金建刚[1]2004年在《MSCs诱导体外分化来的Naive T细胞免疫耐受的实验研究》文中研究说明目的意义：GVHD是同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)后影响预后的重要并发症。受者预处理造成组织损伤并释放炎性因子(如IFN-γ、IL-2等)引起GVHD。最近的研究发现骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)不仅可以分化为多种间充质组织，而且具有支持造血和免疫调节作用，但其机制尚不清楚。目前的研究认为供者来源的Naive T细胞识别受者主要组织相容性抗原启动了GVHD。我们将体外新生的Naive T细胞接种于异基因MSCs上，观察MSCs对Naive T细胞分泌细胞因子的影响，直接研究它对Naive T细胞的作用，将更深入地揭示其预防GVHD的机制。材料和方法：1、 MSCs体外分离培养：将肝素抗凝的骨髓用密度梯度离心法(过percoll细胞分离液)分离出单个核细胞，体外培养贴壁细胞，传3代后得到纯度和数量均较高的MSCs，经60Co照射后作为实验细胞。2、 脐血CD34+细胞体外分化为Naive T细胞：将胎儿胸腺组织贴壁培养建立胸腺基质细胞培养(TSC)体系；用单克隆抗体-磁珠分离系统分离纯化脐血CD34+细胞；将CD34+细胞植入TSC并添加IL-12、 FL、IL-2，共孵育5周后获取Naive T细胞并通过流式细胞术鉴定其表型。3、 MSCs与Naive T细胞共孵育：将体外培养获取的Naive T细胞种入经照射近融合的MSCs中，对照组为单独MSCs培养和单独NaiveT细胞培养。孵育7天后，取上清用ELISA定量检测IL-2、 IFN-γ、IL-4和IL-10，并应用流式细胞仪检测共孵育前后T淋巴细胞表型变化结果：1、 人骨髓来源的MSCs可以在体外培养扩增，用流式细胞术分析传3代以后的细胞发现它们具有共同的表型CD166+，CD105+， CD45-和CD34-，2、CD34+细胞可在TSC体系中分化出Naive T细胞，随着培养时间的延长，与体内胸腺生成T细胞类似，依次出现CD4／8双阴性，双阳性，单阳性细胞。培养第5周细胞表型测定：CD4+65． 2％，CD8+52． 7％，CD3+78． 8％，CD45RA表达88． 9％。3、 中文摘要MSCS与NaiveT细胞共孵育七天，镜下观察可见共孵育组T细胞数量轻度增加，流式细胞仪检测共孵育前后T淋巴细胞表型显示CDS+细胞相对增加。ELISA检测上清发现共孵育组IFN一Y分泌减少(p<0 .05)，IL一2分泌增加(p<0.05)。另外，在实验组和对照组中均未检测到IL一4、IL一10。 结论:MSCs具有一定的异基因反应性，能刺激NaiveT细胞增生，且MSCs和NaiveT细胞共孵育组上清中的IL一2分泌增加而IFN一Y分泌减少，提示MSCs可能借CDS+调节T细胞增生抑制异基因反应性T细胞分泌IFN一Y来发挥免疫调节作用，本文结果将为进一步阐明MSCs免疫调节机制提供新的线索。
贺伟峰, 吴军, 易绍萱, 罗高兴, 陈希炜[2]2004年在《转hCTLA4Ig树突状细胞诱导T细胞免疫耐受的实验研究》文中研究指明目的通过逆转录病毒载体将入 CTLA4Ig 转染 DCs,探讨转染人 CTLA4Ig 树突状细胞(DCsRev)诱导 T 细胞免疫耐受的可能性。方法通过重组逆转录病毒将目的基因人 CTLA4Ig 转染到大鼠骨髓来源的 DCs 中,通过流式细胞仪检测目的基因人 CTLA4Ig 表达及 DCs 表面分子的改变;通过混合淋巴细胞反应 (MLR)检测 DCsRev 抑制 T 细胞免疫反应的能力。结果重组逆转录病毒转染 DCs 的最大效率为91．25%;在功能上,DCsRev 不但丧失了刺激 MLR 的能力,并且能够强烈抑制 MLR 中反应 T 细胞的增殖,而且抑制率与加入 DCsRev 的数量和 DCsRev 预处理反应 T 细胞的时间长短有关。具体来说,DCsRev 数量在1×10~3～ 1×10~4之间时,抑制率与剂量呈正相关,最高为71．96%。而当 DCsRev 数量达到5×10~4时,抑制率下降为 59．2%。在12~48 h 之间,随着预处理时间的延长,抑制率却不断下降,预处理12 h 抑制率最高,为99．6%。但不做预处理,在反应开始时同时加入 DCsRev,则抑制率明显降低,仅为59．2%。对腹腔注射 DCsRev 大鼠脾 T 淋巴细胞体外分析表明,DCsRev 也能在动物体内诱导耐受,但这种免疫耐受状态不能长久维持。结论通过逆转录病毒载体将人 CTLA4Ig 转染 DCs 后,不但 DCs 表面 CD86分子被 CTLA4Ig 有效地封闭,并且能够诱导抗原特异性 T 细胞的免疫耐受。
华菲[3]2016年在《干细胞调控CD45RB~+调节性树突状细胞在同种异体心脏移植中的作用》文中研究表明第一部分大鼠BMSCs对DCs表型的影响及CD45RB~+DCs免疫功能的检测目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cell,BMSCs)对同种异体骨髓来源的树突状细胞(Dendritic cells,DCs)表型的影响,以及受影响显着的CD45RB~+DC亚细胞群的免疫状态。方法:Wistar大鼠的BMSCs和同种异体骨髓来源的树突状细胞(DCs)在体外按等比例进行5d的共培养。根据是否加入BMSCs共同培养,我们将实验分为对照组和实验组两个组别:A组:内毒素脂多糖(LPS)与DCs共培养组,B组:在A组基础上加入BMSCs与DCs共培养组(细胞数量1:1)。对两组DC细胞表面的主要免疫标志物分子的变化情况应用流式细胞仪进行测定和分析,同时观察DCs在光镜下形态学上的改变。利用流式细胞技术分离出大鼠BMSCs诱导的CD45RB~+DC细胞群,实验组共分叁组:A组:未成熟DC组,B组:CD45RB~+DC组,C组:成熟DC组。检测各组细胞表面主要共刺激分子(CD80、CD86、MHC-II)的表达,各组DC摄取抗原的能力(对bead-OVA复合物的摄取)、qPCR方法测各组DC细胞中FOXP3 mRNA的表达,Western Bloting检测各组Foxp3蛋白的表达。结果:和对照组相比,CD45RB、lLT4的表达在BMSCs共培组中DCs表面表达发生上升,而CD86、MHC-II的表达出现下降;同时,CD45RB~+组低表达共刺激分子CD80、CD86和MHC-II,呈现出未成熟DC的表征;与此同时CD45RB~+组与未成熟DC组的摄取能力也要强于成熟DC组(P<0.05),CD45RB~+DC组与imDC组FOXP3 mRNA及Foxp3蛋白的表达均明显多于mDC组(P<0.05)。结论:BMSCs体外诱导下可以使DCs表面CD45RB与ILT4的表达上调,并导致cd86与mhc2的表达下调,尤其以cd45rb的改变最为明显。经bmscs诱导的cd45rb+dcs摄取抗原的能力明显增强,其foxp3mrna及foxp3蛋白的表达出现上调,呈现出imdc的免疫行为特征。第二部分cd45rb+dcs对t细胞功能影响的体外实验研究目的:通过体外dcs细胞和t淋巴细胞的共培养,分别检测不同dcs细胞对t淋巴细胞增殖能力的影响和其对t淋巴细胞亚群的影响。方法:用wistar大鼠的dcs和sd大鼠的cd4+t细胞进行共培养,包括以下几组。a组:con组为阴性对照组,即sd大鼠的cd4+t细胞,b组:cona为阳性控制组,即sd大鼠分选后的cd4+t细胞给予cona刺激(浓度10ng/ml),c组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠未成熟dcs进行细胞共培养(dc:t=1:10),d组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠cd45rb+dcs进行细胞共培养(dc:t=1:10),e组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠成熟dcs进行细胞共培养(dc:t=1:10)。共培养72h后,取各组cd4+t细胞进行功能检测,包括以cck-8法测定t淋巴细胞的扩增情况;初始th细胞向th1、th2、th17、treg的分化:提取rna之后采用qpcr分别测定相应的特异转录因子t-bet、gata-3、rorγt、foxp3的表达。流式细胞仪检测各组cd4+foxp3+t细胞数量。流式cba法检测培养上清中的il-2、ll-4、il-10、ll-17a、lfn-γ、tnf-α和ll-6等细胞因子表达水平。结果:细胞共培养后,cd45rb+dcs组t细胞增殖能力明显下降,组间有显着差异;同时cd45rb+dcs组cd4+foxp3+t细胞的数量增加,与对照组间有统计学差异(p<0.05);cd45rb+dcs组和imdcs组特异性转录因子foxp3和t-bet表达上升,gata-3和r0rγ表达下降,ll-2和lfn-γ水平降低,ll-4、ll-10以及tgf-β1水平升高,与对照组间存在明显差别(p<0.05)。结论:大鼠cd45rb+dcs在体外明显抑制反应性t淋巴细胞的增殖,促进初始th0细胞向th2的方向分化倾斜,并能提升调节性t细胞的比例,进而增强t细胞的免疫抑制能力。第叁部分cd45rb+dcs静脉输注诱导同种移植免疫耐受的实验研究目的:研究大鼠cd45rb+dcs移植预处理方法诱导大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的作用。方法:首先建立wistar大鼠幼鼠至sd大鼠同种异体颈部心脏移植模型。在移植的5天前,对受体大鼠进行相应的细胞静脉注射。分组:a组(对照组):只行颈部同种异位心脏移植;b组(imdcs注射组):受体大鼠经静脉注射供体大鼠未成熟dc细胞1×106/0.2ml;c组(cd45rb+dcs注射组):受体大鼠经静脉注射供体大鼠cd45rb+dc细胞1×106/0.2ml;d组(mdcs注射组):受体大鼠经静脉注射供体大鼠成熟dc细胞1×106/0.2ml。用触诊法监测移植心脏的存活时间。分别在移植后的第1、3、5d将移植物中的淋巴细胞进行分离并提取rna,对microrna-182、microrna-183、microrna-7a、microrna-155、microrna-434、ll-2、lfn-γ、ll-4、ll-10的表达水平用定量rt-pcr进行测定。另外分别取受体血清,流式细胞技术测定cd4+foxp3+t淋巴细胞的比值。结果:同种异体心脏移植之后,cd45rb+dcs组和未成熟dcs组移植物存活时间延长明显,与对照组相比差异显着(p<0.05),随着时间的推移,cd4+foxp3+t淋巴细胞比率呈现逐渐升高趋势,在术后第5d改变明显(p<0.05)。随着心脏移植后时间的推移,microrna-7a、microrna-182以及microrna-183水平逐渐升高,mir-434表达水平则逐渐降低,在移植后的不同时间点上均有统计学差异,但同一天各组间未见明显差别。第3、5dcd45rb+dcs组和imdcs组microrna-155表达增加,和对照组之间有统计学差异(p<0.05)。心脏移植后得第5d,ll-4水平在cd45rb+dcs组和未成熟dcs组中的表达均上升,ll-2和lfn-γ水平则呈现下降趋势,与对照组相比统计学差异显着(p<0.01);同时il-10水平在cd45rb+dcs组升高明显,与对照相比有明显差异(p<0.01)。结论:cd45rb+dcs通过上调体内cd4+foxp3+调节性t细胞的数量,下调移植受体大鼠microrna-155的表达,增加移植物内淋巴细胞ll-10和ll-4水平,并降低lfn-γ和ll-2水平,从而显着延长移植心脏的存活时间。
买合皮热提汗·艾尔肯[4]2012年在《泡状棘球蚴感染诱导免疫耐受的实验研究》文中研究表明目的：建立Lewis大鼠泡状棘球蚴感染模型后,进行BN大鼠对泡状棘球蚴感染Lewis(简称LEW)大鼠异位心脏移植,观察Lewis大鼠感染泡球蚴后,免疫系统发生的变化对移植心脏的影响,初步探讨其相关的发生机制。初步观察免疫抑制剂FK506、骁悉以及抗包虫药L-ABZ对感染泡球蚴大鼠移植心脏的疗效。方法：1)采用大鼠右下腹腔直接注射接种泡状棘球蚴悬浮液的方式,建立泡状棘球蚴感染的动物模型；2)建立大鼠颈部异位心脏移植模型,LEW大鼠为受体,Brown Norway(简称BN)大鼠为供体。将供心主动脉与肺动脉分别与受体右颈总动脉和右颈外静脉吻合；3)分别行BN大鼠对未感染泡球蚴LEW大鼠(即对照组,n=12)及BN大鼠对泡球蚴感染LEW大鼠(即实验组,n=12)异位心脏移植,术后观察异位移植心脏的存活时间,移植心脏发生排斥后进行组织病理学和免疫组化法检测,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清内白细胞介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-y)水平,免疫组化法检测排斥心肌组织内T细胞及嗜酸性粒细胞的浸润,细胞流式检测法(FACS)分别检测对照组和实验组大鼠脾内CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg细胞)数量水平情况；4)建立BN大鼠对泡球蚴感染LEW大鼠异位心脏移植模型。实验动物分组：将感染泡球蚴的LEW大鼠随机分为下列实验组：Group1BN→LEW (n=9):未治疗；Group2BN→LEW (n=9):L-ABZ50mg/kg/d灌胃,每日一次；Group3BN→LEW (n=9):FK5061mg/kg/d灌胃,每日一次；Group4(n=9):FK5061mg/kg/d、L-ABZ50mg/kg/d灌胃,每日一次；Group5BN→LEW (n=9):FK5061mg/kg/d、MMF20mg/kg/d;灌胃,每日一次；Group6BN→LEW (n=9):FK506lmg/kg/d、MMF20mg/kg/d、L-ABZ50mg/kg/d灌胃,每日一次。判断心脏排斥后,观察移植物存活时间及移植心组织内浸润嗜酸性粒细胞数量的变化。结果：1)接种泡状棘球蚴LEW大鼠,用开腹肉眼、常规病理切片及间接ELISA法检测感染率。泡球蚴感染大鼠叁个月后感染率约为85.0%；2)正式实验中同种异体组行大鼠颈部异位心脏移植50例,术后100%复跳,3天存活率为96.0%,供心缺血时间均少于35分钟。同种异体移植心存活时间平均8天左右7.89±1.65d,病理检查可见典型排斥反应征象；同系移植组10例,移植心均存活至处死取材(6例>11天,4例>3个月后处死不再观察生存期)。同系移植组移植心脏病理切片未见明显心肌损害；3)实验组(即感染泡球蚴组)移植心存活时间为16.17±3.19天,对照组(即未感染泡球蚴组)移植心存活时间7.92±1.93天,实验组移植心存活时间较对照组移植心存活时间明显延长,两者有显着性的统计学差异(P≤0.05)。实验组移植心的组织病理学分级(平均分级为3.38级)与对照组(平均分级为3.79级)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。移植心脏发生排斥反应后,实验组血清内IL-4水平为152.21±45.62ng/L高于对照组50.85±22.15ngm,而实验组血清内IFN-γ水平为12.35±1.02ng/L水平低于对照组42.63±4.15ng/L,两组差异均有统计学意义(P≤0.05); FACS流式检测结果提示实验组大鼠脾内CD4+CD25+调节性T细胞数量为10.8%,高于对照组的6.1%,两组差异有显着的统计学意义(P<0.001)；4)除FK506+MMF组移植心存活时间较感染对照组有所延长外(16.11±8.04vs11.60±6.02,P≤0.05),其余各组的移植心存活时间未见延长(P>0.05)。单纯的L-ABZ不会影响移植物的存活且L-ABZ与FK506+MMF可能有一定的拮抗作用。结论：1)通过向实验大鼠右下腹腔注射泡球蚴悬浮液的方式建立大鼠泡球蚴感染模型是成功的,适用于大批量动物实验研究；2)应用Cuff技术建立大鼠异位心脏移植模型,明显降低了手术难度,具有手术创伤小、供心缺血时间短等优点,简单实用,制模成功率高；3)泡状棘球蚴感染造成Th1/Th2向Th2类细胞因子偏移,并且可能通过介导CD4+CD25+调节性T细胞数量增加而导致大鼠异位移植心脏存活时间延长,其可能是诱导移植免疫耐受的原因之一；4)单纯的L-ABZ不会影响移植物的存活；L-ABZ与FK506+MMF可能存在一定的拮抗作用。
刘剑[5]2011年在《受体来源大鼠ADSCs分化的类肝细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中指出第一部分大鼠原位肝移植模型的建立目的：建立稳定的大鼠肝移植反应模型的方法,为肝移植的相关研究提供稳定可靠的模型基础。同时对比DA→Lewis与SD→SD大鼠组合,了解高排斥反应组合模型DA-Lewis术后的生存率和生存时间。为进一步的实验摸索条件。方法：通过Kamad“二袖套法”,建立大鼠肝移植模型。并观察大鼠术后存活率和并发症的发生情况。第一阶段：进行200次双人肝移植训练,主要是熟悉手术过程,总结经验,同时对二袖套管法进行改进；第二阶段：进行了DA→Lewis与SD→SD大鼠组合肝移植对比,对比一般状态、生存期、肝功能、病理表现。结果：总共实施大鼠原位肝移植248例,在训练阶段主要要克服麻醉问题,血管吻合问题,如何缩短无肝期以及无肝期结束后的管理问题；在成熟期时手术,供体手术时间(35.78±5.78)min,热缺血时间(0.5±0.22)min,供肝修整时间(15.13±3.45)min,受体手术时间(57±16.5)min,受体手术开始至无肝期开始(37±7.11)min,无肝期为(21.33±3.65)min,无肝期结束至关腹(13.98±3.83)min,手术成功率为93.5%,成功地建立了稳定的大鼠肝移植模型。在正式实验中DA-Lewis表现出高排斥反应的表现,存活时间短,平均时间为8.900±0.390天,术后肝功能急剧上升,病理表现出明显的重度排斥反应。结论：大鼠原位肝移植模型的建立,需要在一定的显微外科基础和熟悉大鼠的腹部解剖结构的前提下,经过4-6月的不间断训练,方能获得成功。正确的供肝灌注、严密的腹腔止血、熟练的显微血管缝合技术、尽量缩短的无肝期、完善的术中补液纠酸及术后复温是保证手术成功的关键。DA-Lewis组合可以成功地复制出大鼠高排斥肝移植模型。第二部分大鼠脂肪源性干细胞诱导形成的类肝细胞的免疫调节作用的体外实验研究目的：在脂肪源性干细胞传统的分离方法的基础上进行改进,克隆筛选纯化脂肪源性干细胞；建立大鼠脂肪源性干细胞转化为类肝细胞的程序化诱导体系。并在诱导过程中观察细胞分化的变化及对类肝细胞功能进行鉴定；并进一步研究该类肝细胞的免疫特性并探讨可能的机理。方法：1.消化离心法分离Lewis大鼠脂肪源性干细胞,有限密度稀释法克隆化及条件培养基筛选,进行原代培养,以克隆筛选的脂肪源性干细胞为实验组,未克隆筛选的脂肪源性干细胞为对照组,观察细胞形态,对比生长曲线、倍增时间,流式细胞仪鉴定脂肪源性干细胞表面标记CD49d、 CD34. CD44。2.将分离纯化的Lewis大鼠脂肪源性干细胞,分叁个阶段加入含有FGF-4、 FGF-a. HGF及OSM细胞因子的诱导培养体系中,使脂肪源性干细胞向肝细胞转化。用RT-PCR检测ALB、 AFP及CK18mRNA的动态变化,进一步采用免疫荧光组织化学法及对氨的代谢及尿素合成能力鉴定该细胞向肝细胞转化的性能。3.检测诱导前后的Lewis大鼠脂肪源性干细胞对DA/lewis大鼠脾T淋巴细胞混合培养体系的免疫调节作用,并检测上清液中的IL-2、IL-10的浓度。结果：1.经克隆筛选的脂肪源性干细胞与未经克隆筛选的脂肪源性干细胞相比,前者形态均一,生长力旺盛,倍增时间短,多代培养后生长曲线无明显改变,通过流式细胞仪鉴定,实验组与对照组在3-6代之间均表达表面标记CD49d、CD44, CD34亻(?)表达。2.纯化后的脂肪源性干细胞大鼠脂肪源性干细胞通过向肝细胞的分段诱导方案,在0、14、21、28d分别检测ALB、AFP及CK18mRNA的表达,表达随诱导的延长而增强,通过荧光免疫分析,类肝细胞具有合成白蛋白的功能。对氨的代谢和尿素的合成功能在9-12d出现并持续存在。3.通过混合淋巴细胞培养以DA大鼠脾T淋巴细胞为刺激细胞,Lewis大鼠脾淋巴细胞为反应细胞的体系中淋巴细胞的增殖反应受到Lewis大鼠脂肪源性干细胞的抑制,抑制的强度与干细胞的浓度正相关,与是否诱导无关。结论：结果证实克隆筛选的纯化方法是脂肪源性干细胞原代培养的有效、经济的纯化方法。脂肪源性干细胞在体外通过阶段诱导可成功转化为类肝细胞,该诱导分化方法可为肝细胞移植、肝组织工程等临床治疗提供一个有效可靠的种子细胞来源。经过纯化的脂肪源性干细胞在体外可以成功转化为类肝细胞,该细胞同时具有干细胞下调免疫反应及肝细胞的特征的双重特性。第叁部分脂肪源性干细胞诱导形成的类肝细胞对大鼠肝移植免疫排斥的影响目的：在大鼠原位肝移植高排斥模型(DA→Lewis)术中经门静脉注入由脂肪源性干细胞诱导形成的类肝细胞之后,研究由脂肪源性干细胞诱导形成的类肝细胞在移植肝的定位,及其对受体肝功能、免疫排斥、生存期的影响,初步探讨脂肪源性干细胞及其分化而来的类肝细胞运用于器官移植的安全性、效能以及机制。方法：1.随机DA与Lewis大鼠分为4组,每组各31对,采用改良Kamada两袖套法建立DA-Lewis大鼠肝移植模型：a.A组(排斥组)行原位肝移植术；b.B组(免疫抑制组)行原位肝移植术+口服他克莫司胶囊FK506(0.15mg/kg/d,灌胃1次/d×14d,术后2d开始)；c. C组行原位肝移植术+术中门静脉输注ADSCs:d.D组行原位肝移植+术中门静脉输注诱导后的类肝细胞；2.观察并记录每组实验大鼠的一般情况(大鼠皮毛、眼睛色泽、活动和精神状态)；每组各留6只观察生存期；3..每组术后第3、7、10、14天随机活杀6只大鼠,进行抽血,测定肝功能并用ELISA法测定外周血的细胞因子(IL-2、INF-Y、IL-10及IL-4)水平；4.用BrdU体外标记脂肪源性干细胞及类肝细胞,并用免疫荧光染色单标及双标记的方法了解BrdU标记的成功与否,在4个时相点将一部分肝组织制作成冰冻切片,行BrdU免疫荧光检测,了解类肝细胞在肝脏中的定位情况；5.取每只大鼠肝脏组织做成石蜡切片,HE染色光镜下观察,并计算排斥指数了解移植肝的排斥程度；6.于实验第30d将实验各组中尚存活的大鼠中,挑选出状态最好的大鼠进行取材,行混合淋巴培养,了解术后T淋巴细胞增殖能力。用流式细胞仪测定各组CD4+、CD8+变化,计算CD4+/CD8+。结果：1.4组均在相同的条件下采用相同的手术方式(改良两袖套法)建立动物模型,在术前体重及手术时间的比较4组间无明显差异(P>0.05),即具有可比性。存活率为94.66%(124/131)。2.从术后3天以细胞核BrdU染色阳性的脂肪源性干细胞及其形成的类肝细胞开始出现,散在分布于肝组织,同时有部份阳性细胞密集于汇管区及血管旁,随着时间的延长,逐渐形成灶状分布。3.B、C、D组中位生存时间明显高于A组(对照组),均存在统计学差异(P<0.05),D组中位生存时间最长,与C组相比有统计学意义,与B组相比无统计学差异。4.移植术后各组大鼠血清生化检查：在移植术后3、7、10d, B、C、D组肝功能逐渐好转,A组ALT、AST、TBIL急剧上升,与存活时间表现一致。在术后第14天,A组动物已完全死亡,数据缺失；B、C、D组肝功能进一步恢复,B、D组恢复较快,C组较慢,在部分指标(ALT、AST) D组优于B组(P<0.05)。5.A组IL-2、INF-Y明显高于其它各组(P<0.05), B、C、D组水平逐渐下降,B、D组与C组比较,下降更明显(P<0.05),B、D组之间无明显差异(P>0.05)；A组IL-10及IL-4明显低于其它各组(P<0.05), B、C、D组水平逐渐升高,B、D组与C组比较,升高更明显(P<0.05)。6.肝脏病理示术后7d、10d,A组的急性排斥评分明显高于B、C、D组(p<0.05),B、D组随着时间延长,呈下降趋势,但两者之间无明显差异(P>0.05),C组排斥指数高于B、D组(P<0.05)。7.混合淋巴细胞培养：以DA大鼠脾细胞为刺激细胞,移植受体的脾细胞为反应细胞的混合淋巴培养体系中,B、C及D组OD值较阳性对照组降低(p<0.05),以SD大鼠脾细胞为刺激细胞移植受体的脾细胞为反应细胞的的混合淋巴培养体系中,B组的OD值低于阳性对照组,而C、D组与SD阳性对照组之间的比较没有明显差异,C、D实验组对DA及SD两种不同的刺激细胞反映出的OD值之间的比较有统计学差异(P<0.01),说明脂肪源性干细胞处理组及类肝细胞对DA刺激细胞刺激后建立起来的免疫下调状态是特异性的。8.A组CD4+/CD8+的比值进行性上升,显着高于B组、C和D组(P<0.05),第10天达到高峰(4.683±0.775)。术后3-10天B组、C和D组比值缓慢上升,到14天开始回落,但各时间点各组差异不大,无显着性差异。结论1.成功建立大鼠肝移植高排斥模型。2.单纯脂肪源性干细胞治疗组的移植肝内有肝纤维化出现以及脂肪变性,MSCs可能参与此过程的发生,可能影响其在体内的分化,不足以完全抑制移植术后的免疫排斥反应。3.由脂肪源性干细胞分化形成的类肝细胞治疗组受鼠对供肝产生耐受,且为供者特异性免疫耐受。4.由脂肪源性干细胞分化形成的类肝细胞治疗组对耐受的产生发挥一定的作用,并促进了肝细胞再生从而避免使用免疫抑制剂。
杨济泽[6]2016年在《p65低表达慢病毒诱导大鼠角膜移植免疫耐受的作用及机制》文中研究表明研究背景目前全球范围内致盲性眼病的主要病因之一依然是角膜盲,角膜移植是角膜病致盲患者治疗不可逆角膜盲最主要、最有效的复明手段。近年来组织器官移植在临床上取得了巨大的进步,普遍应用于各个器官功能衰竭的治疗。由于眼表组织特有的解剖学、免疫学以及机械屏障的特性,相对其他组织器官缺乏血管以及淋巴管,在没有高危因素的角膜移植病例中,术后两年移植物存活良好的概率高达90%。但是角膜并不是绝对意义上的免疫赦免组织,角膜移植术后难以避免的免疫排斥反应仍然是阻碍手术成功的主要原因之一。在高危角膜移植的病例中术后免疫排斥反应尤为严重,在全身应用或局部应用免疫抑制药物的情况下,由于移植手术受体植床大量新生血管生成和长期的炎症反应,术后免疫排斥造成手术成功率下降明显。所以防治角膜移植术后的免疫排斥反应,提升角膜移植物的术后存活率以及改善预后的研究依然是近年来的热点问题。近年来,临床防治角膜移植术后免疫排斥反应的最主要手段包括皮质类固醇激素和环孢霉素A等药物的局部或全身应用,虽然上述方法在临床研究中取得了一些较为满意的结果。但是这些免疫抑制药物的作用与其临床的用药剂量和用药时间呈明显的正相关,还因为其非特异性抑制患者免疫系统应答的特点,临床应用过程中将严重破坏患者的免疫系统机制,并因为其产生的多种术后并发症反而加剧了免疫排斥反应的发生,导致角膜移植手术的最终失败。树突细胞是机体细胞中能高效摄取、加工处理并递呈抗原的一类细胞,它还可以在诱导未致敏初始T细胞增殖的同时激活T细胞免疫应答促进依赖性抗体产生。树突细胞具有显着的分化异质性,在分化成熟过程中经历的各种前体细胞、未成熟细胞和成熟细胞不仅在细胞表型上差异明显,其在机体免疫应答过程中的作用也各不相同。当前体细胞分化为未成熟树突细胞时,分布于机体外周组织器官间质中,这时的树突细胞具有较强的抗原吞噬能力并处理外源性抗原,并结合到内源性组织相容性复合体分子上。未成熟树突细胞在机体内部环境稳定时处于静息状态,此时的迁移属于非抗原依赖性,而当机体受到外源性刺激时未成熟树突细胞按照抗原依赖性的方式迁移,并且在迁移过程中受部分刺激因素影响而逐渐向成熟树突细胞分化,在这个过程中活化并参与启动机体的免疫应答机制。研究中把既能呈现未成熟树突细胞表型又能够诱导T细胞免疫耐受的树突细胞称为致耐受树突细胞。通过体外诱导骨髓源性树突细胞分化为致耐受树突细胞介导机体免疫耐受,从而治疗角膜移植术后免疫排斥是一种切实可行的实验研究方案。然而获得稳定的致耐受树突细胞是促进免疫耐受并延长移植物存活的关键。目前实验研究中诱导分化获得未成熟树突细胞的方法主要是通过粒细胞巨噬细胞集落刺激因子共培养或雷帕霉素、环孢霉素、糖皮质激素等药物在体内体外抑制树突细胞分化。上述方法在实验研究中取得了一些较为满意的结果,但获得的树突细胞是否具有长期维持未成熟树突细胞的表型和实现致耐受树突细胞功能的特点还有待商榷。NF-κB是机体细胞在凋亡、增殖、分化以及免疫应答过程中的关键调控转录因子。有超过150种的基因通过NF-κB介导参与多种因子的调控表达,其中包括Toll样受体、趋化因子受体、急性期反应蛋白、生长因子、抗凋亡蛋白、细胞因子受体以及细胞粘附分子等。NF-κB对树突细胞的分化成熟具有重要作用。未成熟树突细胞在机体内受到抗原刺激后引起抗原依赖性迁移并且在迁移过程中逐渐向成熟树突细胞分化。而NF-κB可以参与启动MHC、CD80和CD86的基因转录。树突细胞在成熟过程中的MHC、CD80、CD86和细胞间粘附分子和共刺显着高表达,同时刺激未致敏的初始T细胞进行免疫应答。T细胞的刺激活化需要双重或者多重信号的诱导,这些信号就包括上面提到的CD80、CD86、MHC等信号以及相应的抗原多肽。NF-κB蛋白是由Rel和NF-κB两个家族成员共同构成的,一个是前体家族包括NF-κB1和NF-κB2;另一个是Rel家族包括c-Rel、v-Rel、Rel-B和Rel-A (p65)。Rel/NF-κB家族的Rel同源结构域包括末端结构域、DNA结合结构域、二聚体结构域和核定位序列结构域。除了成员间具有相同的同源结构域外,Rel-A, Rel-B和c-Rel分子还具有转录激活结构域,在功能上两个结构域也有所区别,转录激活结构域主要负责NF-κB二聚体的激活与转录。核定位序列结构域可以介导Rel-A进入细胞核内并通过Rel-A、Rel-B和c-Rel所特有的转录激活结构域介导Rel-A的基因转录。Rel-A的磷酸化和乙酰化是影响NF-κB活化并启动转录调控的关键,目前对NF-κB活性调控的研究重点主要集中在对Rel-A的蛋白修饰。当丝氨酸276受到激酶刺激后,改变了非磷酸化状态下Rel-A的分子结构,增强Rel-A与环腺苷酸应答元件结合蛋白的结合,从而提高NF-κB的转录活性。因此我们推测通过干扰Rel-A基因表达,影响Rel-A的磷酸化程度,进而减弱NF-κB的转录活性来获得致耐受树突细胞。RNA干扰技术是通过细胞导入外源性和内源性dsRNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA序列特异性降解,从而引起转录后基因沉默的现象。由于RNA诱导沉默复合物可以二次利用并经过RNA聚合酶的催化,因此在整个过程中可以催化以并放大RNA的效果。siRNA导入技术的发展为RNA干扰技术的应用提供了更多的选择,各种病毒介导的siRNA表达是最为有效的一类载体。慢病毒载体是以人类免疫缺陷I型病毒为基础发展起来的基因治疗载体,虽然属于逆转录病毒载体的范畴。它有着更广泛的宿主对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,有效对抗转录沉默作用从而达到持久性表达,载体中可以插入特异性的启动子和增强子,提高转入基因的转录靶向性,使慢病毒载体中的目的基因在特定的组织细胞中表达。本课题在前期研究和最新进展的基础上,构建大鼠角膜移植免疫排斥模型,通过粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和IL-4共培养诱导分化大鼠骨髓源性树突细胞,采用RNA干扰技术,筛选出高效抑制Rel-A表达的siRNA序列,构建针对Rel-A的siRNA慢病毒载体细胞,将慢病毒载体转染至骨髓源性树突细胞,降低NF-κB表达及活性,以求获得稳定致耐受树突细胞的新方法,同时将该致耐受树突细胞注入大鼠角膜移植模型,探寻Rel-A低表达的致耐受树突细胞诱导大鼠角膜移植免疫耐受的作用及机制,为临床角膜移植诱导免疫耐受治疗免疫排斥反应提供理论和实验依据。第一部分大鼠骨髓源性树突细胞的体外诱导分化及生物学性能检测研究目的结合最新研究进展,进一步探讨体外诱导分化具有未成熟树突细胞表型和致耐受特性的树突细胞的方法。研究方法本部分实验根据不同培养周期诱导大鼠骨髓源性前体细胞分化为未成熟树突细胞。通过显微镜观察不同培养时间中树突细胞的生长及形态特征；通过流式细胞仪检测诱导分化后树突细胞的表面标志物CD80、CD86和MHC-Ⅱ的阳性表达率；通过混合淋巴细胞反应实验验证不同培养时间诱导分化的未成熟树突细胞是否具有致耐受树突细胞的生物学特性；并使用酶联免疫吸附实验鉴定树突细胞培养上清中的IFN-γ表达水平。结果培养至第六天和第八天的树突细胞在CD80、CD86和MHC-Ⅱ的阳性表达率方面明显低于(p<0.05)培养至第十天的树突细胞；培养至第六天和第八天的树突细胞在混合细胞反应中的吸光值明显低于(p<0.05)培养至第十天的树突细胞；树突细胞培养上清中的IFN-γ表达水平在三组间逐渐升高。结论持续培养至第六天时收获的树突细胞具有未成熟树突细胞的表型并且具有致耐受树突细胞的生物学特性。体外诱导大鼠骨髓性树突细胞分化为致耐受树突细胞过程中对培养时间和诱导分化培养液的精确调整极为敏感,树突细胞表面标志物的特异性表达不能作为鉴定致耐受树突细胞的唯一标准。第二部分构建p65低表达慢病毒载体和慢病毒转染对树突细胞生物学性能及细胞因子影响研究目的设计针对p65低表达的siRNA序列,建立慢病毒载体系统并验证其对靶基因的沉默效果,将慢病毒转染至诱导分化后的致耐受树突细胞,进一步探讨针对p65低表达的慢病毒对于树突细胞生物学性能的影响。研究方法根据siRNA设计原则与方法,设计叁条针对大鼠p65基因的特异性干扰序列和一条阴性对照序列；体外转染293T细胞后,通过反转录聚合酶链式反应实验和蛋白质免疫印迹实验检测细胞中p65的蛋白表达和mRNA表达水平；通过流式细胞仪检测在慢病毒转染或/和脂多糖刺激后对树突细胞表型的影响；通过混合淋巴细胞反应实验验证在慢病毒转染或/和脂多糖刺激后对树突细胞致耐受生物学特性的影响；通过反转录聚合酶链式反应实验和酶联免疫吸附实验检测在慢病毒转染或/和脂多糖刺激后树突细胞培养上清中IL-10、IL-17和IFN-γ的蛋白表达与mRNA表达水平；通过染色质免疫共沉淀实验和荧光素酶报告基因实验验证p65对IL-10、IL-17和IFN-γ的直接影响作用。结果设计合成针对p65低表达的siRNA序列可以有效抑制细胞中p65和NF-κB的蛋白表达水平并显着降低p65的mRNA表达水平(p<0.05)；蛋白质免疫印记实验结果中对照组的p65和NF-κB条带明显强于慢病毒组；混合淋巴细胞反应实验中脂多糖刺激组(LPS)相比其他叁组对大鼠同种异体T细胞的增殖具有明显刺激作用(p<0.05)；流式细胞术的分析结果中脂多糖刺激组(LPS)在CD80、CD86和CD11c+MHC-Ⅱ的检测中均明显高于(p<0.05)对照组(Control)、慢病毒组(Lv)和慢病毒转染后脂多糖刺激组(Lv+LPS);细胞上清的p65、IL-17和IFN-γ蛋白表达和mRNA检测结果中脂多糖刺激组(LPS)明显高于(p<0.005)其他叁组；细胞上清的IL-10蛋白表达蛋白表达和mRNA检测结果中对照组(Control)明显高于(p<0.005)脂多糖刺激组(LPS)、慢病毒组(Lv)和慢病毒转染后脂多糖刺激组(Lv+LPS),脂多糖刺激组(LPS)明显高于(p<0.005)慢病毒组(Lv)和慢病毒转染后脂多糖刺激组(Lv+LPS);荧光素酶报告基因实验结果中IFN-γ、IL-17和IL-10的慢病毒组RLU指数都明显低于对照组；染色质免疫共沉淀实验结果中慢病毒组的IFN-γ、IL-17和IL-10条带相对input组和慢病毒空白对照组都明显减弱。结论建立的针对p65低表达的慢病毒载体可以有效减少p65和NF-κB的蛋白表达水平并显着降低p65的mRNA表达水平。无论是否进行脂多糖刺激,慢病毒转染后的骨髓源性树突细胞都可以保持未成熟树突细胞的表型和致耐受树突细胞的生物学特征。慢病毒转染后的骨髓源性树突细胞可以减少IL-17和IFN-γ的蛋白表达和mRNA表达水平。p65可以直接结合到IL-10、IL-17和IFN-y的启动子区域上,并启动IL-10、IL-17和IFN-γ的转录翻译表达,且引物序列具有特异性。第叁部分p65低表达的致耐受树突细胞在角膜移植术后免疫排斥过程中的效果及机制研究目的探讨针对p65低表达的慢病毒转染骨髓源性树突细胞对于同种异体大鼠正位穿透性角膜移植术后免疫排斥反应的影响和作用机制。研究方法建立同种异体大鼠正位穿透性角膜移植模型,受体与供体大鼠分别随机分为四个实验组,分别于术前、术后注射骨髓源性树突细胞、慢病毒转染后树突细胞,术后观察移植植片的存活时间、角膜新生血管和角膜不透明度并建立评估体系；通过免疫组化染色分析角膜植片的病理变化和相关细胞因子的表达情况；通过流式细胞仪分析大鼠角膜移植术后脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞和CD4+FoxP3+调节性T细胞的表达率；通过反转录聚合酶链式反应实验和酶联免疫吸附实验检测大鼠血清中IL-10、IL-17和IFN-y的蛋白表达与mRNA表达水平。结果对照组中大鼠移植植片的平均存活时间为20±6.55天明显长于BMDC组的平均存活时间(13.47±2.56天),Lv-p65-DC组和Lv-p65-DC-cont组的大鼠移植植片的平均存活时间都超过30天；BMDC组的不透明度从术后的第12天开始明显高于其他叁组(p<0.05),在术后第叁周,Lv-p65-DC组分别低于或高于对照组和Lv-p65-DC-cont组；术后第10天,Lv-p65-DC-cont组的新生血管评分显着低于其余叁组；免疫组化实验结果表明IL-17的表达具有特异性,并明显富集于角膜新生血管壁周围；BMDC组和对照组的调节性T细胞表达率明显高于其他两组；术后第叁周,Lv-p65-DC组的p65 mRNA和蛋白表达水平明显高于Lv-p65-DC-cont组；在术后第一周,对照组的IL-10 mRNA和蛋白表达水平明显高于其他叁组,术后第叁周开始,对照组和Lv-p65-DC组的IL-10mRNA和蛋白表达水平明显高于Lv-p65-DC-cont组；IL-17和IFN-y的mRNA和蛋白表达特征较为近似,术后第一周,Lv-p65-DC组和Lv-p65-DC-cont组的mRNA和蛋白表达水平均明显低于BMDC组和对照组；术后第叁周开始,对照组和Lv-p65-DC组的mRNA和蛋白表达水平都明显高于Lv-p65-DC-cont组。结论未经慢病毒转染的骨髓源性树突细胞在进入受体大鼠体内后受到炎症信号影响逐渐向成熟树突细胞分化,增强了术后的免疫排斥反应。大鼠角膜移植术前注射慢病毒转染的树突细胞可以诱导调节性T细胞活化,延长植片的存活时间并减轻移植术后角膜新生血管的生成和降低植片的不透明度。针对p65低表达的慢病毒可以降低术后IL-10、IL-17和IFN-γ的表达水平,同时慢病毒转染后树突细胞注射诱导大鼠角膜移植免疫耐受的治疗方式具有时间依赖性。
许经伟[7]2014年在《小鼠树突状细胞分泌的Exosome对同种异体T细胞增殖影响的实验研究》文中提出目的：通过不同手段处理小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)，分别提取其分泌的Exosome，研究Exosome表型变化以及其对小鼠同种异体脾脏来源的T淋巴细胞增殖的影响，来寻找优化DC培养方案，探索DC源Exosome对T淋巴细胞的作用机制。方法：首先检测并验证应用病原微生物产物LPS、抑炎因子IL-10、糖皮质激素地塞米松等手段对DC表面分子表达的影响；然后在以上实验基础上提取A：5天无处理组，B：7天无处理组，C：7天LPS组，D：7天地塞米松组，E：7天IL-10组。提取不同培养条件下昆明小鼠骨髓源DC分泌的Exosome，用ICR小鼠（T cell+imDC）+昆明小鼠Exosome模拟混合淋巴细胞反应（MLR），CCK-8方法检测计算各组Exosome对同种异体T淋巴细胞的增殖抑制率。结果：(1)DC表面分子MHC-II、CD80、CD86表达量变化比较如下：LPS组DC表面分子MHC-II、CD80、CD86表达量较其他组明显升高（P<0.05）。(2)各组提取的Exosome表面分子表达量比较如下：MHC-II表达量B组分别与另外四组比较有统计学差异（P<0.05），CD80表达量C组分别与A组、E组比较有显着统计学差异（P<0.05），CD86表达量C组分别与A组、E组比较有统计学差异（P<0.05）。各组提取的Exosome对T细胞增殖抑制率均为正值，各组之间比较均有统计学差异（P<0.05），另外各组组内不同浓度比较亦均有统计学差异（P<0.05）。结论：（1）DC表面分子MHC-II、CD80及CD86表达量随着时间推移逐渐上调，是随时间逐渐走向成熟的过程；地塞米松及IL-10具有拮抗LPS促imDC成熟作用，降低DC表面MHC-II、CD80及CD86的表达量。（2）Exosome表面分子表达量与其来源细胞有关，不同处理组DC来源的Exosome其表面分子表达量不同。（3）各实验组提取的Exosome在imDC辅助下均有抑制T淋巴细胞增殖的作用，且5天无处理组、7天无处理组、7天地塞米松组、7天IL-10组Exosome对T淋巴细胞的增殖抑制率较7天LPS组明显高，并呈现浓度依赖性。各实验组中7天IL-10组抑制T淋巴细胞增殖效果最好。
郭宏伟[8]2002年在《同种异体心脏移植免疫耐受的实验研究》文中指出心脏移植是治疗终末期心脏病的有效措施，但供心来源的短缺、心脏移植术后的排斥反应、长期应用免疫抑制剂所引起的并发症及昂贵的医疗费用都是亟待解决的问题。因此，如何有效地诱导供体特异性的免疫耐受便成为解决上述问题的关键。 细胞后环磷酰胺方案(Cells-followed-by-CP system)是在啮齿类动物中广泛应用，并有潜在临床应用前景的耐受诱导方案。但此方案难于突破组织相容性抗原完全不同的供受体间的免疫屏障，诱导出免疫耐受。本课题在细胞后环磷酰胺方案的基础上，加用多次供体脾细胞输注，来诱导组织相容性抗原完全不同的大鼠间心脏移植的免疫耐受，并对这种耐受产生的机制进行探讨。Starzl提出的双向移植排斥理论和微嵌合体理论认为，嵌合体的形成对移植器官的长期存活起重要作用。但对于嵌合体和移植耐受间的关系尚存争论。本课题通过联体共生模型建立供受体间的嵌合体，探讨嵌合体与移植耐受之间的关系及联体共生诱导心脏移植免疫耐受的机制。课题研究分以下叁个部分： 第一部分：建立大鼠腹部心脏移植模型 采用Ono及陈忠华报道的大鼠腹部心脏移植模型，并作了技术上的改进，将供心主动脉与受体腹主动脉、供心肺动脉与受体下腔静脉行端侧吻合。结果在组织相容性抗原完全不同的大鼠间DA→LEW的心脏移植，供心于7.33±1.03天因捧斥反应而停止跳动；而在纯系间DA→DA、LEW→LEW的心脏移植供心长期存活，均大于100.00±0.00天。大鼠腹部心脏移植模型简单、经济、稳定性强、重复性好，是进行心脏移植免疫学研究的较理想模型。DA、LEW大鼠品系纯正，是进行心脏移植免疫学研究的理想组合。
马丽辉[9]2008年在《骨髓间充质干细胞治疗类风湿关节炎机制和相关研究》文中研究表明类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种高度致残的自身免疫性疾病,是我国造成劳动力丧失和致残的主要病因之一。RA目前尚无根治的方法,临床上所用药物仪能够在一定范围和程度上改善症状、延缓病情进展,且这些药物的副作用较大。另外,迄今为止的研究认为,RA造成的关节滑膜和软骨的破坏是不可逆转的,药物治疗无效,后期关节变形只能借助外科手术矫正。所以目前临床上急需寻找一种有效控制甚至根治类风湿关节炎的方法。骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)是一种具有高度自我增殖能力和多向分化潜能的干细胞。研究表明它具有免疫调节特性,MSCs在维持机体免疫平衡耐受、移植免疫耐受、自身免疫和肿瘤免疫逃逸以及胎-母免疫耐受方面都起到了一个重要作用。MSCs可以作用于T、B淋巴细胞,NK细胞,DC细胞等参与机体免疫调节。另外组织修复是MCSs又一个重要的特性,它参与多种组织的再生和修复。MSCs是一种基质千细胞,在特定的诱导条件下可以分化成多系组织细胞,同时MSCs可以分泌多种基质分子,改善局部受损环境加速损伤修复。近几年临床上MSCs在免疫方面的特性和免疫调节作用越来越受到关注,并有望成为治疗免疫性疾病的工具。所以利用骨髓间充质干细胞定向趋化、调节免疫、促血管和软骨修复等作用有可能为治疗类风湿关节炎找到新的出路。因此,MSCs是否可以治疗RA,以及其治疗机制值得深入研究。本文主要在MSCs治疗类风湿关节炎方面进行了一部分相关的研究。为临床上利用MSCs治疗RA提供可靠的实验基础和理论依据。本文的第一部分主要是骨髓间充质干细胞调节类风湿关节炎患者免疫机制的体外研究。体外实验中我们采集了类风湿关节炎患者的骨髓标本,分离、培养和扩增了RA患者骨髓间充质干细胞,观察了原代和传代的类风湿关节炎患者骨髓间充质千细胞的细胞形态,体外增殖能力、集落形成状况、细胞表面标记、以及电镜超微结构等一般生物学特性;另外在体外实验中我们将MSCs与RA患者T,B淋巴细胞共培养,观察了不同比例状态下MSCs共培养对RA患者T,B淋巴细胞的增殖,活化和功能成熟以及对其免疫调节和产生细胞因子等的影响。实验结果显示,来自RA患者的MSCs呈典型的成纤维样细胞形态、表型鉴定CD45阴性,SH2(CD105)、CD71、CD44均阳性,其增殖能力和CFU-F集落形成状况、以及电镜超微结构等方面都与来源于健康对照组的MSCs无明显差异;MSCs与RA患者T、B淋巴细胞共培养研究发现,正常骨髓来源的MSCs对PHA和SAC刺激的RA患者T、B淋巴细胞的增殖均有抑制作用,并且这种抑制作用与BM-MSC的剂量呈依赖性;MSCs可以阻止T细胞进入细胞增殖周期;MSCs可以明显抑制活化的RA患者T淋巴细胞凋亡;但是MSC能促进B细胞功能成熟,分泌IgG增加。结果提示MSCs在多个环节对T,B淋巴细胞有免疫调节作用,并且上述的免疫调节作用不受MHC的限制。在MSCs对细胞因子产生影响的研究中,我们分别用ELASA方法检测了MSCs与RA患者淋巴细胞共培养上清液中IL-1、TNF-a、TGF-β1的含量,同时用RT-PCR检测了细胞内IL-1、TNF-a、TGF-β1的基因表达。我们看到MSCs与患者淋巴细胞共培养时可以影响IL-1、TNF-a及TGF-β1等细胞因子的产生和表达。在第二部分的研究中,我们利用动物实验主要探讨了在机体内环境下,MSCs对类风湿关节炎大鼠模型的免疫紊乱调节和关节滑膜、软骨损伤的修复效应,以及MSCs治疗类风湿关节炎的可行性、作用机制和治疗途径。我们将体外培养扩增后的MSCs经Brdu标记后从实验动物尾静脉注入,对模型大鼠进行异基因MSCs移植治疗。观察了治疗前后实验动物一般状况和关节肿胀的变化,同时从整体角度,动态观察了MSCs治疗前后实验动物外周血象变化;血清中IL-1、TNF-a及TGF-β1等细胞因子的变化,从局部角度观察了MSCs在受损关节局部滑膜、软骨区的趋化和聚集,以及对受损关节局部滑膜、软骨破坏的保护和修复作用。实验结果提示异基因MSCs移植治疗方法是安全的,并可有效改善RA实验动物的关节肿胀症状。经局部关节滑膜、软骨组织病理切片,BrdU和OPG(骨保护素)免疫组化结果显示,在受损关节滑膜、血管内膜及软骨中均可见大量棕黄色颗粒的BrdU阳性细胞,而正常关节滑膜处棕黄色颗粒出现BrdU阳性细胞数相对较少,同时MSC治疗组关节滑膜中OPG阳性率增加。说明经外周静脉输入的MSCs可集中趋化到实验动物炎症损伤部位,阻止局部组织损伤。并对模型鼠机体免疫紊乱状态起调节作用。MSCs在类风湿关节炎大鼠模型移植治疗有效的研究结果,为利用MSCs的免疫调节和损伤修复特性治疗类风湿关节炎的临床应用提供了有价值的实验基础。在第叁部分的研究中,我们在上两部分的实验结果基础上,进一步观察了1例,利用脐带血间充质干细胞治疗的类风湿关节炎病人。初步观察了临床应用的安全性和治疗效果。结果显示输注脐带血间充质干细胞过程顺利,输注过程中以及输注后均无发热、皮疹、寒战等变态反应出现。单用MSCs输注后患者关节疼痛症状减轻、血沉下降、类风湿因子转阴、T细胞亚群恢复。
佚名[10]2010年在《基础免疫》文中指出脂筏在tmTNF-α反向信号传递中的作用陈克清刘涛于敏胡雪娜冯玮姜小丹王晶李卓娅华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉430030背景及目的:脂筏是位于细胞膜上的富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,目前认为脂筏作为信号转导的平台发挥重要的生物学功能。前期工作证明跨膜TNF-α(tmTNF-α)不仅可以传递正向信号,也能作为受体向自身胞内传递信号,即反向信号。tmTNF-α的反向信号表现为NF-κB持续性活化。有
参考文献：
[1]. MSCs诱导体外分化来的Naive T细胞免疫耐受的实验研究[D]. 金建刚. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004
[2]. 转hCTLA4Ig树突状细胞诱导T细胞免疫耐受的实验研究[C]. 贺伟峰, 吴军, 易绍萱, 罗高兴, 陈希炜. 全国烧伤创面处理、感染专题研讨会论文汇编. 2004
[3]. 干细胞调控CD45RB~+调节性树突状细胞在同种异体心脏移植中的作用[D]. 华菲. 苏州大学. 2016
[4]. 泡状棘球蚴感染诱导免疫耐受的实验研究[D]. 买合皮热提汗·艾尔肯. 新疆医科大学. 2012
[5]. 受体来源大鼠ADSCs分化的类肝细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究[D]. 刘剑. 昆明医科大学. 2011
[6]. p65低表达慢病毒诱导大鼠角膜移植免疫耐受的作用及机制[D]. 杨济泽. 南方医科大学. 2016
[7]. 小鼠树突状细胞分泌的Exosome对同种异体T细胞增殖影响的实验研究[D]. 许经伟. 苏州大学. 2014
[8]. 同种异体心脏移植免疫耐受的实验研究[D]. 郭宏伟. 中国协和医科大学. 2002
[9]. 骨髓间充质干细胞治疗类风湿关节炎机制和相关研究[D]. 马丽辉. 山西医科大学. 2008
[10]. 基础免疫[C]. 佚名. 第七届全国免疫学学术大会论文集. 2010
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