（1广州市红十字会医院广东广州510220；2广州市创伤外科研究所广?F所广东广州510220）
【摘要】目的研究口腔精密附着体生物膜形成中死菌/活菌的空间分布。方法采集20例磁性附着体组织面菌斑生物膜,应用激光共聚焦扫描显微镜和死菌/活菌荧光染色方法,对生物膜形成中死菌/活菌的空间分布进行观察。结果生物膜底部的?E?2%;随着生物膜厚度的增加,活菌百分比达到74%,其间存在许多黑色气泡样的间隙;随后活菌百分比逐渐减少,至生物膜顶部时几乎全部为死菌。结论口腔精密附着体生物膜的底部和顶部主要由死细菌组成,而中间层主要是由围绕在黑色气泡样孔和通道周围的活细菌组成。
【关键词】口腔精密附着体生物膜死菌/活菌激光共聚焦扫描显微镜
SpatialDistributionofDead/VitalCellsinthePrecisionAtttachmentsBiofilm
LuXiao1LaiXiaoyu1YangXiaohong2YeZhijia1HuangMeizhuang1(1GuangzhouRedCrossHospitalGuangdongGuangzhou510220;2GuangzhouResearchInstituteofTraumaticSurgeryGuangdongGuangzhou510220)
【Abstract】Objective：Toexaminethespatialdistributionofdead/vitalcellsinthePAbiofilm.Methods：Collect20biofilmsfromthesurfaceofmagPA.Confocallaserscanningmicroscopyanddead/vitalfluorescentstainningtechniquewerecombinedtostudythedistributionofdead/vitalcells.Results：Thepercentofvitalcellswas12%atthebottomofthebiofilm,withbiofilmdepthincreased,approachedto74%,therearemanyblackbubbleduringthekindofspace，andthengraduallydecreasedtoothebiofilmatthetopofalmostallthedeadbacteria.Conclusion：Oralbiofilmattachmentofprecisionatbothtopandbottomofthemaincomponentsfromdeadbacteria,andthemiddlehasthemainbubblesfromaroundtheblackholeandchannel-likeorbacterialcompositionofthesurrounding.
【Keywords】precisionattachmentsbiofilmdead/vitalbacteriaconfocallaserscanningmicroscopy
口腔精密附着体(precisionatttachments，PA)作为一种新型义齿固位体，美观舒适，能显著改善义齿固位力和稳定性，越来越受到患者和医生的欢迎。但有报道指其易发生菌斑(dentalplaque)聚集，威胁基牙、口腔粘膜健康，继发基牙龋坏、牙周炎等问题[1]。目前尚缺乏对PA表面菌斑生物膜(biofilm,BF)结构和生理病理特性的研究。本研究应用激光共聚焦扫描显微镜和死菌/活菌荧光染色技术相结合对死菌/活菌在PA表面菌斑生物膜中的空间分布进行研究,旨在为菌斑的有效控制提供理论根据和实验依据。
1材料与方法
1.1样本选择在广州市红十字会医院口腔科门诊就诊，临床最常见的磁性附着体义齿修复患者20例，纳入标准：(1)有良好的口腔卫生习惯，无特殊饮食(高糖、辛辣等)习惯；(2)60－70岁，性别不限；(3)无全身系统性疾病；(4)头颈部未进行过放疗、化疗及手术治疗；(5)龋齿已充填，无残冠、残根，牙龈指数0,1。(6)采样前2周内未使用抗生素、激素、免疫制剂；(7)无涎腺及导管疾病，无口腔粘膜病及其它口腔炎症。
1.2死/活菌染色剂L-7012LIVE/DEADRBlaclightTMBacterialViabilityKit(MolecularProbes,USA)。
1.3主要仪器激光共聚焦显微镜（ZeissLSM510META，Germany）及辅助设备和相关软件，高速冷冻离心机(HITACH，Japan)。
1.4方法和步骤采样固定于早上9:00－10:00，要求患者当天清晨不刷牙、不刷洗义齿、不进食。清水轻漱后，无菌刮器采集精密附着体与基牙交界处完整菌斑生物膜。硫代乙醇盐运送液运送标本，液面加盖无菌液体石蜡，2h内转运至实验室。按照厂商说明，对经蒸馏水轻轻漂洗的载有菌斑生物膜的玻片进行死/活菌染色。使用激光共聚焦显微镜对口腔精密附着体菌斑生物膜进行连续断层扫描,并计算每层活菌百分比,从而确定血链菌生物膜结构中死菌/活菌的空间分布情况。在激光共聚焦显微镜下死菌表现为红色,活菌为绿色。
2结果
激光共聚焦显微镜下连续断层扫描观察,口腔精密附着体菌斑生物膜的底部主要是死细菌,活菌百分比较低,随着生物膜厚度的增加,其活菌百分比迅速增高,中间层主要由活细菌组成,而且可见许多黑色空隙;当生物膜达到一定的厚度时,活菌百分比开始下降,至生物膜的顶端,仅有稀疏的死细菌存在,而少见活菌(图1、2)。
3讨论
激光共聚焦显微镜可以直接对完整自然水化状态的生物膜进行研究,并可以将一定厚度的生物膜进行连续断层扫描获得单个细胞、一群细胞或局部组织不同层面的精细图像,经三维重建后获得完整的生物膜立体结构，而且应用激光共聚焦显微镜和死菌/活菌荧光染色技术相结合,就可以在保证菌斑生物膜结构完整的情况下,对菌斑形成过程中的死菌、活菌进行原位的观察。
本研究图像显示：生物膜的底层大部分是由死细菌组成的,占80%左右,活菌较少,这是由于死菌对固体表面的粘附能力强于活菌,在生物膜形成初期先于活菌粘附，具有促进菌斑形成的作用[2]。而随着生物膜厚度的增加,活细菌逐渐增加,达到一定的厚度时,生物膜主要是由活细菌组成的，其间存在许多黑色气泡样的空隙,这些空隙不能被着色,Debeer[3]应用特殊荧光素对此结构进行标记后发现:这些大大小小的孔和通道是生物膜结构的重要组成部分,存在于整个生物膜的结构之中，其中充满了细胞外多糖和糖蛋白等营养物质。Wood[4]对牙菌斑生物膜的结构研究后也发现:这口腔精密附着体(precisionatttachments，PA)作为一种新型义齿固位体，美观舒适，能显著改善义齿固位力和稳定性，越来越受到患者和医生的欢迎。但有报道指其易发生菌斑(dentalplaque)聚集，威胁基牙、口腔粘膜健康，继发基牙龋坏、牙周炎等问题[1]。目前尚缺乏对PA表面菌斑生物膜(biofilm,BF)结构和生理病理特性的研究。本研究应用激光共聚焦扫描显微镜和死菌/活菌荧光染色技术相结合对死菌/活菌在PA表面菌斑生物膜中的空间分布进行研究,旨在为菌斑的有效控制提供理论根据和实验依据。
1材料与方法
1.1样本选择在广州市红十字会医院口腔科门诊就诊，临床最常见的磁性附着体义齿修复患者20例，纳入标准：(1)有良好的口腔卫生习惯，无特殊饮食(高糖、辛辣等)习惯；(2)60－70岁，性别不限；(3)无全身系统性疾病；(4)头颈部未进行过放疗、化疗及手术治疗；(5)龋齿已充填，无残冠、残根，牙龈指数0,1。(6)采样前2周内未使用抗生素、激素、免疫制剂；(7)无涎腺及导管疾病，无口腔粘膜病及其它口腔炎症。
1.2死/活菌染色剂L-7012LIVE/DEADRBlaclightTMBacterialViabilityKit(MolecularProbes,USA)。
1.3主要仪器激光共聚焦显微镜（ZeissLSM510META，Germany）及辅助设备和相关软件，高速冷冻离心机(HITACH，Japan)。
1.4方法和步骤采样固定于早上9:00－10:00，要求患者当天清晨不刷牙、不刷洗义齿、不进食。清水轻漱后，无菌刮器采集精密附着体与基牙交界处完整菌斑生物膜。硫代乙醇盐运送液运送标本，液面加盖无菌液体石蜡，2h内转运至实验室。按照厂商说明，对经蒸馏水轻轻漂洗的载有菌斑生物膜的玻片进行死/活菌染色。使用激光共聚焦显微镜对口腔精密附着体菌斑生物膜进行连续断层扫描,并计算每层活菌百分比,从而确定血链菌生物膜结构中死菌/活菌的空间分布情况。在激光共聚焦显微镜下死菌表现为红色,活菌为绿色。
2结果
激光共聚焦显微镜下连续断层扫描观察,口腔精密附着体菌斑生物膜的底部主要是死细菌,活菌百分比较低,随着生物膜厚度的增加,其活菌百分比迅速增高,中间层主要由活细菌组成,而且可见许多黑色空隙;当生物膜达到一定的厚度时,活菌百分比开始下降,至生物膜的顶端,仅有稀疏的死细菌存在,而少见活菌(图1、2)。
3讨论
激光共聚焦显微镜可以直接对完整自然水化状态的生物膜进行研究,并可以将一定厚度的生物膜进行连续断层扫描获得单个细胞、一群细胞或局部组织不同层面的精细图像,经三维重建后获得完整的生物膜立体结构，而且应用激光共聚焦显微镜和死菌/活菌荧光染色技术相结合,就可以在保证菌斑生物膜结构完整的情况下,对菌斑形成过程中的死菌、活菌进行原位的观察。
本研究图像显示：生物膜的底层大部分是由死细菌组成的,占80%左右,活菌较少,这是由于死菌对固体表面的粘附能力强于活菌,在生物膜形成初期先于活菌粘附，具有促进菌斑形成的作用[2]。而随着生物膜厚度的增加,活细菌逐渐增加,达到一定的厚度时,生物膜主要是由活细菌组成的，其间存在许多黑色气泡样的空隙,这些空隙不能被着色,Debeer[3]应用特殊荧光素对此结构进行标记后发现:这些大大小小的孔和通道是生物膜结构的重要组成部分,存在于整个生物膜的结构之中，其中充满了细胞外多糖和糖蛋白等营养物质。Wood[4]对牙菌斑生物膜的结构研究后也发现:这些孔和通道贯穿于整个牙菌斑的结构之中,其功能类似原始循环系统,活细菌紧紧围绕在这些孔和通道的周围,从而保证了营养的获取和代谢废物的排出。本研究结果表明生物膜内部由类似蘑菇形状的微菌落和网状输水通道组成，具有不均质性。微菌落间围绕的输水通道，可运送养料、酶、代谢产物和排出废物，这与Beloin等人的报道相符[5，6，7]。生物膜的表层大部分是由死细菌组成的,几乎见不到活菌。我们认为死菌/活菌的这种不均衡分布也是生物膜结构中自身防御的一种手段,表层死菌的存在必然对外界抗生素的渗透起到阻碍的作用；同时大量死菌增加了生物膜厚度，局部酸性代谢产物的积累以及厌氧微环境严重影响了抗生素的活性[8]。
PA作为一种新型义齿固位体，基牙健康是PA成功的基础，只有通过有效控制菌斑生物膜来预防基牙继发龋和牙周炎，才能延长PA和义齿的使用寿命，保障患者的口腔健康[9]。我们通过对生物膜中死菌/活菌的这种不均衡分布现象的观察后认为：临床对PA菌斑的控制应采用能够渗透入生物膜内部的抗炎、抗菌等微生态制剂来选择性地抑制龋病、牙周致病菌的定植，并对PA材料表面进行改性，从而影响细菌的粘附[10];同时常规使用机械净化方式，可使死菌从牙面上脱落,否则即使是死菌也可以促进菌斑很快地再形成。最近SchwarzF经过体内试验，发现Er:YAG激光是最合适的技术之一[11]。
Fig2Bacterialdistributionofdead/vitalcellsintheＰＡＢＦfluorescentstainnin．Deadcellswereredstained,vitalcellsweregreenstained.
A:intheouterpartoftheＰＡＢＦ.
B:inthemiddleoftheＰＡＢＦ、
C:atthebottomoftheＰＡＢＦ.
基金项目：广州市医药卫生科技项目(2007-YB-045)
参考文献
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