首页> 正文

1型鸭甲肝病毒纳米抗体的筛选与鉴定

2020-12-02阅读(497)

1型鸭甲肝病毒纳米抗体的筛选与鉴定

论文摘要

1型鸭甲肝病毒（Duck Hepatitis A Virus Type 1,DHAV-1）临床上主要引起雏鸭急性肝炎,并具有高度致死性。VP1蛋白是DHAV-1主要衣壳蛋白,并诱导机体产生中和抗体。现有最灵敏特异的DHAV-1诊断方法主要是基于单克隆抗体（monoclonal antibodies,mAbs）,但mAbs制作成本高,很难大规模生产等因素,限制了其在相关领域的应用。为了寻找传统mAbs的替代抗体,本研究以商品化DHAV-1活疫苗为免疫原免疫双峰驼,成功构建了大小为6×106、插入率为96%的噬菌体展示免疫纳米抗体（Nanobody,Nb）库,以DHAV-1 VP1蛋白为抗原进行了三轮特异性纳米抗体筛选,成功筛选鉴定了一株DHAV-1纳米抗体。在此基础上,本研究成功鉴定了该纳米抗体的线性表位为174PAPTST179,其在DHAV-1毒株之间高度保守,为特异灵敏检测DHAV-1提供了强有力的工具。本研究内容分主要分为以下三部分:1.全长DHAV-1 VP1蛋白的原核表达以DHAV-1传染性克隆为模板,利用PCR扩增VP1基因片段,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其分别克隆入pET-32a（+）和pGEX-6P-1原核表达载体,转化到Rosetta（DE3）表达菌株,37℃1mM IPTG诱导3h后,经SDS-PAGE和Western blot鉴定VP1-His和VP1-GST蛋白得到成功表达。2.DHAV-1VP1蛋白纳米抗体的筛选与鉴定以商品化DHAV-1活疫苗为免疫原免疫双峰驼,6次免疫过后,通过ELISA鉴定血清中DHAV-1特异性抗体滴度为1:50000。提取外周血淋巴细胞总RNA,通过RT-PCR得到cDNA,以cDNA为模板,经巢式PCR得到目的VHH基因,通过酶切位点连接到pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化雄性大肠杆菌TG1,成功构建了大小为6×106的噬菌体展示免疫纳米抗体库。以VP1-His为靶标,经过3轮富集筛选,成功筛选得到1株特异性针对DHAV-1 VP1的纳米抗体,命名为Nb25。3.Nb25抗原表位的鉴定首先将DHAV-1 VP1基因分五段,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点分别克隆入pGEX-6P-1原核表达载体,转化到Rosetta（DE3）表达菌株,诱导表达后分段蛋白经Dot-blot鉴定,初步鉴定Nb25表位位于172PLPAPTSTTS181之间,然后将肽段172PLPAPTSTTS181分别从N端和C端缩进,将截短的6个肽段进行Dot-blot鉴定,经鉴定174PAPTST179为Nb25精确表位。经同源性对比,该表位在NCBI已发布DHAV-1毒株中高度保守,而在DHAV-2和DHAV-3存在变异。综上所述,本研究成功利用噬菌体展示技术筛选制备了针对DHAV-1的纳米抗体Nb25,并且Nb25具有高度特异性,只与DHAV-1病毒离子反应,与其他病毒不反应。

论文目录

  • 符号说明
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 1 引言
  •   1.1 DHAV研究概述
  •     1.1.1 DHAV病原学概述
  •     1.1.2 DHAV-1 流行病学情况
  •   1.2 纳米抗体概述
  •     1.2.1 VHH结构
  •     1.2.2 VHH库种类
  •     1.2.3 VHH及其衍生物的表达
  •   1.3 B细胞表位定位的不同方法
  •   1.4 研究的目的意义
  • 2 材料与方法
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 菌（毒）株、质粒
  •     2.1.2 酶和主要试剂
  •     2.1.3 主要仪器
  •     2.1.4 实验所用的溶液及其配制
  •   2.2 方法
  •     2.2.1 DHAV-1 衣壳蛋白VP1的原核表达
  •     2.2.2 DHAV-1 特异性纳米抗体库的构建
  •     2.2.3 DHAV-1 VP1特异性纳米抗体筛选
  •     2.2.4 DHAV-1 VP1特异性纳米抗体的鉴定
  •     2.2.5 纳米抗体Nb25 抗原表位筛选与鉴定
  • 3 结果与分析
  •   3.1 VP1的原核表达
  •     3.1.1 VP1基因PCR扩增
  •     3.1.2 VP1重组原核表达载体酶切鉴定
  •     3.1.3 VP1融合蛋白表达
  •     3.1.4 VP1融合蛋白Western blot分析
  •   3.2 DHAV-1 特异性VHH库的构建70
  •     3.2.1 血清效价测定
  •     3.2.2 文库VHH基因扩增
  •     3.2.3 文库插入率鉴定
  •   3.3 DHAV-1 VP1特异性纳米抗体筛选
  •     3.3.1 VP1特异性VHH富集
  •     3.3.2 可溶性纳米抗体ELISA
  •   3.4 DHAV-1 VP1特异性纳米抗体的鉴定
  •     3.4.1 pET28as-VHH表达载体构建
  •     3.4.2 纳米抗体表达与纯化
  •     3.4.3 VP1特异性纳米抗体反应性和特异性鉴定
  •     3.4.4 IFA
  •   3.5 纳米抗体Nb25 抗原表位筛选与鉴定
  •     3.5.1 VP1分5段PCR扩增
  •     3.5.2 VP1分5 段融合蛋白表达
  •     3.5.3 Nb25 抗原表位鉴定
  •     3.5.4 同源性对比分析
  • 4 讨论
  • 5 结论
  • 6 参考文献
  • 7 致谢
  • 8 攻读硕士学位期间发表论文情况

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 薛文湘

    导师: 姜世金

    关键词: 型鸭甲肝病毒,纳米抗体,噬菌体展示,抗原表位

    来源: 山东农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 山东农业大学

    基金: 国家自然科学基金面上项目(31772754),国家重点研发计划项目(2017YFD0500800),山东省现代农业产业技术体系(SDAIT-11-15),山东省双一流建设优势团队项目(SYL2017YSTD11)

    分类号: S852.65

    总页数: 81

    文件大小: 2825K

    下载量: 102

    相关论文文献

    • [1].数字聚合酶链式反应法检测贝类和浆果中甲肝病毒[J]. 中国食品卫生杂志 2020(04)
    • [2].基因C型鸭甲肝病毒间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用[J]. 中国预防兽医学报 2017(04)
    • [3].鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立[J]. 中国兽医杂志 2020(03)
    • [4].鸭甲肝病毒的综合诊断与防治[J]. 畜牧兽医科技信息 2019(09)
    • [5].公审甲肝病毒[J]. 肝博士 2011(01)
    • [6].鸭甲肝病毒基因A型和C型双价卵黄抗体的研制与保护效果研究[J]. 黑龙江畜牧兽医 2015(17)
    • [7].鸭甲肝病毒1型和3型间接ELISA方法的建立与应用[J]. 微生物学报 2015(04)
    • [8].鹅源鸭1型甲肝病毒的分离与鉴定[J]. 福建农业学报 2012(11)
    • [9].雏鸭混合感染基因A型和基因C型鸭甲肝病毒研究[J]. 西南民族大学学报(自然科学版) 2014(02)
    • [10].基因A型鸭甲肝病毒弱毒株免疫雏鸭的8种细胞因子mRNA变化分析[J]. 畜牧兽医学报 2016(06)
    • [11].基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定[J]. 中国预防兽医学报 2014(04)
    • [12].一起鸭甲肝病毒1型和3型混合感染的研究报道[J]. 家禽科学 2014(07)
    • [13].基因C型鸭甲肝病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报 2015(03)
    • [14].鸭甲肝病毒的分子生物学研究进展[J]. 中国兽医杂志 2010(03)
    • [15].基因C型鸭甲肝病毒实验感染雏鸭的组织病理学及病毒分布[J]. 畜牧兽医学报 2013(04)
    • [16].鸭甲肝病毒RT-LAMP检测方法的建立[J]. 家禽科学 2019(06)
    • [17].一株鹅源鸭甲肝病毒1型的分离及AGP和RT-PCR鉴定[J]. 家禽科学 2017(02)
    • [18].基因C型鸭甲肝病毒VP1基因的克隆及原核表达[J]. 中国预防兽医学报 2012(09)
    • [19].鸭甲肝病毒VP1基因克隆及序列分析[J]. 中国兽药杂志 2015(02)
    • [20].鸽源鸭甲肝病毒1型的分离与鉴定[J]. 福建农业学报 2012(11)
    • [21].鸭甲肝病毒VP1蛋白主要抗原域的原核表达及间接ELISA方法的初步建立[J]. 中国动物传染病学报 2015(02)
    • [22].鸭甲肝病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立及其在雏鸭体内分布规律[J]. 中国兽医学报 2016(05)
    • [23].鸭甲肝病毒VP1基因的克隆和序列分析[J]. 中国兽医杂志 2009(09)
    • [24].基于VP0蛋白的用以检测1型鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA的建立和应用[J]. 中国兽医科学 2015(12)
    • [25].胰腺炎型鸭1型甲肝病毒结构蛋白VP1基因的克隆和表达[J]. 福建农业学报 2014(05)
    • [26].致胰腺泛黄鸭1型甲肝病毒全基因组分子特征[J]. 微生物学报 2014(09)
    • [27].樱桃谷种鸭鸭1型甲肝病毒的分离鉴定及其VP1基因的序列分析[J]. 福建农业学报 2014(11)
    • [28].石嘴山市2010年部分中小学生甲肝免疫状况分析[J]. 医学动物防制 2013(01)
    • [29].75例疑似甲型肝炎患者血清甲肝病毒IgM抗体检测结果分析[J]. 浙江预防医学 2008(01)
    • [30].我国部分地区鸭1型甲肝病毒流行株遗传变异分析[J]. 福建农业学报 2018(02)

    标签：;  ;  ;  ;  

    1型鸭甲肝病毒纳米抗体的筛选与鉴定
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6