导读:本文包含了文昌鱼斑马鱼论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:文昌鱼,斑马,获得性免疫,座子,受体,皮层,祖先。
文昌鱼斑马鱼论文文献综述
陈蓉[1]（2015）在《文昌鱼CAL和斑马鱼PTX的晶体结构与进化机制研究》一文中研究指出获得性免疫系统—以多样性的抗原受体(BCRs和TCRs)、淋巴细胞、各种重组机制为特征一起源于5亿年前的软骨鱼。迄今为止,由于经典获得性免疫系统的所有组分都发现于有颌类及以后的物种,使得探讨以TCR-BCR为基础的获得性免疫系统的起源成为了一个难题。然而,BCRs和TCRs共同具有的抗原识别功能域,即免疫球蛋白超家族功能域V (IgSF-V)、同样的重组机制及其最低等有颌脊椎动物如鲨鱼基因组中的紧密连锁、使进化学者达成了基本共识：BCRs和TCRs共同起源于更低等脊索动物中的一个具有IgSF功能域的祖先基因。聚焦于脊椎动物的祖先—头索动物文昌鱼,其全基因组测序于2008年完成,结果进一步证实它是全基因组2次复制前公认的、最古老的活化石物种。因此,在文昌鱼中寻找IgSF-V分子,解析其结构、分析相关功能,既可反映出IgSF共同祖先分子(CAL)的特征,又可独辟蹊径的阐释获得性免疫系统的起源。短链五聚素(PTX)为非特异免疫系统中的关键分子,其功能类似于抗体,既能与Clq结合、通过经典途径激活补体系统,又能与FcR结合引发免疫溶菌和调理吞噬效率。斑马鱼具有上述分子和细胞,是研究PTX在低等脊椎动物中的结构及其与特异性免疫分子之间互作机制的最好对象。因此,本文对文昌鱼CAL和斑马鱼PTX两个进化节点相关蛋白的晶体结构进行了解析,并集成了生物信息学、分子免疫学与结构生物学技术对其功能进行了阐释。首先,在文昌鱼基因组和转录组中发现了-IgSF-V共同祖先样分子CAL。解析其基因组构造发现,CAL位于文昌鱼免疫功能相关基因域,令人惊讶的是在CAL的内含子2、3和4中均存在RSS-like序列,并且,其跨膜区域存在保守的抗原受体跨膜区序列(CART motif)。随后,对CAL进行了表达、纯化与结晶。CAL晶体结构解析结果显示,CAL蛋白由两个独立的lg功能域组成,形成了一个IgV和IgC串联的结构,这是迄今为止解析的最古老的IgV-C分子。CAL具备典型的获得性免疫受体的结构特征—典型的IgV结构域、多样性的CDR-loop、J链样基序和结构(β-bulge)及3-layer packing的二聚体方式等。组织定位显示,CAL主要在原始的鳃、肠道和肝盲囊表达,并且都位于易于与外界微生物接触的腔面。肠道亚细胞定位显示,CAL主要分布在纤毛、细胞表面凸起、分泌性颗粒等具有免疫功能的亚细胞结构。另外,通过解析斑马鱼PTX (Dare-PTX)及Dare-PTX-Ca的晶体结构,发现Dare-PTX是一个叁聚体,其结构是在五聚素家族中发现的一新聚合方式。与人PTX相比,在Dare-PTX的配体识别面,Dare-PTX具有深而窄的抗原结合口袋。在Dare-PTX的效应面,Dare-PTX具有一个新的C1q的结合模式及部分保守的FcR的结合位点。综上所述,本文通过对CAL的研究,发现了文昌鱼体内存在一个与免疫相关的具有体细胞突变的IgV-C分子,其精细结构具有获得性免疫受体的典型结构特征,并具备免疫受体的基因组元件。结果将有助于我们更好地理解获得性免疫的起源与进化。斑马鱼PTX的结构展示了一个起源于4.5亿年前的硬骨鱼的PTX精细结构及其获得性免疫系统的协同进化关系。(本文来源于《中国农业大学》期刊2015-05-01）
白长存[2]（2012）在《PiggyBac转座系统在斑马鱼研究中的应用及文昌鱼Six1基因的克隆和生物信息学分析》一文中研究指出随着斑马鱼基因组测序工作的完成,人们发现斑马鱼基因与人类基因的保守度高达87%,使得斑马鱼作为一种研究人类基因功能的模式动物越来越受到关注。转座子在低等生物转基因和基因诱变分析中得到了广泛的应用,对这些生物基因功能的研究起了重要作用。目前用于斑马鱼基因功能研究的转座子主要是Tol2,结合基因捕获技术较广泛的被应用于斑马鱼突变体筛选。Tol2的转座遵循“切离-粘贴”机制,其插入基因组时会产生插入位点处8个碱基的重复,但其存在切离后留下的痕迹不一的缺点,不易实现对突变表型的回复。PiggyBac转座子(PB)是一种来源于鳞翅目昆虫的DNA转座子,最初的序列在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系中分离,其转座遵循“切离-粘贴”机制,PB特异地插入到TTAA四碱基位点,插入的同时在其两侧形成TTAA四碱基重复。它可以从插入位点处精确地切离,不留下任何痕迹,使插入位点完全回复到插入以前的状态。该转座子目前已经开发成为转基因昆虫中应用最为广泛的载体之一,它已被证明能够在四个目十数种昆虫中转座。2005年Ding等的研究发现其也能在脊椎动物如小鼠中实现高效转座；2006年,Fraser等发现PB转座子在斑马鱼原代培养细胞及胚胎中均能进行转座,揭示了PB转座系统在斑马鱼基因功能研究中具有广泛的应用前景。我们对piggyBac(PB)转座系统中的helper质粒-转座酶载体质粒(pCMV-hyPBase)和donor质粒-转座子载体质粒(5’-PTK-3’)分别进行了重新构建,得到了一个二元系统。Helper质粒pCMV-hyPBase-IRES-EGFP构建过程如下：将来源于质粒pPRIG的IRES-EGFP片段插入到XbaI和XhoI双酶切的质粒pCMV-hyPBase的缺口,从而构建了双顺反子表达载体质粒：pCMV-hyPBase-IRES-EGFP; Helper质粒pZPCO.5-hyPBase-IRES-EGFP构建过程如下：将克隆得到的斑马鱼ZPC0.5启动子插入到SpeI和EcoRI双酶切的质粒pCMV-hyPBase-IRES-EGFP缺口,替换掉CMV启动子,即得到双顺反子表达载体质粒：pZPC0.5-hyPBase-IRES-EGFP。Donor质粒PTK-mCherry构建过程如下：将以pmCherry-N1质粒为模板克隆得到的mCherry基因片段插入到用NcoI和BelI双酶切的质粒5’-PTK-3’缺口,构建得到了基因捕获载体质粒：PTK-mCherry。质粒pCS2+-hyPBase构建过程如下：将来源于质粒pCMV-hyPBase的hyPBase片段插入到用EcoR1和Xho1双酶切的质粒pCS2+的缺口,即构建了转座酶hyPBase mRNA合成模板载体质粒pCS2+-hyPBase。将pCMV-hyPBase-IRES-EGFP质粒载体线性化后显微注射到斑马鱼单细胞期受精卵中,筛选得到了EGFP遍表达的helper品系转基因斑马鱼,并且发现其中一些鱼的这一性状能够稳定传给F1代,从而得到了此转基因品系的founder斑马鱼。以线性化的pCS2+-hyPBase为模板,体外转录合成了转座酶hyPBase mRNA。将此mRNA与基因捕获载体质粒PTK-mCherry共注射到斑马鱼单细胞期受精卵中,筛选得到了mCherry的表达在时间及空间上均不同的donor品系转基因斑马鱼,且发现mCherry在F0代中有将近8%的表达率,证明piggyBac转座子能够在斑马鱼中进行有效转座且捕获到不同基因,因此piggyBac转座系统在斑马鱼中可以作为一种新的技术手段,有效实现突变体的筛选。我们计划通过helper及donor品系斑马鱼的交配策略在下一代中实现在体(in vivo)转座,从而筛选到更多新的突变体,希望PB转座系统的应用能进一步推动解析脊椎动物基因功能的进程,对人类生物学和疾病研究有所帮助。胸腺是脊椎动物中重要的免疫器官,在其发育过程中受多种基因的协调控制,其中pax1,pax9,eya1、sis1、six4,foxnI等的作用最为关键。文昌鱼是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类群的典型代表,被认为是研究脊椎动物起源和进化的新兴模式动物。以往的观点认为,文昌鱼作为头索动物不存在获得性免疫系统。但最近的研究表明,许多脊椎动物获得性免疫系统中的重要基因如six家族基因在文昌鱼中存在同源或者相似的基因。利用生物信息学分析,我们发现在佛罗里达文昌鱼数据库中存在脊椎动物胸腺发育关键基因pax1,pax9,eya1、six1、six4,foxnI等的同源基因,并对这些同源基因进行了进化学分析；利用青岛文昌鱼与佛罗里达文昌鱼的高度相似性,以佛罗里达文昌鱼数据库中的基因序列为模板设计引物,利用RT-PCR的方法克隆倒了青岛文昌six1基因片段(包含完整CDS)及six4基因片段；对six1基因演绎蛋白序列进行了结构及性质的分析,Six1演绎蛋白长200个氨基酸,理论分子量为22057.6Da,等电点为7.84,是一亲水蛋白,属于homeodomain超家族.(本文来源于《山东大学》期刊2012-04-10）
张宁[3]（2009）在《文昌鱼和斑马鱼C1q、C3及G10的进化分析及基因表达的研究》一文中研究指出补体系统是由存在于动物血清与组织液中的一组可溶性蛋白及存在于其它细胞表面的一组膜结合蛋白和补体受体所组成。根据功能可将补体系统分为叁类:第一类是存在于体液中参与补体激活酶促连锁反应的固有成分,包括九种补体(C1～C9)及D、B、P因子。第二类是补体活化的调节分子,其中存在于体液中属于可溶性蛋白分子的有:C1酯酶抑制剂、C4bp、I因子、S蛋白等;存在于细胞表面的膜结合蛋白分子有:膜辅因子、促衰变因子和同种限制因子等。第叁类是存在于细胞表面介导补体活性片段或调节蛋白发挥生物效应的各种受体,如C1q受体、C3b/C4b受体、H因子受体、C3a和C5a受体等。补体系统在体液中以非活性状态存在,当其被激活物激活后,发生连锁的酶促反应,表现出其生物活性。补体系统是机体非特异性免疫的重要组成部分,同时也参与特异性免疫,其主要作用如下:①溶菌和溶细胞作用:②促进中和溶解病毒作用③调理和免疫粘附作用④炎症介质作用。补体C3是人体免疫血清中含量最丰富的补体蛋白,由α链和β链组成。α链和β链之间以单个二硫键和非共价键结合。C3是一个多功能的蛋白,它可以与大量的补体因子和非补体因子相互作用。C3在经典途径和替代途径中均占重要地位。它是激活效应扩大的主要因子,是补体系统的核心组分,位于叁种激活途径的交叉点。C1q是经典补体途径的目标识别蛋白。人类的C1q由18个多肽(6A,6B,6C)组成:A链,B链和C链。C1q可以通过它的叁聚体gC1q功能域广泛的结合自我和非我的配体,从而引发经典途径。在无脊椎动物和低等的脊椎动物中,C1q是以凝集素的方式参与机体的免疫反应的。本文对文昌鱼C3进行了基因进化分析和基因组结构分析,并研究了文昌鱼C3在成体组织中的表达模式。研究发现,文昌鱼C3与其它物种C3的的同源性大约在25%-30%之间。虽然文昌鱼与文中所列物种的同源性并不高,但它们都含有“RRRR”结构域和“CC---C---C---CC”为特征的C3a过敏毒素区结构域。在哺乳动物之间,C3的同源性相对比较高,这说明进化到哺乳动物后C3的差异性变小,一致性变高了。在进化上,文昌鱼C3位于无脊椎动物和脊椎动物C3的过渡位置,与文昌鱼本身在动物进化过程中的地位基本一致。基因结构分析显示,人、小鼠和斑马鱼C3基因都包含41个外显子和40个内含子,并且每个外显子的大小几乎完全相同。文昌鱼C3基因包含40个外显子和39个内含子,文昌鱼的第22个外显子大小相当于斑马鱼的第22个和23个外显子之和,它的第23和24个外显子之和的大小相当于斑马鱼的第24个外显子,第39个外显子大小相当于斑马鱼第39个和40个外显子之和。其它外显子大小基本上与人、小鼠和斑马鱼的外显子大小一致。成体原位杂交结果显示,C3在中央管附近的神经元、咽鳃区轮器的上皮细胞、体腔内巨噬细胞、鳃片纤毛柱状上皮细胞、肠道、卵巢、精巢、腹褶的表皮细胞和腹褶淋巴腔的巨噬细胞中均有表达。在内柱中,C3则只检测到微弱的信号。C3的保守序列及表达模式表明C3可能参与了文昌鱼的免疫应答,在文昌鱼的免疫反应中起了重要作用。C1q-like在文昌鱼胚胎发育和成体组织中的表达模式。原位杂交结果显示,C1q-like在胚胎发育过程中均有表达。随着发育的进行,C1q-like在预定的脊索中胚层,轴旁中胚层,发育中的神经板和分化中的消化道中均有表达,之后在发育中和新形成的脊索、体节、肠壁中表达。到了幼虫期,主要在消化道、鳃和分化中的尾芽中表达。在成体组织中,C1q-like与C3在文昌鱼中的表达模式非常相似,但在内柱中,C1q-like的表达非常强烈。对比研究发现,斑马鱼中C1qc、C3在斑马鱼成体组织中的表达模式分别与文昌鱼的C1q-like、C3的表达模式非常相似,主要在卵母细胞、视网膜、脑、肝脏和肠道中表达。这表明C1q和C3在文昌鱼及斑马鱼中的功能可能是相似的。G10蛋白是首先发现于爪蟾卵母细胞中的一种母源性的物质。小鼠G10蛋白与爪蟾G10蛋白的同源性高达93%。Timothy H1a等在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中发现了爪蟾G10的同源蛋白,与爪蟾G10蛋白的同源性是93%。它在上皮细胞和间叶细胞系中无所不在。G10是高度保守的,在非常低等的生物如酵母和线虫中都有表达。利用本实验室提交的文昌鱼G10序列进行了进化学分析和基因组学分析以及在文昌鱼胚胎和成体组织进行了原位杂交检测。结果显示,文昌鱼G10的进化地位位于无脊椎动物和脊椎动物之间,符合文昌鱼本身的动物进化地位。原位杂交结果显示,AmphiG10在胚胎发育的各个时期均有表达。随着发育的进行主要在分化中的外胚层和中胚层表达。之后主要在表皮、体节、消化道、逐渐形成的神经管和脊索中表达。之后,主要在消化道和鳃的上皮中表达。G10在成体组织中的表达模式与C1q-like和C3非常相似。在斑马鱼中,G10的表达模式与C1q-like和C3的表达也是惊人的相似,只是在视网膜中未检测到表达信号。G10可能参与了生物体的免疫活动。(本文来源于《山东大学》期刊2009-05-20）
李建伟[4]（2007）在《文昌鱼发育相关基因Smad、Tmp21表达及文昌鱼斑马鱼Rab23同源基因的比较研究》一文中研究指出头索动物文昌鱼(Amphioxus)，被认为是现存最接近于脊椎动物的无脊椎动物，是研究动物胚胎发育和动物进化的典型材料。本论文首次报道了文昌鱼中转化生长因子-β(TGF-β)信号通路中关键信号转导分子基因AmphiSmad1和AmphiSmad4、膜转运相关蛋白基因AmphiTmp21以及文昌鱼和斑马鱼中Rab23同源基因的比较研究。转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族可以调节细胞的增殖、分化、迁移和凋亡，在生物整体及多种器官的发育过程中起着重要的作用。大多数TGF-β超家族的信号分子在脊椎动物胚胎的中内胚层诱导和背腹模式形成中有重要作用。Smad家族是一类TGF-β信号的细胞质内介导者，它们可将TGF-β信号直接从细胞膜转导入细胞核内，从而启动靶基因的转录。此外，Smad还参与调节VEGF(Vascular endothelial growth factor)和BMP(Bone morphogenetic factor)信号途径相关基因的转录。因此，研究Smad基因具有很重要的生物学意义。在具有特殊进化地位的文昌鱼中，与中山大学合作，克隆了Smad1，4基因全序。本研究对文昌鱼Smad1，4基因进行了系统学和进化学的分析，并研究了它们在不同胚胎发育时期及幼虫中的表达特异性。研究结果表明，这两个基因的功能结构域在各物种间高度保守，它们可能与文昌鱼的中内胚层分化有密切关系，而且AmphiSmad1还可能与文昌鱼的体节发育相关。Tmp21是一种跨膜转运蛋白(transmembrane trafficking protein)，又称p23，也叫p24delta1。它属于p24 protein family，这类蛋白在内质网向高尔基体的运输过程中起重要作用。p24家族的蛋白常以复合物的形式存在，并且在COPI-coatedvesicles中含量丰富，而这种小泡与内质网和高尔基体之间的膜转运密切相关。在小鼠中，应用基因敲除技术已经证实，p24蛋白家族成员p23为哺乳动物早期胚胎发育所必须。此外，在患有肺癌偶联视网膜病的病人当中，利用免疫化学的方法证实，除相应的肺癌细胞系中有p23的信号外，p23只在视神经中特异存在。在本室文昌鱼差减文库序列的分析中，我们得到了文昌鱼Tmp21同源基因的EST，利用佛罗里达文昌鱼基因组比对获得了AmphiTmp21的全序，对其进行了系统进化学分析，并且分析了该基因在文昌鱼胚胎及成体中的时空表达特异性。初步研究结果表明，该基因可能与文昌鱼感光系统中的色素沉积相关。Sonic Hedgehog通路在胚胎发育过程中扮演着重要的角色，它的正常表达与否与神经管背腹轴的形成以及体节的发育直接相关。此外，在成体组织中，此通路的异常激活通常导致癌的发生。Rab23是Sonic Hedgehog通路中的重要的抑制因子。我们在文昌鱼中克隆了此基因的全序，分析了此基因表达的时空特异性，同时构建了含有整个ORF的表达载体，利用活体显微注射mRNA的方法，分析了其功能。在斑马鱼中，利用Genebank库中已有的序列，设计特异性探针，分析了其表达图式，同时也构建了表达载体及RNAi载体，分析了其功能，并与文昌鱼进行了对比研究。初步研究结果表明，该基因在文昌鱼、斑马鱼神经管的后期发育中可能扮演着十分重要的角色，在斑马鱼中该基因可能还与体节分化相关。此外，该基因在进化过程中相当保守，且在头索动物和脊椎动物之间无功能异质性。(本文来源于《山东大学》期刊2007-04-10）
王利凤[5]（2007）在《文昌鱼和斑马鱼agat、gamt和ct1的克隆、进化学分析、表达图式及斑马鱼gamt的功能研究》一文中研究指出头索动物文昌鱼代表着从无脊椎动物到脊椎动物进化过程中一个重要的过渡阶段，被认为是现存的与脊椎动物最接近的无脊椎动物。以文昌鱼为模式动物研究脊椎动物发育的机制是比较胚胎学和发育生物学的重要内容。随着佛罗里达文昌鱼的全基因组测序的完成，必将使文昌鱼在发育分子生物学和基因组进化学的研究中发挥更加重要的作用。斑马鱼高繁殖力、胚胎体外发育和透明性等优点，使其成为研究胚胎发育的绝佳材料。斑马鱼大规模遗传突变筛选显示，斑马鱼的很多突变表型与与人类相关疾病的临床症状有着相似的特征：基因组测序的数据也已经揭示，斑马鱼的这些基因与引起人类疾病的相应的基因有着极高的同源性。因此，斑马鱼这一模式动物也日益成为研究脊椎动物生物学、生理学和人类疾病最有力的工具。肌酸(Cr)／磷酸肌酸(PCr)／肌酸激酶(CK)系统是脊椎动物体内能量供应的最重要的机制之一。体内肌酸的合成经两步酶促反应完成，第一步是精氨酸和甘氨酸在精氨酸甘氨酸转氨酶(AGAT)的催化下，合成胍基乙酸和鸟氨酸，第二步是胍乙酸(GAA)和S-腺甘甲硫氨酸(SAM)经胍基乙酸甲基转移酶(GAMT)的催化生成肌酸。肌肉等组织细胞自身不能合成肌酸，必须通过特殊的钠离子依赖的细胞膜肌酸转运蛋白(CT1)摄取血液中的肌酸。根据Cr代谢途径可以看出，Cr合成的异常和转运的异常都可以引起肌酸缺陷综合症(CDS)。AGAT，GAMT和CT1缺陷症的病人共同的症状是幼年的神经学上的症状和严重的神经发育延滞。AGAT和GAMT缺陷症可以通过口服肌酸而缓慢的补充脑中肌酸，进而得到治疗。但口服肌酸不能补充CT1缺陷症病人中枢神经系统(CNS)中的缺失的肌酸。尽管服用肌酸可以使AGAT和GAMT缺陷症的病人发育得到恢复，但其仍然遗留脑的发育和智力的障碍。GAMT缺陷症可能是由CNS中堆积的GAA的毒性引起的。自1934年人们发现了肌酸激酶催化的反应以来，人们的研究焦点最初集中在肌酸激酶反应本身的生化、生理、病理及其作用等方面，随后逐渐转移到了肌酸代谢方面。人类CDS发现后，相当多的研究在临床和实验室中展开。尽管大多数的CDS或者都在儿童时期就表现出明显的症状，但是对胚胎发育中的肌酸代谢，特别是从胚胎发育到成体的过程中肌酸合成与转运的变化的研究却非常有限。此外，肌酸合成与转运代谢的研究目前所有报道都是在脊椎动物，尤其是哺乳动物(大鼠、小鼠和人)中开展的。AGAT和GAMT酶活性一度未在无脊椎动物动物中检测到。但一些无脊椎动物中却发现了一定的Cr，PCr和CK。头索动物文昌鱼中也存在CK。因此人们对于这些物种体内的肌酸是来自环境或者食物中，还是内源合成的(只是这些物种的肌酸合成酶尚未被检测到)一直有疑问。由于缺乏无脊椎动物以及低等脊椎动物中肌酸合成的证据，因此对于肌酸代谢途径从无脊椎到脊椎动物的进化研究就更无从谈起。本研究首次克隆到头索动物文昌鱼(白氏文昌鱼)的3个肌酸代谢相关基因，证实了无脊椎动物(至少头索动物)中确实存在肌酸的合成与转运机制，回答了人们长久以来关于无脊椎动物中肌酸来源的问题。整封和切片原位杂交的结果显示，3个肌酸代谢相关基因在文昌鱼胚胎和成体中都表达，表明肌酸的合成与转运无论在头索动物胚胎的正常发育还是成体的正常生理活动中都可能起着极其重要的作用。本文还系统的研究了斑马鱼中agat、gamt和ct1在胚胎发育和成体中的表达图式，填补了鱼类中肌酸合成与转运研究的空白。本文在文昌鱼，尤其是斑马鱼胚胎发育中对3个肌酸代谢相关基因的研究，充实了人类对肌酸代谢与胚胎发育关系的认识，同时也为在模式动物斑马鱼中开展人类CDS的相关研究提供了一种可能思路。进化学的研究表明，文昌鱼与斑马鱼的AGAT、GAMT和CT1蛋白质与哺乳动物的同源蛋白具有很高的相似性。文昌鱼和斑马鱼与哺乳动物中3个同源基因表达图式的比较发现，斑马鱼与哺乳动物肌酸合成与转运的机制有着更高的相似性，这与斑马鱼在进化上的地位处于头索动物和哺乳动物之间是完全符合的。本研究首次克隆到文昌鱼agat基因(DQ521270)的全长cDNA，共1817bp。演绎的文昌鱼AGAT蛋白质由426个氨基酸组成，理论分子量为49.3654kDa，蛋白质的等电点为6.65。文昌鱼agat基因由8个外显子组成。进化树分析显示，我们克隆的白氏文昌鱼AGAT与佛罗里达文昌鱼的2个AGAT(924和927)组成一支，独立于海胆这一单物种进化支和脊椎动物这一15个物种大进化支。佛罗里达文昌鱼AGAT 927和白氏文昌鱼AGAT构成了一个亚支，而佛罗里达AGAT 924则单独构成另一亚支。斑马鱼AGAT位于脊椎动物这一大进化支的顶端，独立构成一亚支。该进化树符合公认的动物进化关系。文昌鱼agat从卵裂期到囊胚期都不表达，原肠中期时agat开始在背侧中内胚层有微弱的表达。早神经胚时期，agat表达在预定体节中胚层。随着胚胎的发育，文昌鱼agat特异的表达在肌节中。这种表达模式一直持续到刀形幼虫。本研究首次克隆到文昌鱼gamt基因(DQ174309)的全长cDNA，共1542bp。演绎的文昌鱼GAMT蛋白质由236个氨基酸组成，理论分子量为26.8616kDa，预测的蛋白质的等电点为5.20。文昌鱼gamt基因由5个外显子组成。GAMT进化树与AGAT进化树比较类似。佛罗里达文昌鱼中的一个拷贝GAMT 924与白氏文昌鱼GAMT构成一支，佛罗里达GAMT另一拷贝399独立一支。斑马鱼GAMT也位于脊椎动物一支的顶端，但是与爪蟾GAMT共同组成一亚支。文昌鱼gamt的表达模式无论在时间上还是空间上都与agat有着高度的一致性。囊胚期以前gamt不表达，最早的表达出现在原肠中期的整个中内胚层。随后gamt开始特异的表达在预定体节中胚层和随后的肌节中，一直持续到刀形幼虫。此外，消化道上皮细胞也检测到gamt的少量表达。与agat的表达不同的是，从表达强度来看，文昌鱼gamt在肌节中的表达在各个时期都比agat强；从表达的广度来看，gamt的表达要更广泛一些，除了肌节，在消化道中也检测到gamt的微弱表达。本研究首次克隆到白氏文昌鱼ct1基因的426bp的片段。并对佛罗里达文昌鱼ct1基因演绎的CT1蛋白质进行了预测和分析。演绎的文昌鱼CT1蛋白质由631个氨基酸组成，理论分子量为70.7913kDa，预测的蛋白质的等电点为5.06。文昌鱼ct1基因由13或14个外显子组成。CT1进化树与AGAT和GAMT不同。佛罗里达文昌鱼CT1为树根，白氏文昌鱼CT1和斑马鱼CT1共同组成一支。即斑马鱼CT1与白氏文昌鱼同源性比与其他脊椎动物更高，或者说白氏文昌鱼与斑马鱼的同源性比与佛罗里达文昌鱼更高。文昌鱼ct1的表达与agat和gamt有很大差异。从卵裂期到囊胚期，ct1具有较强的表达。原肠中期时，ct1的表达略有降低，并限制在整个中内胚层。早神经胚开始，ct1的表达上调，表达在预定脊索中胚层、预定体节中胚层和内胚层中。随后，ct1表达在肌节、形成中的脊索和消化道中。在形成的脊索中，ct1表达消失。晚神经胚和刀形幼虫中表达持续的出现在肌节和消化道中。文昌鱼发育过程中肌酸合成的部位主要是体节(包括预定体节中胚层)。转运的部位比较广泛，包括体节(含预定体节中胚层)、形成中的脊索(包括预定脊索中胚层)以及消化道(包括内胚层)。3个基因都在体节(包括预定体节中胚层)中表达，但3个基因在外胚层都不表达。ct1表达的部位最广，gamt次之，agat最少。ct1表达在体节、消化道和脊索中；gamt表达在体节和消化道(尽管较弱)中，而agat只表达在体节中。成体文昌鱼中，agat、gamt和ct1的表达有几个特点。第一，agat和gamt的表达区域有很高的一致性。二者都表达在神经索、真皮、咽上沟、原肾管、腮上皮、肠上皮、内柱和卵细胞包膜中。第二，ct1的表达部位较少，只出现在肠上皮和咽上沟(较弱)中。第叁，在肌肉、脊索和表皮中，3个基因都不表达。斑马鱼agat由8个外显子组成。演绎的斑马鱼AGAT蛋白质由422个氨基酸组成，理论分子量为48.0668kDa，蛋白质的等电点为8.03。agat在基因组上只有1个拷贝，位于18号染色体上。agat在斑马鱼胚胎发育过程中具有动态的表达图式如下：受精卵到囊胚期agat不表达。原肠期开始，agat开始出现在卵黄合胞体层(YSL)。早体节开始，agat在YSL表达加强，同时开始低水平的出现在形成了的体节中。随着胚胎进一步发育，agat一直强烈表达在YSL且微弱的表达在体节中。但48hpf时，体节中agat消失，但强烈的表达出现在肝脏中。成体斑马鱼中agat强烈表达在小肠和卵巢中。agat不表达和弱表达的部位包括视网膜、晶状体、心脏、小肠(粘膜上皮、固有膜)、肝脏和胰腺。斑马鱼gamt基因由6个外显子组成。演绎的斑马鱼GAMT蛋白质由234个氨基酸组成，理论分子量为26.7538kDa，蛋白质的等电点为6.29。gamt在基因组上有2个完整的拷贝和一个只含有外显子4，5和6的部分基因拷贝，2者串联于11号染色体上。gamt在斑马鱼胚胎发育过程中具有动态的表达图式如下：gamt首先出现在卵裂期和囊胚期胚胎的卵黄中央。尾芽期到早体节期，gamt的表达渐渐的从卵黄扩散到YSL。但胚胎组织的其他部分尚未检测到gamt mRNA的存在。16hpf开始，gamt除了继续表达在YSL外，也开始出现在成熟的体节中。17-22hpf，尽管体节中的mRNA有上调的趋势，但gamt基本上一直维持着类似的表达模式。与agat的表达比较类似，gamt在48hpf从体节中消失，但是持续表达在YSL，并且出现在肝脏中。与agat不同的是，gamt还出现在48hpf胚胎的肠道上皮细胞中。成体斑马鱼中gamt强烈表达的区域包括视网膜、心脏、肝脏、小肠杯状细胞、胰腺、卵巢，其中最强的是肝脏，特别是肝门区，其次是心脏和胰腺。gamt不表达的部位较少，只有3个器官的局部部位，即晶状体纤维、小肠(固有膜、肌层、浆膜)和Ⅲ期卵母细胞。斑马鱼ct1基因由13个外显子组成。演绎的斑马鱼CT1蛋白质由652个氨基酸组成，理论分子量为73.0075kDa，蛋白质的等电点为5.07。ct1在基因组上有2个完整拷贝，分别位于8号和23号染色体上。ct1在斑马鱼胚胎发育过程中具有动态的表达图式如下：ct1的表达与agat和gamt有同有异。卵裂期到早体节期，ct1的表达广泛的存在于卵黄和YSL以外的整个胚胎中。随后表达渐渐局限在体节、视泡和CNS中。24和30hpf胚胎中，ct1强烈的表达在所有的体节中(包括新形成的和已经形成的体节)。48hpf时，ct1在体节中的表达下调到一个较低的水平，但明显的表达在前肠中。成体斑马鱼中ct1强表达的部位较多，包括视网膜、晶状体、心脏、小肠、胰腺、卵巢。ct1不表达的部位较少，只有晶状体纤维、肝脏和小肠固有膜。斑马鱼agat、gamt和ct1基因在发育过程中的表达有几个规律。首先，ct1在卵黄、YSL和肝脏中一直没有表达，而agat／gamt则都表达在YSL和肝脏(gamt还表达在卵黄中)。其次，ct1在CNS中有表达，而agat／gamt则未检测到CNS的表达。最后，ct1表达在所有的体节(新形成和已经形成的)中，agat／gamt只表达在已经形成的体节中。与大鼠胚胎发育中3个同源基因的表达模式相比，我们发现，斑马鱼和大鼠agat、gamt和ct1基因在发育中的表达图式有很多相似的地方。例如，3个基因在2个物种胚胎的骨骼肌中都表达，agat和gamt在肝脏中都表达。当然2个物种的基因表达图式也有很多不同点。比如，大鼠胚胎中3个基因都在CNS中表达，而斑马鱼胚胎中只有ct1在CNS中表达；大鼠agat强烈的表达在胚胎的肾脏和胰腺，但斑马鱼胚胎的同源器官中未检测到agat的表达。3个肌酸代谢相关基因中，ct1的时空表达在大鼠和斑马鱼中的保守性最强，暗示着在鱼类和哺乳动物之间可能存在着相似的Cr转运机制。成体斑马鱼中agat、gamt和ct1的表达模式与成体哺乳动物中的同源基因的表达相比，有同有异。相同点如下：agat在脑、肝脏和胰腺中都表达；gamt在肝脏和胰腺中都表达，ct1在心脏和小肠中都表达而在肝脏中都不表达。不同点是，agat在哺乳动物的肝脏和胰腺中高表达，而在斑马鱼中相应器官的表达非常弱，gamt在哺乳动物心肌中低表达或者不表达，但在斑马鱼心肌中表达却很强，ct1在哺乳动物胰腺中低表达或者不表达，但是在斑马鱼胰腺中表达却很强。斑马鱼gamt基因的dsRNA导入斑马鱼受精卵后，胚胎发育到24小时后出现了3种类型的异常，胚胎的活动能力受到严重的影响。表明gamt基因对斑马鱼胚胎的正常发育以及活动能力都有十分重要的作用。虽然已有关于文昌鱼和斑马鱼肌酸的报道，但对于它们体内肌酸的来源，学术界却一直都有争议。是来自环境或者食物中，还是它们也具有高等脊椎动物中的内源合成的机制，一直没有定论。本文对agat、gamt和ct1的研究证实，在文昌鱼和斑马鱼中确实存在着与哺乳动物中类似的Cr合成和转运系统，回答了长久以来人们对无脊椎动物和低等脊椎动物中肌酸来源的疑问。由于文昌鱼在进化上的特殊地位，本文对文昌鱼agat、gamt和ct1的研究还将为肌酸代谢途径的进化以及人类肌酸缺陷综合症(CDS)的起源提供一定的线索。本文对斑马鱼agat、gamt和ct1的研究证实，鱼类的Cr合成与转运机制(特别是Cr转运系统)，与哺乳动物之间存在着很高的相似性。因此，对斑马鱼agat、gamt和ct1的进一步的研究，将为人类CDS致病机理的研究提供新的模型，并为CDS的诊断和治疗提供新的依据。(本文来源于《山东大学》期刊2007-03-30）
张颖[6]（2007）在《酒精对胚胎发育的影响及文昌鱼、斑马鱼Mef2 MRLC和hadh2基因的研究》一文中研究指出关于酒精对人类胎儿的发育毒性最初报道于1968年，孕妇饮酒会导致胎儿酒精综合症(FAS)。FAS的主要特征是发育延迟、心脏异常、中枢神经系统异常、颅面部特征异常及骨骼缺陷等。据估计，在一般人群中，新生儿的FAS发生率为1.2‰。中枢神经系统是酒精的作用靶标，酒精处理会导致神经管缺陷(neural tube defeots，NTDs)，而NTDs是最普遍的先天性缺陷之一，发生率为0.5-12‰，但对其发病机制尚不清楚。斑马鱼属硬骨鱼，是发育生物学的模式生物之一，已被证明为人类疾病和药物毒性评价的理想动物模型。本研究以斑马鱼为模式动物，研究酒精对斑马鱼早期胚胎发育的影响，试图揭示酒精对胚胎发育的影响机制，以期为人类先天性神经管缺陷的防治提供理论依据，为孕妇杜绝饮酒和优生优育提供科学指导。本研究首先用不同浓度的酒精处理不同发育时期的斑马鱼胚胎，通过系统观察发现，酒精对斑马鱼胚胎发育的影响存在明显的时期和浓度依赖性，3％酒精于dome期开始处理胚胎3h对胚胎的体轴发育影响明显，极易引起轴裂(split axis)，即体轴后部出现分叉，但在近尾部区又合在一起。综合形态学、组织学观察及原位杂交结果发现，轴裂胚胎的体轴后部出现了2条脊索、神经管及2套体节，与人类的神经管缺陷脊柱裂的表型有相似性。通过分析推断，轴裂胚胎2条神经管和2套体节的形成可能是由裂开的脊索诱导的。实验还发现，酒精处理可明显地延迟胚胎的发育，从dome期开始处理3h后，酒精处理胚胎仅处于50％下包期，而正常胚胎发育至接近70％下包，受精后大约11h酒精处理胚胎仍处于原肠胚期，而胚胎细胞的集中延伸运动是该时期的关键事件。为了进一步探寻酒精引起轴裂的致畸机制，利用原位杂交方法研究了酒精处理胚胎中几个发育相关重要基因的表达，结果发现，酒精处理对体轴发育相关基因ntl，MyoD，neurogeninl，tbx6和gsc的表达图式具有明显的影响，特别于受精后大约11h，酒精处理胚胎与正常胚胎上述5个基因的表达图式差异显着，ntl的表达区域在酒精处理胚胎的背部分为两部分，MyoD的表达区域变宽，neurogeninl在腹侧原神经细胞丛中的表达出现分叉，tbx6的表达区域明显变大，且在预定体节板中的表达图式不规则，gsc的表达区域分为两部分，这些结果提示，酒精干扰神经外胚层和中胚层细胞的集中延伸运动，特别是ntl表达细胞不能集中到体轴中线处。而ntl已证明与斑马鱼胚胎的集中延伸运动存在密切关系，是脊索区集中的一个关键调节子，与非经典的Wnt信号通路共同调节斑马鱼身体后部的形态发生。因此可以推断，酒精干扰胚胎细胞的集中延伸运动引起轴裂。文昌鱼是一种头索动物，被认为是现存的最接近于脊椎动物的无脊椎动物，具有许多脊椎动物发育相关基因的同源基因，是研究动物发育机制及脊椎动物起源与进化的典型材料。斑马鱼是研究脊椎动物发育机制的理想动物模型。随着分子水平研究的不断深入，对文昌鱼和斑马鱼发育机制的研究取得了较大进展，发现了一些重要的发育相关基因。但是，动物胚胎发育受动态的、网络化的基因调控，还需要做大量的深入、系统的研究。本研究首次克隆了文昌鱼发育相关基因AmphiMef2、Amphi-mMRLC和hadh2的全长cDNA，并对其进行了演绎蛋白特性分析、进化生物学分析及发育表达研究。为了进一步揭示在进化过程中基因功能的变化，我们又克隆了斑马鱼的Z-MRLC和hadh2基因，并与文昌鱼的同源基因进行了比较研究。本研究为揭示文昌鱼、斑马鱼的发育机制及阐明在生物进化过程中基因功能的变化提供了重要资料。通过对青岛文昌鱼的cDNA文库进行大规模测序，发现了一个与其它物种的肌细胞增强因子2(Mef2)基因的3′端序列具有较高同源性的EST片段，通过设计兼并引物进行RT-PCR，获得了全长cDNA。演绎蛋白的的氨基酸序列分析结果表明，演绎蛋白具有高度保守的MADS和MEF结构域，与MADS家族的其它MEF2成员类似，这两个区域与其它物种的相应区域的氨基酸一致性在90％以上，因此，将该cDNA定名为AmphiMef2。进化生物学分析表明，该蛋白更接近于脊椎动物的同源蛋白，位于脊椎动物分支的基部。肌细胞增强因子2属转录因子MADS家族成员，它能控制脊椎动物肌肉特异基因的表达，但在无脊椎动物中，并非所有的Mef2基因都是肌肉发育所必需的。原位杂交结果显示，AmphiMef2具有明显的时空表达特异性，首先在早神经胚(大约受精后10h)的预定体节中胚层中表达，之后在体节和未分割的预定体节中胚层中表达。但从幼虫早期(24h)开始，前部体节中的表达水平开始下调。36h幼虫期，只在后部体节中检测到它的表达。至48h幼虫期，AmphiMef2在整个体节中的表达消失，其表达区域转移至口前窝(一个与脊椎动物腺垂体同源的器官)，且持续表达至72h幼虫期。实验结果提示，文昌鱼AmphiMef2可能不但参与肌肉发生，而且可能在口前窝的发育或功能发挥中起作用。AmphiMef2是否在文昌鱼生殖内分泌系统中起作用值得进一步研究证实。通过对青岛文昌鱼神经胚cDNA文库进行规模化测序，并借助于RT-PCR，获得了含有504 bp完整开放阅读框的Amphi-mMRLC cDNA序列，该序列编码167个氨基酸。根据GenBank的序列设计引物，利用RT-PCR获得含有519 bp完整开放阅读框的斑马鱼Z-MRLC(Similiar to 19.9 KD myosin light chain isoform 1)cDNA序列，该序列编码172个氨基酸。对这两个cDNA序列演绎蛋白的蛋白质特性分析比较发现，Amphi-mMRLC与Z-MRLC蛋白具有一定的相似性，均具有EF-hand结构域，蛋白质的等电点接近，二级结构中的无规则卷曲比例接近，但是这两个蛋白之间也存在明显的差异，如序列长度、氨基酸组成、磷酸化位点的数量等。序列比对结果表明，Amphi-mMRLC和Z-MRLC演绎蛋白的氨基酸一致性为46％，与爪蟾、牛、鸡、人、褐家鼠及海绵同源蛋白的氨基酸一致性达46％-47％。在构建的系统发生进化树中，文昌鱼Amphi-mMRLC和斑马鱼Z-MRLC序列分别位于无脊椎动物和脊椎动物分支上，基本符合生物进化规律。整封原位杂交结果表明，文昌鱼和斑马鱼的MRLC基因的表达图式存在明显差异。Amphi-mMRLC首先在文昌鱼早神经胚期的预定体节中胚层中表达，随后限定在体节及肌刀中表达，并且这种表达模式持续至72h幼虫期。在文昌鱼整个发育过程中，在非肌刀肌肉组织中未检测到Amphi-mMRLC的表达。但是，在斑马鱼的体节中并未检测到Z-MRLC的表达。Z-MRLC于体节期在心脏原基、头部中胚层中的表达较强，在分化中的内胚层中表达较弱。受精后72h，它的表达限定在心脏、背部主动脉、肠道上皮和耳泡中。由于文昌鱼Amphi-mMRLC与其它无脊椎动物的同源基因均在肌肉组织中表达，因此推断，无脊椎动物的MRLC可能参与肌肉发生。而脊椎动物的MRLC家族具有更多的成员及更广泛的功能。由此可见，MRLC家族成员在进化过程中发生了变化，出现了新的成员和新的功能。羟酰基辅酶A脱氢酶Ⅱ(hadh2)是一种多功能线粒酶，它具有多种生理功能，并与人类一些疾病特别是先天性出生缺陷存在密切关系。hadh2基因突变会造成MHBD(2-甲基-3羟基丁酰CoA脱氢酶)不足，而MHBD不足会引起一种异亮氨酸代谢先天性出生缺陷。通过对青岛文昌鱼cDNA文库进行规模化测序及借助于RT-PCR，我们首次获得了文昌鱼hadh2基因的全长cDNA。为了进一步研究hadh2在文昌鱼和斑马鱼胚胎发育中的作用及其在进化过程中的功能变化，我们根据GenBank中的斑马鱼hadh2序列设计特异引物进行RT-PCR，获得了斑马鱼hadh2片段。通过对文昌鱼和斑马鱼hadh2演绎蛋白的蛋白质特性分析比较发现，二者演绎蛋白的氨基酸序列长度相同，均为260个氨基酸，氨基酸组成略有差异，蛋白质的等电点和分子量几乎相等，均含有保守的结构域，即短链酒精脱氢酶(adh-short)结构域。进化生物学分析表明，文昌鱼hadh2与斑马鱼hadh2的氨基酸一致性达70％，文昌鱼的hadh2位于系统发生进化树脊椎动物分支的基部，与脊椎动物的同源蛋白具有较近的亲缘关系。胚胎整封原位杂交结果表明，文昌鱼hadh2首先于神经胚中期(受精后大约12h)分化中的内胚层和中胚层中表达，之后在内胚层、脏壁中胚层及后部神经管中表达，至30 h幼虫期，其表达限定在肠道上皮和脏壁中胚层中，在神经管中的表达消失，至72h幼虫期，它的表达限定在肠道上皮中。与文昌鱼hadh2相比，斑马鱼的hadh2是一种母源性表达的基因，在原肠胚期表达下调，至晚体节期，hadh2在头部中胚层、内胚层及眼睛中的表达较强，在中枢神经系统中的表达较弱，但在后部神经管中未检测到hadh2的表达。由此可见，hadh2可能在文昌鱼和斑马鱼胚胎发育过程中起重要作用，但是在进化过程中某些功能发生了变化。(本文来源于《山东大学》期刊2007-03-30）
喻丹[7]（2005）在《胚胎发育过程中细胞运动的分子机制：皮层蛋白介导斑马鱼和文昌鱼原肠化运动》一文中研究指出皮层蛋白(cortactin)是一种微丝细胞骨架调控蛋白,它与肌动蛋白纤丝相结合,参与调控细胞皮层区微丝的聚合和微丝细胞骨架的组织。作为细胞内 Src类酪氨酸蛋白激酶的主要底物,它还代表了一类高度保守的皮层信号蛋白家族。离体实验证明皮层蛋白是细胞运动的重要调控因子,但由于成体组织不透明,难以观察,且细胞运动不活跃,因此一直缺乏相应的体内实验证据。另一方面,细胞运动在所有后生动物发育过程中起重要作用,细胞运动机制的阐明对于形态发生机制的理解具有重要意义,但是由于缺乏动物活体内细胞运动的研究,对个体发育中细胞运动的分子机制至今了解较少。本研究以斑马鱼(Danio rerio)和文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtaoense)胚胎为实验模型,从基因结构、表达图式、功能分析等方面在分子水平、细胞水平、组织水平上系统研究了皮层蛋白调控的活体状态下胚胎发育过程中原肠化细胞运动的分子机制,并探索了脊椎动物进化过程中原肠化形态发生运动的演化。 研究首先克隆了斑马鱼皮层蛋白基因,它编码含有 504 个氨基酸残基的蛋白质,蛋白质序列比对表明斑马鱼与高等脊椎动物的皮层蛋白具有高度的序列结构相似性,都含有四个特定的功能域即氨基端的 NTA 结构域,羧基端的 SH3 结构域和位于二者中间的皮层蛋白重复序列结构域和 α-螺旋结构域。研究鉴定了斑马鱼皮层蛋白基因组序列,将其定位到斑马鱼基因组第 19 号染色体上,斑马鱼皮层蛋白基因长度约 7Kb,含 15 个外显子和 14 个内含子。研究还首次鉴定了在斑马鱼第 19 号染色体上存在的一个从硬骨鱼到哺乳动物均高度保守的同线性基因连锁簇 CCND1-ORAOV1-FGF19-FGF4-FGF3- CORTACTIN-SHANK2,利用比较基因组学方法鉴定了斑马鱼基因组中位于该连锁簇中的 2 个新基因 ORAOV1和 SHANK2 及定位于斑马鱼 4 号染色体上的皮层蛋白旁系同源基因 HS1。 Western blotting 检测发现,皮层蛋白在原肠期表达显着提高,整装抗体染色表明在原肠期开始时,皮层蛋白大量表达于胚盾附近区域即未来的胚胎背侧,在发生汇聚迁移的胚盾附近的细胞中分布较多,通过激光扫描共聚焦显微术观察,(本文来源于《中国科学院研究生院（海洋研究所）》期刊2005-05-01）
文昌鱼斑马鱼论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
随着斑马鱼基因组测序工作的完成,人们发现斑马鱼基因与人类基因的保守度高达87%,使得斑马鱼作为一种研究人类基因功能的模式动物越来越受到关注。转座子在低等生物转基因和基因诱变分析中得到了广泛的应用,对这些生物基因功能的研究起了重要作用。目前用于斑马鱼基因功能研究的转座子主要是Tol2,结合基因捕获技术较广泛的被应用于斑马鱼突变体筛选。Tol2的转座遵循“切离-粘贴”机制,其插入基因组时会产生插入位点处8个碱基的重复,但其存在切离后留下的痕迹不一的缺点,不易实现对突变表型的回复。PiggyBac转座子(PB)是一种来源于鳞翅目昆虫的DNA转座子,最初的序列在粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞系中分离,其转座遵循“切离-粘贴”机制,PB特异地插入到TTAA四碱基位点,插入的同时在其两侧形成TTAA四碱基重复。它可以从插入位点处精确地切离,不留下任何痕迹,使插入位点完全回复到插入以前的状态。该转座子目前已经开发成为转基因昆虫中应用最为广泛的载体之一,它已被证明能够在四个目十数种昆虫中转座。2005年Ding等的研究发现其也能在脊椎动物如小鼠中实现高效转座；2006年,Fraser等发现PB转座子在斑马鱼原代培养细胞及胚胎中均能进行转座,揭示了PB转座系统在斑马鱼基因功能研究中具有广泛的应用前景。我们对piggyBac(PB)转座系统中的helper质粒-转座酶载体质粒(pCMV-hyPBase)和donor质粒-转座子载体质粒(5’-PTK-3’)分别进行了重新构建,得到了一个二元系统。Helper质粒pCMV-hyPBase-IRES-EGFP构建过程如下：将来源于质粒pPRIG的IRES-EGFP片段插入到XbaI和XhoI双酶切的质粒pCMV-hyPBase的缺口,从而构建了双顺反子表达载体质粒：pCMV-hyPBase-IRES-EGFP; Helper质粒pZPCO.5-hyPBase-IRES-EGFP构建过程如下：将克隆得到的斑马鱼ZPC0.5启动子插入到SpeI和EcoRI双酶切的质粒pCMV-hyPBase-IRES-EGFP缺口,替换掉CMV启动子,即得到双顺反子表达载体质粒：pZPC0.5-hyPBase-IRES-EGFP。Donor质粒PTK-mCherry构建过程如下：将以pmCherry-N1质粒为模板克隆得到的mCherry基因片段插入到用NcoI和BelI双酶切的质粒5’-PTK-3’缺口,构建得到了基因捕获载体质粒：PTK-mCherry。质粒pCS2+-hyPBase构建过程如下：将来源于质粒pCMV-hyPBase的hyPBase片段插入到用EcoR1和Xho1双酶切的质粒pCS2+的缺口,即构建了转座酶hyPBase mRNA合成模板载体质粒pCS2+-hyPBase。将pCMV-hyPBase-IRES-EGFP质粒载体线性化后显微注射到斑马鱼单细胞期受精卵中,筛选得到了EGFP遍表达的helper品系转基因斑马鱼,并且发现其中一些鱼的这一性状能够稳定传给F1代,从而得到了此转基因品系的founder斑马鱼。以线性化的pCS2+-hyPBase为模板,体外转录合成了转座酶hyPBase mRNA。将此mRNA与基因捕获载体质粒PTK-mCherry共注射到斑马鱼单细胞期受精卵中,筛选得到了mCherry的表达在时间及空间上均不同的donor品系转基因斑马鱼,且发现mCherry在F0代中有将近8%的表达率,证明piggyBac转座子能够在斑马鱼中进行有效转座且捕获到不同基因,因此piggyBac转座系统在斑马鱼中可以作为一种新的技术手段,有效实现突变体的筛选。我们计划通过helper及donor品系斑马鱼的交配策略在下一代中实现在体(in vivo)转座,从而筛选到更多新的突变体,希望PB转座系统的应用能进一步推动解析脊椎动物基因功能的进程,对人类生物学和疾病研究有所帮助。胸腺是脊椎动物中重要的免疫器官,在其发育过程中受多种基因的协调控制,其中pax1,pax9,eya1、sis1、six4,foxnI等的作用最为关键。文昌鱼是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类群的典型代表,被认为是研究脊椎动物起源和进化的新兴模式动物。以往的观点认为,文昌鱼作为头索动物不存在获得性免疫系统。但最近的研究表明,许多脊椎动物获得性免疫系统中的重要基因如six家族基因在文昌鱼中存在同源或者相似的基因。利用生物信息学分析,我们发现在佛罗里达文昌鱼数据库中存在脊椎动物胸腺发育关键基因pax1,pax9,eya1、six1、six4,foxnI等的同源基因,并对这些同源基因进行了进化学分析；利用青岛文昌鱼与佛罗里达文昌鱼的高度相似性,以佛罗里达文昌鱼数据库中的基因序列为模板设计引物,利用RT-PCR的方法克隆倒了青岛文昌six1基因片段(包含完整CDS)及six4基因片段；对six1基因演绎蛋白序列进行了结构及性质的分析,Six1演绎蛋白长200个氨基酸,理论分子量为22057.6Da,等电点为7.84,是一亲水蛋白,属于homeodomain超家族.
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
文昌鱼斑马鱼论文参考文献
[1].陈蓉.文昌鱼CAL和斑马鱼PTX的晶体结构与进化机制研究[D].中国农业大学.2015
[2].白长存.PiggyBac转座系统在斑马鱼研究中的应用及文昌鱼Six1基因的克隆和生物信息学分析[D].山东大学.2012
[3].张宁.文昌鱼和斑马鱼C1q、C3及G10的进化分析及基因表达的研究[D].山东大学.2009
[4].李建伟.文昌鱼发育相关基因Smad、Tmp21表达及文昌鱼斑马鱼Rab23同源基因的比较研究[D].山东大学.2007
[5].王利凤.文昌鱼和斑马鱼agat、gamt和ct1的克隆、进化学分析、表达图式及斑马鱼gamt的功能研究[D].山东大学.2007
[6].张颖.酒精对胚胎发育的影响及文昌鱼、斑马鱼Mef2MRLC和hadh2基因的研究[D].山东大学.2007
[7].喻丹.胚胎发育过程中细胞运动的分子机制：皮层蛋白介导斑马鱼和文昌鱼原肠化运动[D].中国科学院研究生院（海洋研究所）.2005
论文知识图
