我国部分地区鸡星状病毒病分子流行病学调查及绝对定量检测方法的建立

论文摘要

近年来,禽类星状病毒对家禽业的影响受到了世界范围内的广泛关注。其中鸡星状病毒（Chicken astrovirus,CAstV）可单独引起雏鸡肾炎、腹泻性肠炎及发育缓慢等症状,是导致雏鸡腹泻、痛风等疾病的重要病原体之一。目前我国鸡星状病毒病分子流行病学调查的结果还未见公开报道,为了解CAstV在我国鸡群中的流行情况,本研究开展了我国部分地区鸡星状病毒病分子流行病学调查工作,建立了检测鸡星状病毒的绝对荧光定量方法,同时还分离了一株鸡星状病毒,为进一步研究鸡星状病毒生物学功能提供了技术手段和生物材料。1.我国部分地区鸡星状病毒病流行病学调查本研究自2017～2018年,从江苏省、安徽省、山东省和广东省的7个地区采集了 195份样品,进行PCR检测鸡星状病毒的感染情况。实验结果表明,41份成年鸡样本中仅1份阳性样本,阳性率为2.44%,而154份1日龄雏鸡样本的阳性率高达82.47%（127/154）,综合阳性率为65.64%。测序结果分析比对显示,阳性样品包含7个毒株,全部属于鸡星状病毒。遗传分析结果表明,我国鸡群中同时存在I型和II型鸡星状病毒。从检测结果来看,与以往国外报道相似,低日龄雏鸡更容易检测到病毒,而成年鸡检测率较低。2.鸡II型星状病毒绝对定量qRT-PCR检测方法的建立到目前为止,尚无针对CAstV定量检测方法的相关研究。本研究通过鸡星状病毒RNA酶依赖的RNA聚合酶（RdRp）基因的研究,成功的建立针对II型鸡星状病毒绝对定量qRT-PCR的方法。设计了针对CAstV-RdRp基因特异性的引物并成功制备了阳性质粒标准品,利用该方法检测病毒在LMH细胞中增殖情况。结果表明,CAstV感染LMH细胞早期虽无明显病变,但病毒可以在LMH细胞中生长繁殖。本研究建立的检测CAstV-RdRp基因绝对定量PCR方法为研究病毒致病性以及生物学功能提供了一种检测技术手段。3.鸡星状病毒分离鉴定及全基因组测序分析为了进一步对国内流行CAstV进行更深入的研究,本研究使用鸡肝癌细胞系（LMH）对CAstV病毒进行了分离和鉴定。结果显示,病毒可以在LMH细胞中增殖,并盲传4代后可产生细胞病变。利用LMH细胞分离到了一株CAstV,命名为CAstVNJ1701株,属于II型鸡星状病毒。随后对其近全长基因组进行PCR扩增和测序,结果得到基因组长度为7492核苷酸,其结构特点与已发表的鸡星状病毒基因组结构特点相似,包括ORF1a、ORF1b和ORF2三个开放阅读框。将三个开放阅读框进行遗传进化分析,结果显示本研究分离的CAstV NJ1701株与CAstV FP3株的同源性较高,通过ORF2衣壳蛋白分类,可划分为CAstV B1群;CAstV NJ1701株ORF1a和ORF1b基因序列与其他CAstV的ORF1a和ORF1b序列同源性较低,处于一个相对独立的分支。4.病毒接种鸡胚致病性实验将分离的病毒通过卵黄囊接种6日龄鸡胚,盲传4代后发现鸡胚有明显致弱和致死现象,qRT-PCR检测也证实病毒可以在鸡胚中增殖。病毒接种鸡胚孵化率实验结果表明,30枚病毒接种鸡胚,仅11鸡胚孵化成功,孵化率为36.67%。死亡的鸡胚生长发育出现明显问题,呈现侏儒胚现象,说明鸡星状病毒感染可以导致鸡群孵化率降低。通过研究内容二所建立的方法,检测了 RdRp基因在雏鸡20个组织中的表达情况。结果表明,CAstV病毒基因雏鸡盲肠中表达量最高,其次是肾脏,而在心脏中表达量最低,这一结果为将来临床检测样品的采集提供依据。

论文目录

摘要

Abstract

符号说明

文献综述

1 星状病毒概述

1.1 星状病毒基因组结构

1.2 星状病毒分类

1.3 星状病毒研究现状

1.4 星状病毒分离检测技术

1.5 星状病毒病的预防及治疗手段

2 禽星状病毒概述

2.1 鸡星状病毒

2.1.1 鸡星状病毒历史及流行情况

2.1.2 鸡星状病毒基因组结构及分类

2.1.3 鸡星状病毒的致病性

2.1.4 鸡星状病毒检测技术及分离方法

2.1.5 鸡星状病毒病的防治

2.2 鸭星状病毒

2.3 火鸡星状病毒

2.4 禽肾炎病毒

2.5 鹅星状病毒病毒

3 本研究目的与意义

研究内容一我国部分地区鸡星状病毒病分子流行病学调查

1 材料与方法

1.1 病料采集

1.2 主要试剂与生物材料

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 引物设计

2.2 样本处理

2.3 组织中总RNA的提取

2.4 cDNA的合成

2.5 样本PCR检测

2.6 阳性样本的胶回收

2.7 目的片段的T载体连接

2.8 连接产物的转化

2.9 阳性质粒的鉴定

2.10 遗传变异分析

3 结果

3.1 鸡星状病毒RT-PCR检测结果

3.2 鸡星状病毒部分RdRp基因测序比对分析

4 讨论

研究内容二鸡Ⅱ型星状病毒绝对定量检测方法的建立

1 材料与方法

1.1 生物材料

1.2 主要仪器

2 方法

2.1 引物设计与合成

2.2 阳性标准品制备

2.3 绝对定量检测方法的建立及标准曲线的绘制

2.4 绝对定量检测方法的特异性试验

2.5 绝对定量检测方法重复性和稳定性试验

2.6 CAstV感染LMH细胞后CAstV-RdRp基因拷贝数检测

3 结果

3.1 阳性标准品的制备

3.2 CAstV-RdRp绝对定量检测方法的建立

3.2.1 CAstV-RdRp绝对定量检测方法标准曲线的建立

3.2.2 绝对定量real-time PCR方法的特异性分析

3.3 CAstV感染LMH细胞RdRp基因表达的绝对定量检测

4 讨论

研究内容三鸡星状病毒分离鉴定及全基因组测序分析

1 材料与方法

1.1 主要试剂与生物材料

1.2 主要仪器

2 方法

2.1 病毒的分离与增殖

2.1.1 样品处理

2.1.2 肠道组织中常见家禽病毒的检测

2.1.3 利用鸡肝癌细胞系分离病毒

2.1.4 病毒的浓缩

2.1.5 多抗血清的制备

2.1.6 激光共聚焦实验

2.2 NJ1701株基因组测序

2.2.1 PCR引物设计

2.2.2 病毒总RNA的提取

2.2.3 cDNA合成

2.2.4 病毒基因组片段扩增

2.2.5 PCR产物粘性末端制备

2.2.6 目的片段的胶回收、连接与转化

2.2.7 阳性质粒的挑选与鉴定

2.3 病毒基因组测序结果分析

2.3.1 遗传进化分析

2.3.2 生物信息学分析

3 结果

3.1 病毒的分离与鉴定

3.1.1 病毒分离与IFA检测

3.1.2 分离病毒的RT-PCR鉴定

3.2 CAstV NJ1701基因组测序及比对分析

3.2.1 CAstV NJ1701基因组不同片段RT-PCR扩增结果

3.2.2 CAstV基因组片段克隆及酶切鉴定结果

3.3 CAstV NJ1701基因组序列比对分析

3.3.1 CAstV NJ1701基因组的遗传进化分析

3.3.2 CAstV NJ1701的生物信息学分析

4 讨论

研究内容四鸡星状病毒鸡胚接种试验

1 材料与方法

1.1 主要试剂与生物材料

1.2 主要仪器

2 方法

2.1 病毒悬液处理

2.2 病毒接种鸡胚增殖实验

2.3 病毒对鸡胚孵化率的影响

2.4 雏鸡不同组织脏器中病毒基因拷贝数检测

3 结果

3.1 鸡胚传毒结果

3.2 病毒对鸡胚生长发育的影响

3.3 雏鸡不同组织脏器中病毒基因拷贝数检测结果

4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 武宗仪

导师: 钱琨,秦爱建,刘岳龙

关键词: 鸡星状病毒,病毒分离,遗传进化分析,绝对定量,鸡胚接种实验

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 国家重点研发计划(项目号:2016YFD0500800),江苏省优势学科建设项目

分类号: S852.65;S858.31

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000218

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我国部分地区鸡星状病毒病分子流行病学调查及绝对定量检测方法的建立

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