禽致病性大肠杆菌lsrR基因敲除对耐药性影响的研究

2020-12-08阅读(741)

论文摘要

禽致病性大肠杆菌是一种在家畜养殖业中最常见的致病菌,禽致病性大肠杆菌感染会使家禽死亡率增加,给养禽业带来巨大的经济损失。已有转录组学实验证实了lsrR的敲除会影响到大肠杆菌100多个基因的转录水平,这涉及到了生物被膜形成、转录调控、压力环境下的蛋白表达及营养获取等生理活动。经查找文献发现MFS外排泵中的转运蛋白MdtH对诺氟沙星具有抗性。此实验揭示了禽致病性大肠杆菌lsrR缺失对于耐药基因mdtH的影响,进而阐明了lsrR对耐药基因mdtH的调控机制。1.用二倍稀释法验证诺氟沙星,氧氟沙星,环丙沙星和四环素对WT（AEPC40）和XY10（AEPC40AlsrR）的耐药程度。结果发现,WT和XY10对四种抗生素的MIC值是一样的。用CFU法检验抗生素对WT和XY10耐药性的影响,结果显示四种抗生素对WT和XY10的影响趋势是一致的,XY10的CFU值都比WT的CFU值高2倍以上。2.构建lsrR和mdtH的过表达菌株,在四种抗生素压力下,过表达菌株WT/pUClsrR 的 MIC 值与 WT/pUC19 和 XY10/pUC19 的 MIC 值相比降低了 8 倍,在四环素压力下过表达菌株WT/pUClsrR的MIC值与WT/pUC19和XY10/pUC19的MIC值相比降低了 4倍。在这四种抗生素下,WT/pUClsrR的CFU比WT/pUC19降低了 5倍以上,WT/pUCmdtH的CFU 比 WT/pUC19升高了 2倍以上。表明lsrR的缺失可能对mdtH的转录水平有调控作用。3.采用 RT-qPCR 验证 WT/pUC19、WT/pUClsrR、WT/pUCmdtH、WT/pSTV28、XY10/pSTV28和XY10/pClsrR这几株菌株关于基因mdtH的转录水平。结果表明,lsrR的缺失能使mdtH的转录水平上调。4.采用EMSA实验检测到mdtH基因启动子区域与LsrR蛋白特异性结合。证明了 LsrR蛋白直接调控耐药基因mdtH的转录。该研究的进一步研究或可为治疗禽致病性大肠杆菌提供新的药物靶标与治疗思路。

论文目录

致谢

摘要

ABSTRACT

英文缩写词表

文献综述

1 禽致病性大肠杆菌的研究背景

1.1 大肠杆菌的概述

1.2 APEC的致病机制

1.3 APEC的毒力因子

1.4 APEC的防治方法

2 lsrR基因的研究进展

2.1 lsrR基因的研究背景

2.2 群体感应系统研究进展

2.3 具有Lsr系统的AI-2在细菌中的作用

3 细菌的主要外排泵研究进展

3.1 细菌的主要外排泵的概述

3.2 MFS外排泵的研究进展

1 引言

1.1 本课题研究的目的及意义

1.2 国内外研究进展

1.3 实验内容和方法

1.4 主要技术路线

2 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验菌株

2.1.2 主要试剂和试剂盒

2.1.3 培养基和常用试剂的配制

2.1.4 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 分子生物学法鉴定菌株

2.2.2 APEC药敏试验

2.2.3 抗生素对APEC生长的影响

2.2.4 过表达菌株和回补菌株的表达

2.2.5 生长曲线的测定

2.2.6 APEC总RNA的提取

2.2.7 RT-qPCR检测目的菌株中mdtH基因的转录水平

2.2.8 LsrR蛋白纯化表达

2.2.9 凝胶阻滞实验

3 结果与分析

3.1 WT和XY10的药敏试验

3.1.1 目的菌株最小抑菌浓度（MIC）

3.2 抗生素对WT和XY10生长的影响

3.2.1 CFU法

3.3 回补lsrR以及过表达lsrR、mdtH

3.4 过表达和回补菌株的药敏试验

3.4.1 过表达和回补菌株最小抑菌浓度（MIC）

3.5 抗生素对过表达和回补菌株生长的影响

3.5.1 CFU法

3.6 生长曲线测定

3.7 反转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

3.7.1 总RNA质量鉴定

3.7.2 RT-qPCR检测目的菌株mdtH的转录水平

3.8 LsrR蛋白对mdtH的调控机制

3.8.1 克隆载体的构建

3.8.2 LsrR蛋白的提取与纯化

3.8.3 LsrR蛋白对mdtH的调控机制

4 讨论

4.1 APEC耐药现状

4.2 基因lsrR与mdtH之间的联系

4.3 RT-qPCR对目的菌株mdtH转录水平的检测

4.4 LsrR蛋白对mdtH的调控机制

5 结论

参考文献

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李倩

导师: 薛挺

关键词: 禽致病性大肠杆菌,耐药性,抗生素

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 安徽农业大学

分类号: S852.61

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000384

总页数: 66

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