拟南芥IQM3参与光周期成花调控的初步研究

论文摘要

高等植物个体发育的核心在于成花,成花过程标志着植物从营养生长阶段转化为生殖发育阶段,由成花基因网络精密调控。在整个成花网络中,共有6条主要的遗传调控途径:温度、年龄、赤霉素、春化、光周期和自主途径。这些途径既相互影响,又彼此独立,共同调控植物的成花。由AT3G52870编码的IQM家族成员AtIQM3与其他IQM家族成员一样,是含有1个IQ基序的钙调素结合蛋白,其缺失突变体iqm3-1和iqm3-2在短日照下表现为早花,而在长日照下其开花期与野生型相似。提示,IQM3可能通过光周期途径调控成花。本研究通过生理学实验、基因表达分析、酵母双杂交等手段对IQM3参与光周期成花调控的功能进行初步研究,得到如下结果:1)IQM3基因突变体的鉴定。由抗性筛选和分子学鉴定,获得iqm3-1和iqm3-2的纯合子。经回交实验证实,iqm3-1和iqm3-2是单基因突变。2)IQM3所涉及的开花调控遗传途径的初步确定。在短日照条件下,iqm3-1和iqm3-2均为早花,而在长日照条件下,其开花期与与野生型相似,说明IQM3可能参与光周期途径成花调控。与野生型Col-0相比,在红光条件下,尽管下胚轴长度和种子萌发率没有显著性差异,但是iqm3-1和iqm3-2的子叶开放度有显著性差异;而在蓝光和远红光条件下,突变体的前述3个指标在与野生型的没有显著性差异。进一步印证了,IQM3参与光周期成花调控。此外,春化处理,iqm3-1、iqm3-2和Col-0的开花进程基本一致,说明IQM3不参与春化途径调控;用赤霉素生物合成抑制剂多效唑（Paclobutrazol,PAC）处理,iqm3-1、iqm3-2和Col-0的开花时间也基本一致,说明IQM3不参与赤霉素途径成花调控。还发现,iqm3-1、iqm3-2和野生型的种子对多效唑的敏感性相似,初步说明IQM3不参与于赤霉素合成;观察植株表皮毛,发现iqm3-1和iqm3-2的表皮毛数量和结构与野生型没有差异,初步说明IQM3不参与年龄途径成花调控。3)IQM3突变对成花关键基因表达的影响。与野生型Col-0相比,iqm3-1和iqm3-2的光周期开花调控的关键因子CO、FT、SOC1和LFY的转录水平上调,而其他途径的关键基因没有发现转录水平的变化;同时还发现,iqm3-1和iqm3-2的FT蛋白水平在叶片和茎尖均上调。说明IMQ3参与拟南芥光周期途径成花,进一步印证表型观察的结果。4)IQM3钙调素结合活性的研究。由酵母双杂交实验可知,IQM3能够与CaM5结合。但是,IQM3的IQ基序的首位氨基酸V突变成E后,二者无法结合,说明IQ基序及其首位氨基酸是IMQ3与CaM结合的关键。5)此外,构建iqm3互补表达载体,转入iqm3-1和iqm3-2植株,筛选得到互补表达植株纯合体;还构建IQM3超表达载体,转入Col-0植株中,筛选得到超表达纯合体。在长日照条件下,互补表达植株的开花时间和莲座叶数与Col-0相似,而超表达植株开花晚并有更多莲座叶。

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第一章前言

1.1 钙调素与钙调素结合蛋白

1.2 含有IQ基序的拟南芥IQM家族

1.3 植物6条主要的成花调控途径及其关键基因

1.3.1 温度途径

1.3.2 光周期途径

1.3.3 春花途径

1.3.4 赤霉素途径

1.3.5 自主途径

1.3.6 年龄途径

1.4 研究目的和意义

第二章材料与方法

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌种和质粒

2.1.3 试剂

2.1.4 溶液和培养基

2.2 方法

2.2.1 生理学实验方法

2.2.2 赤霉素（GA3和GA4）含量检测

2.2.3 拟南芥DNA提取

2.2.4 拟南芥RNA的提取

2.2.5 质粒DNA的提取

2.2.6 PCR和 RT

2.2.7 RT-PCR和 RT-qPCR

2.2.8 DNA片段的回收

2.2.9 DNA片段的纯化

2.2.10 质粒转化大肠杆菌

2.2.11 酵母双杂交实验

2.2.12 重组质粒转化农杆菌

2.2.13 农杆菌介导的遗传转化

2.2.14 蛋白质提取

2.2.15 Western Blotting

2.2.16 实验验用引物

第三章结果与分析

3.1 iqm3-1和iqm3-2 的突变体的鉴定

3.1.1 纯合子的筛选与鉴定

3.1.2 突变体的遗传分析

3.2 iqm3-1和iqm3-2 的表型分析

3.2.1 开花表型

3.2.2 对不同光质光的感受

3.2.3 多效唑（Paclobutrazol, PAC）实验

3.2.4 春化实验

3.2.5 根长和侧根数

3.2.6 幼苗中的赤霉素含量

3.2.7 幼苗的PAC处理实验

3.2.8 表皮毛数量

3.3 成花途径中的关键基因表达分析

3.4 FT蛋白表达量分析

3.5 IQM3与CaM5 酵母双杂交实验

3.5.1 酵母表达载体的构建

3.5.2 酵母表达蛋白互作分析

3.6 互补与超表达植株构建与表型分析

3.6.1 互补与超表达植株的构建

3.6.2 互补与超表达植株的表型

第四章讨论与结论

4.1 IQM3 可能参与光周期途径调控拟南芥成花

4.2 拟南芥IQM3 可能调控根系中赤霉素的合成

4.3 IQ基序是IQM3与CaM结合的关键

4.4 结论

4.5 展望

参考文献

附录硕士期间发表的论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐浩

导师: 田长恩

关键词: 成花,光周期途径,钙调素结蛋白,拟南芥

来源: 广州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 广州大学

基金: 国家自然科学基金(NO.31770342)

分类号: Q943.2

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