烟草NtTkr尾部T1084缺失和替换突变原核表达载体的构建及诱导表达

论文摘要

已知烟草驱动家族新成员NtTkr尾部第3个卷曲螺旋（Coiled-coil, CC3）第1 084位苏氨酸(T1084)对靶蛋白的结合至关重要,通过对NtTkr尾部的酵母双杂交筛选得到多个与Ntkr互作的候选蛋白。为确定T1084缺失(T1084d)或替换（T1084A）突变对NtTkr与这些候选蛋白体外互作的重要性,首先以pBI121-NtTkr为模板,通过重叠延伸PCR扩增得到烟草NtTkr尾部T1084d、T1084A片段并将其克隆入质粒pUC19,经蓝白斑筛选、SmaⅠ-BamHⅠ双酶切鉴定后送去测序,获得正确的T1084缺失和替换的NtTkr尾部;然后将重组的pUC19-T1084d、pUC19-T1084A与pMXB10进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切,回收目的片段和载体片段并连接,连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α,筛选得到重组子,进行NotⅠ-NdeⅠ双酶切鉴定,最终成功构建pMXB10-NtTkr-T1084A和pMXB10-NtTkr-T1084d原核表达载体;最后将原核表达载体pMXB10-T1084d和pMXB10-T1084A转入BL21（DE3）中,分别经0.05,0.06 mmol/L IPTG浓度诱导,12%SDS-PAGE电泳检测蛋白质表达情况,结果证明获得了NtTkr-T1084d-1317和NtTkr-T1084A-1320的成功表达,且IPTG浓度大于0.06 mmol/L时,均可高效表达约77 ku的NtTkr-T1084A-1320和76.2 ku的NtTkr-T1084d-1317蛋白量。

论文目录

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 童文艳,胡孟可,徐林娜,乔慧聪,李芬

关键词: 烟草,缺失和替换突变,载体构建,诱导表达

来源: 华北农学报 2019年03期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 河南师范大学生命科学学院

基金: 教育部留学回国人员启动基金项目(5201049130104)

分类号: Q943.2

页码: 38-42

总页数: 5

文件大小: 1065K

下载量: 115

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