16 免疫共沉淀 2.2.17 小鼠基因型的鉴定 2.2.18 TUNEL法检测细胞凋亡 2.2.19 体外激酶实验 2.2.20 成纤维细胞生长因子受体内吞实验 2.2.21 小鼠胚胎成纤维细胞的分离 2.2.22 小鼠胚胎成纤维细胞的永生化处理 2.2.23 小鼠胎肺Whole-Mount染色 2.2.24 溶酶体红色荧光探针染色 2.2.25 小鼠胚胎X-gal染色 2.2.26 细胞表面蛋白的生物素化及分析 2.2.27 考马斯亮蓝R250染色 2.2.28 RNA seq样品的处理及生物学注释分析 2.2.29 小鼠胚胎原位杂交实验 2.2.30 数据处理与统计分析第3章 实验结果与分析 3.1 LIS1组织特异性敲除小鼠模型的构建 3.2 LIS1在肺上皮细胞中缺失会导致小鼠胚胎肺发育异常 3.3 LIS1在四肢间充质细胞中缺失会导致小鼠胚胎四肢发育异常 3.4 LIS1在肺上皮细胞与四肢间充质细胞中缺失均会导致细胞凋亡 3.5 LIS1缺失会导致FGF信号通路下游靶基因表达异常 3.6 LIS1在肺上皮细胞与四肢间充质细胞中缺失均不影响胚胎的发育模式 3.7 RNA-Seq分析发现LIS1缺失会导致相关信号通路及细胞生理活动异常 3.8 激活RAS-MAPK信号通路能部分修复LIS1缺失所致的发育缺陷 3.9 LIS1在MEF细胞中缺失会导致FGF信号通路激活受阻 3.10 LIS1/NDE1复合物与FGF受体存在相互作用 3.11 LIS1缺失会影响FGF受体蛋白的稳定性及其胞内定位 3.12 LIS1缺失促使FGFR2b靶向通过溶酶体途径降解 3.13 FGFR1促进NDE1酪氨酸磷酸化以及LIS1/NDE1复合物分离第4章 讨论参考文献附录 1. qPCR引物 2. 小鼠基因型鉴定引物作者简历与科研成果
文章来源
类型: 博士论文
作者: 刘连胜
导师: 宋海
关键词: 无脑回畸形疾病,信号通路,上皮细胞,间充质细胞
来源: 浙江大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 浙江大学
分类号: Q344
总页数: 173
文件大小: 12087K
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标签：无脑回畸形疾病论文; 信号通路论文; 上皮细胞论文; 间充质细胞论文;
