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两株牦牛源BVDV1型对小鼠的致病性研究及灭活疫苗的初步制备

2020-12-08阅读(629)

两株牦牛源BVDV1型对小鼠的致病性研究及灭活疫苗的初步制备

论文摘要

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是有囊膜包裹的单股正链RNA病毒,该病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）。BVDV进入机体后可造成持续性感染和免疫抑制导致牛产奶量下降,繁殖力降低,生长迟缓和继发感染其他病原,对世界各国的养牛业及其他养殖业均造成了巨大的经济损失。近年来我国青藏高原地区牦牛感染BVDV日趋严重,给高原畜牧业造成了一定的经济损失。疫苗接种是预防BVDV感染的主要防控措施。本研究以本实验室分离的2株致细胞病变的牦牛源BVDV毒株SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015,研究BVDV对BALB/c小鼠的致病性。并制备灭活疫苗对免疫BALB/c小鼠和奶牛的抗体消长规律进行研究,取得的结果如下:1.2株牦牛源BVDV1型对BALB/c小鼠的致病性研究本实验室前期从青藏高原地区的牦牛中分离了2株致细胞病变的BVDV1型毒株SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015。为研究其对小鼠的致病性,本研究选取68周龄BALB/c小鼠为试验动物,通过腹腔注射的方式接种,以OregonC24V标准毒株为阳性对照。分别于接种后第5 d、7 d、10 d收集小鼠血液、粪便和组织器官,应用血常规、病理组织学和荧光定量PCR等方法对BVDV毒株感染BALB/c小鼠的致病性进行研究。结果显示感染2株BVDV1型毒株的BALB/c小鼠都表现出了一定的临床症状,主要表现为被毛粗糙、采食量降低、聚集成堆、精神沉郁和腹泻等。解剖可见肾脏、肝脏和肺脏均有出血点,脾脏边缘伴随轻微肿大,肠道内容物呈黄色水样状,且SMU-Z6/1a/SC/2016组小鼠表现的临床症状相比SMU-DJ2/1d/QH/2015组较严重。攻毒组淋巴细胞、白细胞和血小板含量都显著降低（p<0.05）。荧光定量PCR结果显示2株牦牛源BVDV1可以在小鼠的不同组织中被检测到,其中肺脏中病毒的荷载量最高,分别为1.47×107copies/μL（SMU-Z6/1a/SC/2016）和3.30×106copies/μL（SMU-DJ2/1d/QH/2015）。HE染色可见攻毒组肝脏静脉内出现炎性细胞浸润、肠绒毛上皮细胞坏死和脱落,还可见脾脏内吞噬细胞增多和脾小结反应性增生、肺泡萎缩和出血等病理变化,与OregonC24V组相比,SMU-Z6/1a/SC/2016组病理变化最严重,SMU-DJ2/1d/QH/2015组较轻。以上研究结果表明2株BVDV1成功感染了BALB/c小鼠,并引起一定的临床症状和不同程度的病理损伤。2.2株牦牛源BVDV1型灭活疫苗的制备及免疫效果评价本研究以SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株为疫苗候选株,与赛彼科MONTANIDE ISA 201 VG佐剂充分乳化制备了BVD灭活疫苗。选取68周龄BALB/c小鼠为试验动物,通过背部皮下多点注射的方式接种不同剂量的BVDV1型灭活疫苗。应用抗体中和试验对免疫BALB/c小鼠后的抗体消长规律进行研究。结果显示2株分离株制备的灭活疫苗免疫BALB/c小鼠二免后第5天中和抗体效价达到最高,其中SMU-Z6/1a/SC/2016最高值为1:177,SMU-DJ2/1d/QH/2015为1:89,研究结果表明,SMU-Z6/1a/SC/2016分离株制备的灭活疫苗免疫BALB/c小鼠后产生的抗体高于SMU-DJ2/1d/QH/2015灭活疫苗。以SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株与SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗免疫BALB/c小鼠的血清进行抗体交叉中和保护试验,其中和抗体效价可达1:177,而以SMU-Z6/1a/SC/2016分离株与SMU-DJ2/1d/QH/2015灭活疫苗免疫BALB/c小鼠的血清进行抗体交叉中和保护试验,中和抗体效价仅为1:22,明显低于SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗。该结果表明SMU-Z6/1a/SC/2016分离株制备的灭活疫苗诱导小鼠产生的中和抗体可以中和SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株。为进一步研究SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗免疫牛后的抗体消长规律,选取68月龄奶牛为试验动物,通过颈部肌肉的方式接种SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗,并以商品化牛病毒性腹泻/粘膜病、传染性鼻气管炎二联灭活疫苗（优邦生物）为阳性对照。应用抗体中和试验和ELISA的方法对免疫奶牛后的抗体消长规律进行研究。研究结果显示,SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗免疫奶牛二免后第7天中和抗体效价达到最高,最高值为1:1413。商品化灭活苗免疫奶牛二免后第28天产生的中和抗体效价达到最高,最高值为1:178,表明SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗免疫奶牛后产生的中和抗体显著高于商品化疫苗组（p<0.05）。以SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株与SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗免疫奶牛的血清进行抗体交叉中和保护试验,其中和抗体效价最高可达1:708,而SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株与商品化二联灭活疫苗免疫奶牛的血清进行抗体交叉中和保护试验,中和抗体效价仅为1:178,显著低于SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗免疫奶牛产生的中和抗体效价（p<0.05）,该研究结果表明SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗免疫奶牛产生的中和抗体可以中和SMU-DJ2/1d/QH/2015分离株。基于SMU-Z6/1a/SC/2016分离株E2重组蛋白建立的ELISA检测结果显示,SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗组的抗体水平（Cut-off值3.252）显著高于商品化二联灭活疫苗组（Cut-off值1.920）（p<0.05）。以上结果表明,SMU-Z6/1a/SC/2016分离株制备的灭活疫苗可刺激BALB/c小鼠和奶牛产生高水平的中和抗体,这为我国BVDV灭活疫苗的研制和疫苗候选株的筛选提供了一定的数据支持和指导意义。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 牛病毒性腹泻疫苗研究进展
  •   1.1 BVDV的生物学特性研究
  •     1.1.1 BVDV病原学研究
  •     1.1.2 BVDV分型
  •   1.2 BVDV对不同动物的致病性研究
  •   1.3 BVD疫苗
  •     1.3.1 灭活苗
  •     1.3.2 弱毒疫苗
  •     1.3.3 核酸疫苗
  •     1.3.4 亚单位疫苗
  •     1.3.5 基因工程活载体疫苗
  •   1.4 小结
  • 第2章 2 株牦牛源BVDV1 型对BALB/c小鼠的致病性研究
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 细胞与毒株
  •     2.1.2 试验仪器
  •     2.1.3 试验试剂
  •     2.1.4 试验动物及分组
  •   2.2 方法
  •     2.2.1 BALB/c小鼠攻毒及病料采集
  •     2.2.2 RNA提取
  •     2.2.3 组织荧光定量PCR的检测
  •     2.2.4 血液血常规的测定和组织HE染色
  •     2.2.5 数据分析
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 攻毒后小鼠的临床症状
  •     2.3.2 攻毒后小鼠的剖解病理变化
  •     2.3.3 荧光定量PCR扩增检测结果
  •     2.3.4 攻毒后小鼠的体重变化
  •     2.3.5 血液血常规检测结果
  •     2.3.6 组织HE染色
  •   2.4 讨论
  •   2.5 小结
  • 第3章 2 株牦牛源BVDV1 型灭活疫苗的制备及免疫效果评价
  •   3.1 材料
  •     3.1.1 细胞与毒株
  •     3.1.2 主要试剂
  •     3.1.3 试验仪器
  •     3.1.4 试验动物及分组
  •   3.2 方法
  •     3.2.1 病毒液制备
  •     3.2.2 灭活剂浓度及灭活时间优化
  •     3.2.3 病毒液灭活检验
  •     3.2.4 灭活疫苗的制备
  •     3.2.5 灭活疫苗的检验
  •     3.2.6 抗体中和试验
  •     3.2.7 灭活疫苗免疫BALB/c小鼠试验
  •     3.2.8 灭活疫苗免疫奶牛试验
  •     3.2.9 基于E2 重组蛋白间接ELISA方法的建立
  •     3.2.10 免疫奶牛后血清的ELISA测定
  •     3.2.11 数据分析
  •   3.3 结果
  •     3.3.1 灭活剂浓度及灭活时间优化
  •     3.3.2 病毒液灭活检验
  •     3.3.3 灭活疫苗的制备
  •     3.3.4 灭活疫苗的检验
  •     3.3.5 灭活疫苗免疫BALB/c小鼠试验
  •     3.3.6 灭活疫苗免疫奶牛试验
  •     3.3.7 免疫奶牛的抗体交叉保护试验
  •     3.3.8 基于E2 重组蛋白间接ELISA方法的建立
  •     3.3.9 免疫奶牛后血清的ELISA测定
  •   3.4 讨论
  •   3.5 小结
  • 结论与创新点
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 阮文强

    导师: 张斌

    关键词: 牦牛,致病性,灭活疫苗,抗体中和试验,免疫效果

    来源: 西南民族大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 西南民族大学

    基金: “十三五”国家重点研发计划项目(2016YFD0500907),四川省肉牛创新团队——现代繁殖技术研究与示范岗位团队

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27417/d.cnki.gxnmc.2019.000047

    总页数: 65

    文件大小: 1497K

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