let-7a-2-3p/PIK3CG模块对结核分枝杆菌感染的巨噬细胞凋亡水平的动态调控机制研究

论文摘要

结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）感染引起的慢性传染病,尽管人类与结核病斗争千年,但是在全球范围内,每年仍有1000万人罹患结核病,其致病机制及宿主抗感染免疫机制的不明确,严重阻碍了结核病诊断与治疗的发展。巨噬细胞是宿主抵御结核分枝杆菌感染传播的重要屏障,亦是结核分枝杆菌栖息和繁殖的主要场所。micro RNAs（mi RNAs）作为基因转录后调控的表观遗传学调节剂,参与了多种生物学过程,尤其是病原体致病过程的多个方面。巨噬细胞在应答结核分枝杆菌感染的过程中mi RNAs的表达变化,可以影响其庞大的靶基因调控网络,进而调节宿主免疫应答相关的进程与通路。因此,系统地、深入地挖掘巨噬细胞免疫应答结核分枝杆菌感染过程中mi RNAs及其靶基因的表达变化,构建mi RNA-m RNA免疫应答调控网络,探索宿主抗感染过程中的重要功能调控模块,对阐明结核分枝杆菌致病机制及宿主抗感染免疫机制具有重要意义,同时为结核病新疗法的发现和临床诊断水平的提高奠定夯实的理论基础。本研究中,我们建立了结核分枝杆菌（H37Ra减毒株和H37Rv标准株）感染巨噬细胞的模型,通过转录组测序技术（RNA-seq）测得模型样本mi RNAs与m RNAs表达谱,应用生物信息学方法分析mi RNAs及m RNAs的表达水平变化,充分挖掘差异表达的mi RNAs及m RNAs,提取H37Ra减毒株和H37Rv标准株感染模型中共同差异的mi RNAs和m RNAs,构建结核分枝杆菌体外感染巨噬细胞模型中的mi RNA-m RNA调控网络,并进一步挖掘宿主应答结核分枝杆菌感染过程中显著的分子调控模块。与此同时,我们识别在潜伏结核感染（Latent tuberculosis infection,LTBI）人群外周血单核细胞（Peripheral blood monouclear cells,PBMCs）中差异表达的mi RNAs与m RNAs,构建潜伏结核感染相关的特异mi RNA-m RNA调控网络,通过结核分枝杆菌体外感染巨噬细胞mi RNA-m RNA调控网络,与潜伏结核感染人群PBMCs中特异的mi RNA-m RNA调控网络对比分析,发现两个网络中PI3K-Akt信号通路均显著富集。我们在体外感染模型的mi RNA-m RNA调控网络中,鉴定出了let-7a-2-3p/PIK3CG模块的异常表达对巨噬细胞凋亡有抑制作用,同时也对巨噬细胞促炎因子—肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌有促进作用,一定程度上增强了巨噬细胞的炎症反应。第一部分结核分枝杆菌感染THP-1来源巨噬细胞模型的建立及mi RNAs与m RNAs表达谱测序分析H37Ra减毒株和H37Rv标准株以10:1的感染复数分别感染巨噬细胞建立感染模型,激光共聚焦显微镜观察显示结核分枝杆菌与溶酶体共定位;感染细胞上清液ELISA结果显示,随着感染时间的延长,促炎因子TNF-α分泌量不断增加,两个实验结果均提示结核分枝杆菌感染THP-1来源巨噬细胞模型建立成功。应用RNA-seq获得3组（H37Ra减毒株感染组、H37Rv标准株感染组、对照组）9个样本（每组3个平行样本）的表达谱数据,并通过生物信息学工具分析mi RNAs与m RNAs差异表达情况。筛选出H37Ra减毒株感染组中差异表达的mi RNAs为184个,其中上调表达的112个,下调表达的72个,差异表达的基因3938个,其中上调表达的1457个,下调表达的2481个;而H37Rv标准株感染组中差异表达的mi RNAs为198个,其中上调表达的102个,下调表达的96个,差异表达的基因为4750个,其中上调表达的1668个,下调表达的3082个。q RT-PCR验证H37Ra减毒株感染组与H37Rv标准株感染组mi RNAs及m RNAs差异表达谱中,共同差异的且差异最为显著的5个mi RNAs和5个m RNAs,验证结果与测序数据分析结果趋势一致,说明通过测序获取的差异mi RNAs和m RNAs表达谱数据较为真实可靠,可用于后续分析研究。第二部分结核分枝杆菌体外感染模型与临床潜伏感染人群PBMCs中mi RNA-m RNA调控网络共性特征分析筛选出H37Ra减毒株感染组与H37Rv标准株感染组中共同差异表达的mi RNAs为54个,共同差异的m RNAs为3460个,基于Target Scan、mi RDB靶基因预测数据库信息,建立结核分枝杆菌感染巨噬细胞免疫应答相关的mi RNA-m RNA调控网络,该网络由49个差异mi RNAs及1414个差异m RNAs组成,通过DAVID在线分析工具进一步分析了调控网络中异常表达的m RNAs,GO功能分析显示网络中的靶基因主要注释在基因表达调控（positive regulation of gene expression）、凋亡过程酶激活（activation of cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process）、蛋白激酶绑定（protein kinase binding）等功能条目上,Pathway通路富集分析显示网络中的靶基因主要富集在细胞凋亡（Apoptosis）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）等代谢通路上,其中细胞凋亡通路最为显著,而组成细胞凋亡的诸多信号通路中,PI3K-Akt信号通路具有抗凋亡的作用且网络中的靶基因（PIK3CG,PIK3R3和AKT3）富集于此。在潜伏结核感染人群PBMCs中筛选出15个特异表达的mi RNAs和855个特异表达的m RNAs并建立潜伏结核感染人群PBMCs中特异mi RNA-m RNA调控网络,该网络由9个mi RNAs与92个m RNAs组成,并对该网络靶基因做进一步地PPI（protein-protein interaction）网络分析,再通过通路富集分析,发现PI3K-Akt信号通路显著性最大,可见,PI3K-Akt信号通路在宿主应答结核分枝杆菌感染过程中可能发挥重要作用。第三部分let-7a-2-3p/PIK3CG模块对结核分枝杆菌感染的巨噬细胞凋亡水平的动态调控机制研究PIK3CG为PI3K-Akt信号通路的重要分子,且生物信息学分析显示let-7a-2-3p与PIK3CG有潜在的靶向调控关系。通过q RT-PCR验证模型中let-7a-2-3p与PIK3CG的表达水平,结果显示let-7a-2-3p呈下调表达,PIK3CG呈上调表达,与RNA-seq数据分析结果趋势一致。Western blot结果显示感染组中PIK3CG的蛋白产物p110γ表达显著升高,说明结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中PI3K-Akt信号通路活跃,同时抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著增加。将let-7a-2-3p过表达后,发现PIK3CG与其蛋白产物p110γ表达均显著降低,荧光素酶报告基因实验证实,let-7a-2-3p可与PIK3CG 3’UTR区域的1992-2013或3028-3049位点直接靶向结合;过表达let-7a-2-3p对促炎因子TNF-α的分泌起到抑制作用,抑制let-7a-2-3p表达后,TNF-α的分泌量显著升高,将PIK3CG基因敲降后,TNF-α的分泌也受到一定的抑制,说明在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中let-7a-2-3p/PIK3CG模块的异常表达对TNF-α分泌有一定的促进作用;我们通过对巨噬细胞过表达let-7a-2-3p或敲降PIK3CG基因,再经结核分枝杆菌感染,发现Bcl-2的蛋白表达均显著降低,同时CCK8实验检测发现感染后巨噬细胞存活率降低,并通过流式细胞术实验检测到巨噬细胞凋亡率显著升高,说明巨噬细胞中let-7a-2-3p/PIK3CG模块的表达变化,对感染后的巨噬细胞凋亡产生了一定的影响。let-7a-2-3p/PIK3CG模块在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中分别呈现下调与上调的异常表达模式,使得PIK3CG所在的PI3K-Akt信号通路呈现活跃状态,进而促进下游Bcl-2蛋白高表达,对巨噬细胞的凋亡起到了抑制作用,这种现象也为结核分枝杆菌在巨噬细胞中持留提供了条件。

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中文摘要

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英文缩略词表

第1章文献综述

1.1 结核病概述

1.1.1 结核病流行现状

1.1.2 结核病临床诊断发展

1.1.3 结核病免疫机制研究进展

1.2 RNA-seq（转录组测序技术）的应用概况

1.2.1 RNA-seq的发展

1.2.2 RNA-Seq的应用概况

1.2.3 RNA-Seq对于结核病机制研究的意义

1.3 miRNAs在结核病中的研究意义

1.3.1 miRNAs概述

1.3.2 miRNAs与结核病发生发展的关系

1.3.3 miRNAs在结核病中的研究进展

1.4 miRNA-mRNA调控网络概述

1.4.1 miRNAs的调控作用

1.4.2 miRNA-mRNA调控网络研究现状

1.4.3 miRNA-mRNA调控网络应用于结核病研究

第2章结核分枝杆菌感染THP-1 来源巨噬细胞模型建立

2.1 前言

2.2 结核分枝杆菌感染巨噬细胞（THP-1 来源）模型建立

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.2.3 实验结果

2.3 讨论

第3章结核分枝杆菌体外感染模型与临床潜伏感染人群PBMCs中miRNA-mRNA调控网络共性特征分析

3.1 前言

3.2 感染模型中miRNAs与 m RNAs表达谱测序分析

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验方法

3.2.3 实验结果

3.3 结核分枝杆菌体外感染模型中miRNA-mRNA调控网络的构建与分析

3.3.1 实验材料

3.3.2 实验方法

3.3.3 实验结果

3.4 临床潜伏感染人群PBMCs中 miRNA-mRNA调控网络的构建与分析

3.4.1 实验材料

3.4.2 实验方法

3.4.3 实验结果

3.5 讨论

第4章 let-7a-2-3p/PIK3CG模块对感染后巨噬细胞凋亡水平的动态调控机制研究

4.1 前言

4.2 let-7a-2-3p/PIK3CG模块的筛选及表达验证

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验方法

4.2.3 实验结果

4.3 let-7a-2-3p/PIK3CG模块调控关系验证

4.3.1 实验材料

4.3.2 实验方法

4.3.3 实验结果

4.4 let-7a-2-3p/PIK3CG模块对巨噬细胞促炎因子TNF-α分泌的影响

4.4.1 实验材料

4.4.2 实验方法

4.4.3 实验结果

4.5 let-7a-2-3p/PIK3CG模块对感染后巨噬细胞凋亡功能的影响

4.5.1 实验材料

4.5.2 实验方法

4.5.3 实验结果

4.6 讨论

第5章结论

参考文献

附录 1

附录 2

附录 3

附录 4

附录 5

作者简介

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 林妍

导师: 李凡

关键词: 结核分枝杆菌,巨噬细胞,调控网络

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 吉林大学

分类号: R392

总页数: 199

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