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青钱柳叶黑枯病菌拮抗微生物筛选、鉴定及抗生机理初步研究

2020-12-08阅读(693)

青钱柳叶黑枯病菌拮抗微生物筛选、鉴定及抗生机理初步研究

论文摘要

青钱柳（Cyclocarya paliurus）是我国一种十分珍贵的濒危树种,具有极高的药用保健价值。本实验室在实地考察中首次发现由杜仲拟茎点霉（Diaporthe eucommiae）引起的青钱柳病害,命名为叶黑枯病（Leaf black blight）,该病主要为害青钱柳的叶片,严重影响了青钱柳相关产业的发展和物种保护。生物防治以其对环境友好、靶标性强、病菌不产生抗药性和低成本等诸多优势展现了广阔的应用前景,而生物防治青钱柳叶黑枯病的研究尚存在空白。本文采用连续稀释分离法和涂布平板法对青钱柳根际微生物进行分离和纯化,采用平板对峙法筛选出能显著抑制病原菌的拮抗微生物,并对拮抗菌的抑菌谱进行了分析;基于形态学、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析对拮抗菌株进行了鉴定;采用单因素试验设计法优化拮抗菌株的发酵条件,带毒平板法测定最佳发酵条件;还对拮抗菌株拮抗作用的抗生机理进行了初步探究。得到如下结果与结论:1、共分离到32株青钱柳根际微生物,包括8株细菌、18株真菌和6株放线菌;其中细菌菌株QJK-3和放线菌菌株QJK-26展现了很好的抑菌能力,抑菌率分别为72.22%和84.67%。菌株QJK-26还能抑制水稻纹枯病菌、稻瘟病菌和芽孢杆菌属细菌,具有广谱抑菌性。2、拮抗菌株QJK-3为革兰氏阳性细菌,观察细胞呈短杆状,过氧化氢酶阳性,能产芽孢;LB培养基上菌落向周围无规则凹凸生长,边缘不平滑,呈波纹状,表面有褶皱纹路,不透明的淡黄色,综合表型和基因型鉴定为Bacillus sp.QJK-3。拮抗菌株QJK-26为革兰氏阳性菌,菌丝无横隔、有分支,孢子丝呈现柔曲或钩状的对生生长形态,通过与相似性最高的几株模式菌株比对,鉴定其为链霉菌属一潜在新种,命名为潭州链霉菌（Streptomyces tanzhouensis sp.nov.）。3、拮抗菌株QJK-26抗菌活性物质产生的最适发酵培养基为小米培养基,最佳发酵条件为pH 8,转速180 rpm,接种量5%,温度32℃,发酵时间为2 d,装液量为2/5。4、拮抗菌株QJK-3和拮抗菌株QJK-26均存在抗生作用这一作用机制。它们能抑制病原菌菌丝的生长和影响孢子的萌发,并能分泌某些挥发性代谢产物（VOCs）来抑制病原菌的正常生长代谢,还具有很强的产胞外蛋白酶的能力,但不产几丁质酶、葡聚糖酶和纤维素酶。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  •   1.1 植物病害
  •     1.1.1 真菌病害
  •     1.1.2 病毒病害
  •     1.1.3 细菌病害
  •     1.1.4 线虫病害
  •   1.2 植物病害的生物防治
  •     1.2.1 生物防治概述
  •     1.2.2 生防微生物及其应用
  •       1.2.2.1 链霉菌
  •       1.2.2.2 芽孢杆菌
  •     1.2.3 植物病害生物防治的机理
  •       1.2.3.1 诱导抗病性
  •       1.2.3.2 交叉保护
  •       1.2.3.3 捕食作用
  •       1.2.3.4 竞争作用
  •       1.2.3.5 抗生作用
  •       1.2.3.6 重寄生
  •       1.2.3.7 促进植物生长
  •     1.2.4 生防微生物的抗菌活性物质
  •   1.3 青钱柳
  •     1.3.1 生物学特性与地理分布
  •     1.3.2 药用与食用价值
  •     1.3.3 病害
  •       1.3.3.1 立枯病
  •       1.3.3.2 叶黑枯病
  •   1.4 研究的主要内容、目的及意义
  •     1.4.1 研究的主要内容
  •     1.4.2 研究的目的和意义
  • 第二章 青钱柳叶黑枯病拮抗微生物的筛选及抑菌谱分析
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 筛选测试菌株的来源
  •     2.1.2 供试病原菌及敏感菌株
  •     2.1.3 培养基
  •     2.1.4 主要试剂和药品
  •     2.1.5 主要仪器和设备
  •     2.1.6 实验方法
  •       2.1.6.1 拮抗微生物的分离和纯化
  •       2.1.6.2 拮抗微生物的筛选
  •       2.1.6.3 拮抗微生物抗菌谱分析
  •   2.2 结果与分析
  •     2.2.1 拮抗微生物的筛选
  •     2.2.2 拮抗微生物的抑菌谱分析
  •     2.2.3 拮抗微生物相互拮抗分析
  •   2.3 本章小结
  • 第三章 青钱柳叶黑枯病原拮抗菌QJK-3和QJK-26 的分类鉴定
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 供试菌株
  •     3.1.2 培养基
  •     3.1.3 主要试剂和药品
  •     3.1.4 主要仪器和设备
  •     3.1.5 实验方法
  •       3.1.5.1 形态学鉴定
  •       3.1.5.2 拮抗菌株QJK-26 的脂肪酸组分的分析测定
  •       3.1.5.3 生理生化鉴定
  •       3.1.5.4 分子鉴定
  •   3.2 结果与分析
  •     3.2.1 拮抗菌株的形态学和培养特征
  •     3.2.2 拮抗菌株QJK-26 的脂肪酸组分分析
  •     3.2.3 拮抗菌株QJK-3和QJK-26 的生理生化特征
  •     3.2.4 拮抗菌株的分子鉴定
  •   3.3 本章小结
  • 第四章 拮抗菌株QJK-26 的发酵条件优化
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 实验菌株
  •     4.1.2 培养基
  •     4.1.3 主要仪器和设备
  •     4.1.4 实验方法
  •       4.1.4.1 拮抗菌株的扩大培养
  •       4.1.4.2 无菌发酵滤液的制备
  •       4.1.4.3 抑菌效果的测定
  •       4.1.4.4 数据分析及图表制作
  •       4.1.4.5 发酵培养基优化
  •       4.1.4.6 培养温度优化
  •       4.1.4.7 发酵初始pH优化
  •       4.1.4.8 发酵转速优化
  •       4.1.4.9 发酵时间优化
  •       4.1.4.10 发酵溶氧量优化
  •       4.1.4.11 接种量优化
  •   4.2 结果与分析
  •     4.2.1 培养基对菌株QJK-26 抑菌活性的影响
  •     4.2.2 发酵温度对菌株QJK-26 抑菌活性的影响
  •     4.2.3 发酵初始pH对菌株QJK-26 抑菌活性的影响
  •     4.2.4 发酵转速对菌株QJK-26 抑菌活性的影响
  •     4.2.5 发酵时间对菌株QJK-26 抑菌活性的影响
  •     4.2.6 不同装液量对菌株QJK-26 抑菌活性的影响
  •     4.2.7 不同接种量对菌株QJK-26 抑菌活性的影响
  •   4.3 本章小结
  • 第五章 拮抗菌株抑菌机理的初步探究
  •   5.1 材料与方法
  •     5.1.1 供试菌株
  •     5.1.2 培养基
  •     5.1.3 主要试剂和药品
  •     5.1.4 实验方法
  •       5.1.4.1 拮抗菌株对病原菌菌丝的致畸作用
  •       5.1.4.2 拮抗菌产生的VOCs对病原菌的抑制作用
  •       5.1.4.3 拮抗菌株发酵液对病原菌孢子萌发的影响
  •       5.1.4.4 拮抗菌株发酵液对病原菌菌丝团的影响
  •       5.1.4.5 拮抗菌株产真菌细胞壁水解酶情况
  •       5.1.4.6 数据处理与统计分析
  •   5.2 结果与分析
  •     5.2.1 拮抗菌对病原菌菌丝的致畸作用
  •     5.2.2 拮抗菌产生的VOCs对病原菌的抑制作用
  •     5.2.3 拮抗菌株发酵液对病原菌孢子萌发的影响
  •     5.2.4 拮抗菌株发酵液对病原菌菌丝团的影响
  •     5.2.5 拮抗菌株产真菌细胞壁水解酶情况
  •   5.3 本章小结
  • 第六章 结论与展望
  •   6.1 主要结论
  •   6.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录 A 攻读学位期间发表的论文与科研成果清单
  • 附录 B 论文中使用的缩略词及符号
  • 附录 C 拮抗菌株QJK-26 脂肪酸组分分析报告
  • 附录 D 拮抗菌株的16S rRNA序列

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 陶宗

    导师: 王海华

    关键词: 青钱柳,叶黑枯病,杜仲拟茎点霉,基因序列,芽孢杆菌,链霉菌,抗生作用

    来源: 湖南科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,有机化工

    单位: 湖南科技大学

    分类号: Q93;TQ458

    DOI: 10.27738/d.cnki.ghnkd.2019.000193

    总页数: 83

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