徐正婕[1]2003年在《Kupffer细胞在非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用》文中研究指明研究目的1. 通过高脂饮食建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝纤维化模型。2. 观察大鼠NASH形成过程中Kupffer细胞活性的变化，以及NASH大鼠对内毒素敏感性的改变，明确NASH时Kupffer细胞功能的改变。3. 探讨NASH大鼠Kupffer细胞功能改变的机制，包括肠道环境的变化、肠源性内毒素血症，以及游离脂肪酸、极低密度脂蛋白（VLDL）的作用等方面。研究方法1. 以普通饲料+2%胆固醇+10%猪油组成的高脂饲料喂养雄性SD大鼠，在实验4、8、12、16和24周分批处死。测定体重、肝脏湿重、血脂和血清转氨酶。通过HE染色和VG苦味酸染色观察肝脏肝细胞脂肪变性、炎症和纤维化程度。通过免疫组化了解肝脏Ⅲ型胶原、转化生长因子β1（TGFβ1）、α－平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达。2. 在不同实验阶段，免疫组化染色法动态观察高脂饮食模型大鼠肝脏溶菌酶和内毒素结合受体CD14抗原表达，RT-PCR法观察肝脏内毒素信号受体TLR4 mRNA细胞因子TNF-α mRNA表达，ELISA法测定血清细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。3. 实验24周，高脂饮食模型大鼠腹腔内注射小剂量的内毒素（0.5mg/kg）后观察24小时生存率，测定血脂、血糖、血清转氨酶，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，肝组织行HE染色和VG染色观察肝脏病理。4. 在实验不同阶段，鲎试剂偶氮显色法测定高脂饮食模型大鼠外周血和门静脉血血清内毒素水平。乳果糖组大鼠高脂饮食8周后口服乳果糖水溶液，16周处死，观察体重、肝脏湿重、血脂、血清转氨酶以及肝脏病理改变。5. 免疫细胞化学法和放射免疫法观察软脂酸、油酸、VLDL对巨噬细胞RAW264.7核因子κB（NFκB）活性和内毒素敏感性的影响。研究结果1. 高脂饮食大鼠，4周出现肝细胞脂肪变性，8周表现为单纯性脂肪肝，12周~24周进展为脂肪性肝炎，24周还出现肝纤维化。第4周起高脂饮食模型大鼠肝组织CD14表达上调，溶菌酶阳性的Kupffer细胞被激活，并随着实验的进行更加明显。肝脏TLR4mRNA表达从8周开始上调，16周和24周表达最强，TNF-α mRNA在8周~24周均有表达。血清TNF-α水平从<WP=6>2. 8周起明显增高，IL-1β从16周起升高，IL-6水平则无明显变化。3. 注射内毒素后24小时，24周高脂饮食模型大鼠出现急性肝功能衰竭，表现为存活率明显降低，血糖明显降低，血清ALT和AST明显升高，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显着升高，肝组织炎症活动度计分明显升高，肝窦内还有大量血细胞淤滞。4. 高脂饮食模型大鼠腹主动脉血血清内毒素水平在24周明显升高，门静脉内毒素水平在4周~16周未见明显升高，但同期门静脉血清内毒素水平高于腹主动脉血水平。乳果糖口服明显改善高脂饮食大鼠血清转氨酶和肝组织炎症，但未减轻肝细胞脂肪变性程度。5. 软脂酸、油酸、VLDL处理24小时可以使RAW264.7细胞核NFκB阳性率明显增加，以软脂酸最为明显；软脂酸、油酸、VLDL处理24小时还可使100μg/ml内毒素刺激后RAW264.7细胞生成的TNFα不同程度的增多。研究结论1. 持续24周的高脂饮食可以诱导雄性SD大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化模型。2. Kupffer细胞活化，伴随内毒素受体TLR4和CD14表达上调，TNFα等细胞因子生成增多，是大鼠NASH形成过程中的早期事件，也是NASH大鼠对内毒素肝损伤的敏感性增强的重要原因。3. 肝脏游离脂肪酸和VLDL增多可能是NASH大鼠的Kupffer细胞活化和内毒素敏感性增强的原因之一。4. 大鼠NASH的早期，并不存在肠源性内毒素血症，但由于Kupffer细胞内毒素敏感性增强，肠道细菌过度生长以及肠源性内毒素仍在NASH的发病中起了一定的作用。
范建高, 钟岚, 王国良, 巫协宁, 李明升[2]2001年在《枯否氏细胞在大鼠非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用》文中认为目的 探讨枯否氏细胞在大鼠非酒精性脂肪性肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ， ＮＡＳＨ）发病中的作用。方法 １９只雄性ＳＤ大鼠随机分为模型组（１０只）和正常组（９只），分别予高脂肪饮食和标准饮食饲养１２周。ＨＥ染色观察肝组织切片病理学改变，透射电镜和溶菌酶免疫组织化学染色观察枯否氏细胞的数量和形态。结果 模型组大鼠均出现肥胖、高脂血症伴肝细胞大泡性脂肪变、小叶内炎症细胞浸润和坏死。与正常组相比，模型组肝小叶内抽否氏细胞数显着增加，并呈活化状态；模型组枯否氏细胞变化与其肝病理学改变相一致。结论 高脂饮食大鼠肝脏枯否氏细胞增多，并可能与其脂肪性肝炎的发病有关。
程琦[3]2005年在《NASH肝细胞凋亡与COX-2表达的实验研究》文中提出目的：探讨COX-2在非酒精性脂肪性肝炎肝细胞的表达与肝细胞凋亡的关系。方法：雄性SD大鼠30只，随机分为模型组(n=10)、酒精灌胃对照组(n=10)和正常对照组(n=10)。模型组喂养高脂饮食，即普通饲料基础上加10％猪油、2％胆固醇、5％蛋黄粉。酒精灌胃对照组加以酒精灌胃喂养。正常对照组喂养普通饲料。喂养12周后，观察一般情况，检测大鼠血清生化指标及炎症介质，并行肝组织病理检查。应用RT-PCR方法，检测肝组织COX-2mRNA的表达，并应用TUNEL的方法观察肝细胞凋亡。结果：模型组体重、肝体比、血清甘油叁脂(TG)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)均高于正常组；病理学均出现弥漫性肝细胞脂肪变性，且90％存在小叶内炎症，80％出现汇管区炎症；电镜示肝细胞索排列紊乱，胞浆脂滴大量出现聚积，线粒体嵴肿胀，肝星状细胞和枯否细胞增生，细胞核变形，部分呈现核固缩。NASH模型组和酒精对照组大鼠COX-2表达均明显高于正常对照组(p＜0.01)，其凋亡指数亦明显高于正常肝细胞(p＜0.01)。模型组与酒精对照组之间无显着区别(p＞0.05)。结论：通过12周的高脂肪、高胆固醇饮食成功地制备出大鼠NASH模型；COX-2可以促进非酒精脂肪性肝炎肝细胞凋亡，在NASH发病过程中发挥重要作用。
王文军[4]2016年在《内毒素在高糖高脂诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝炎发病机制中的作用》文中进行了进一步梳理目的:采用高糖高脂饮食诱导建立非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)大鼠模型,通过检测血浆内毒素(lipopolysaccharide,LPS)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和CD68(巨噬细胞标记物)以及内质网应激(endoplasmic reticulum,ERS)重要相关因子葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)的表达,观察大鼠肝细胞凋亡水平变化特点,探讨LPS在大鼠NASH发生发展中的作用机制。方法:1.建立NASH大鼠模型及分组:30只雄性SD大鼠均给予标准基础饲料,自由进食饮水叁天后,随机分为9周组:Synthetic diet+saline组(n=5)、Synthetic diet+LPS组(n=5)、Regular diet+LPS组(n=5)和Regular diet+saline组(n=5),另外设立5周组:Synthetic diet组(n=5)和Regular diet组(n=5),并在第5周末将大鼠进行麻醉后处死以观察Synthetic diet对大鼠肝脏影响。Synthetic diet配方为68.75%普通饲料+20%猪油+10%蔗糖+1%胆固醇+0.25%胆酸。自第6周开始,9周组动物在相同条件下隔日皮下注射LPS 0.5mg/Kg或相同剂量的生理盐水,所有大鼠自由进食与饮水。在实验第9周末,1%戊巴比妥钠3ml/Kg腹腔注射麻醉动物,无菌无热原条件下取腹主动脉血,3500rpm离心后取血浆置于–70℃冰箱冻存备用。取部分肝左叶10%福尔马林固定,石蜡包埋,5μm切片,余肝组织置于﹣70℃冰箱备用。2.5周组肝组织切片HE染色,在光镜下观察肝脏病理学变化。采用放免法测定9周组血浆TNF-α水平;赖氏2、4-二硝基苯肼比色法测定9周组血浆ALT活性;鲎试剂法测定9周组血浆LPS水平。采用免疫组织化学方法测定9周组肝脏CD68(巨噬细胞标记物)的表达。采用TUNEL法测定9周组肝细胞凋亡水平。采用Western blot法测定9周组肝组织GRP78蛋白表达量。结果:1.HE染色在光镜下可见5周正常对照组肝组织肝小叶结构完整,肝细胞核圆位于中央,呈条索状排列整齐,以中央静脉为中心呈放射状排列,肝细胞内未见脂滴,而5周高糖高脂饮食组肝细胞体积增大,可见小泡脂滴,细胞轮廓模糊,肝细胞呈轻度脂肪变性。2.9周组中Synthetic diet+saline组血浆LPS、ALT、TNF-α水平显著高于Regular diet+saline组,具有统计学差异(p<0.05);Synthetic diet组经LPS处理后,血浆LPS、ALT、TNF-α水平显著高于Regular diet+LPS组和Synthetic diet+saline组(p<0.05);而在Regular diet组经LPS处理后,与Regular diet+saline组相比血浆LPS、ALT与TNF-α水平无明显变化(p>0.05)。3.9周组中Regular diet+saline组肝脏较少见CD68阳性单核巨噬细胞浸润,当其经LPS处理后CD68阳性细胞无明显增多(p>0.05);Synthetic diet+LPS组(0.140±0.018)可见大量巨噬细胞浸润,CD68阳性表达量与Regular diet+LPS组(0.053±0.018)、Synthetic diet+saline(0.100±0.017)组相比均有显着差异(p<0.05)。4.9周组中Synthetic diet组经LPS处理后GRP78蛋白表达水平明显上调,要显着高于Regular diet+LPS组和Synthetic diet+saline组(p<0.05);Synthetic diet+saline组高于Regular diet+saline组(p<0.05);Regular diet组经LPS处理后与Regular diet+saline组相比无显着差异(p>0.05)。5.在9周正常对照组偶见少量的肝细胞凋亡,经LPS处理后,与正常对照组相比可以看到肝细胞凋亡数量无明显变化,凋亡率无显着差异(p>0.05);Synthetic diet+saline组肝细胞凋亡增多,凋亡率升高,经LPS处理后肝细胞凋亡率达到最高值(57.08±6.21),与Synthetic diet+saline组(32.10±3.64)、Regular diet+LPS组(7.08±2.64)相比均差异显着,有统计学意义(p<0.05)。6.经Pearson’s相关性分析,LPS与ALT表达明显正相关,r=0.78,p<0.05;CD68与TNF-α表达明显相关,r=0.64,p<0.05,GRP78表达量与肝细胞凋亡数呈明显正相关,r=0.77,p<0.05。结论:1.高脂高糖饮食可以诱导建立NASH大鼠模型;2.LPS可对肝脏造成“二次打击”,促进了NASH的发生发展;3.LPS可激活大鼠肝脏巨噬细胞释放大量促炎因子TNF-α;4.在NASH大鼠肝组织中存在内质网应激反应,促炎因子TNF-α可能是引起内质网应激的重要因子,而且内质网应激参与了肝细胞凋亡这一病理过程。
赵文慧[5]2008年在《IETM在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用》文中研究说明目的:探讨肠源性内毒素血症(intestinal endotoxemia, IETM)与胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)之间的关系,研究IETM在非酒精性脂肪肝性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)发生发展中的作用。方法:实验1. Wistar大鼠32只,雌雄各半,按随机区组设计,分配雌雄两个区组的大鼠为4组:正常对照组(normal control;NC)以正常饲料喂养,不饱和脂肪酸组(unsaturated fatty acid;NSFA)以不饱和脂肪酸饲料喂养,饱和脂肪酸组(saturated fatty acid;SFA)以饱和脂肪酸饲料喂养,高糖高脂组(high sucrose and high-fat dict;HSF)以高蔗糖高饱和脂肪酸饲料喂养,每组8只,雌雄各半,分笼饲养,造模9周形成NAFLD模型。肝脏苏木素-伊红(HE)、sudanⅣ染色观察肝脂变,透射电镜下观察肝脏细胞及细胞外基质的超微结构变化。测定空腹血糖(FPG)、空腹血胰岛素(FINS)含量,外周血浆游离脂肪酸(FFA),肝匀浆甘油叁酯(TG),外周血浆及肝组织匀浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α),计算胰岛素抵抗指数(IRI,HOMA-IR)及胰岛素敏感指数(ISI)。实验2.动物和分组同实验1,测定外周血浆内毒素(LPS)、丙氨酸氨基转移酶(ALT),血浆及肝组织匀浆丙二醛(MDA)含量。免疫组化法测肝脏和腹部脂肪组织TNF-α,检测各组动物肝脏和腹部脂肪组织免疫组化TNF-α的表达。结果:1.NAFLD大鼠模型建立情况:肝脏HE、sudanⅣ染色结果证实:造模九周后,NSFA大鼠为单纯性脂肪肝,SFA、HSF大鼠为脂肪性肝炎。电镜下观察肝脏线粒体肿胀变形,嵴排列紊乱,甚至断裂消失,说明存在肝损伤。2.血浆FFA、FINS、肝匀浆TG、血浆及肝匀浆TNF-α测定及IRI、ISI计算结果:叁个模型组各指标与NC组比均有统计学意义;外周血浆FFA:NSFA高于SFA,HSF高于SFA,但无统计学差异;肝匀浆TG:SFA组显着高于NSFA组,HSF组显着高于SFA组,有统计差异;FINS、IRI:SFA组高于NSFA组,HSF组高于SFA组,但无统计学差异;ISI:SFA组低于NSFA组,HSF组低于SFA组,但无统计差异;血浆及肝匀浆TNF-α:SFA组高于NSFA组,无统计差异,HSF组显着高于SFA组,有统计差异。3.外周血浆LPS、ALT、血浆及肝匀浆MDA测定结果:除NSFA组血浆ALT与NC组比无统计差异外,其他各组指标均有统计差异;血浆ALT、LPS、肝匀浆MDA:SFA组显着高于NSFA组,HSF组显着高于SFA组,有统计学差异;血浆MDA:SFA组高于NSFA组,HSF组高于SFA组,但无统计学差异。4.肝组织及脂肪组织免疫组化TNF-α蛋白表达结果:肝组织TNF-α:NSFA组与NC组比虽有增高,但无统计差异;SFA组、HSF组在统计学上均显着高于NC组;SFA组显着高于NSFA组,HSF组显着高于SFA组,有统计学差异。脂肪组织TNF-α:NSFA组、SFA组、HSF组均显着高于NC组,有统计学差异;SFA组高于NSFA组,HSF组高于SFA组,有显着统计学意义。5.电镜结果:叁个模型组肝细胞线粒体均有不同程度的肿胀、变形、嵴断裂消失等,SFA较NSFA严重,HSF较饱和组严重。6.相关分析结果:⑴IR与体重、血浆FFA、血浆及肝匀浆TNF-α间存在正相关。⑵LPS与体重、血浆ALT、FFA、血浆及肝匀浆TNF-α、MDA、肝组织及脂肪组织TNF-α蛋白间存在正相关。结论:1.肝脂肪变、脂肪性肝炎大鼠发生了胰岛素抵抗,FFA、TNF-α与胰岛素抵抗形成有关。2.肝脂肪变、脂肪性肝炎大鼠发生了内毒素血症,内毒素血症与胰岛素抵抗相关,LPS可能通过FFA、TNF-α启动IR,导致肝损伤。由此可以认为:肠源性内毒素通过促进TNF-α的释放,进而引起FFA大量增多启动IR,导致脂肪肝的形成,继而向NASH发展。
王强[6]2006年在《不同治法方药对大鼠脂肪肝kupffer细胞ERK1/2蛋白活性的影响》文中提出目的：高脂高糖饮食、白酒灌胃复制大鼠脂肪肝实验动物模型。观察疏肝、健脾、活血、祛湿、综合不同治法方药对大鼠脂肪肝kupffer细胞ERK1／2蛋白活性的影响。 方法：利用高脂高糖饮食、白酒灌胃复制大鼠脂肪肝实验动物模型，同时给予疏肝、健脾、活血、祛湿、综合不同方药进行干预。12周后采用Ⅳ型胶原酶-蛋白酶E灌注消化，密度梯度离心，选择性贴壁方法分离不同组别大鼠肝kupffer细胞，采取western blot方法检测不同组别大鼠肝kupffer细胞ERK1／2蛋白的表达及其磷酸化水平的变化。 结果：模型组大鼠肝组织呈中度至重度脂肪变性。健脾组和疏肝组大鼠肝组织脂肪变明显减轻，正常组与模型组、健脾组与模型组、疏肝组与模型组比较，肝组织脂肪变程度均有显着性差异(P＜0.05)。模型组大鼠肝组织炎症活动计分明显高于正常组大鼠(P＜0.05)。模型组大鼠kupffer细胞ERK1／2蛋白的表达和磷酸化ERK1／2蛋白的表达较正常组明显增加，各干预组ERK1／2表达和磷酸化ERK1／2蛋白的表达均较模型组降低，其中疏肝组、健脾组ERK1／2蛋白表达和磷酸化ERK1／2蛋白的表达与模型组比较明显降低。 结论：连续12周高脂高糖饮食、白酒灌胃成功复制大鼠脂肪肝实验动物模型，在大鼠脂肪肝的形成过程中肝kupffer细胞ERK1／2蛋白高表达和磷酸化ERK1／2蛋白高表达可能起到了重要作用，kupffer细胞ERK1／2蛋白的高表达和磷酸化ERK1／2蛋白高表可能参与并促进了脂肪性肝损伤。抑制ERK1／2蛋白的表达及磷酸化可能是健脾疏肝方药抗实验性大鼠脂肪肝的机制之一。饮食不节，劳逸失度是脂肪肝的基本病因，肝气郁结、脾不健运是脂肪肝的基本病机，疏肝健脾法是防治脂肪肝的基本治法。
高云[7]2014年在《TIR/BB环拟似物AS-1对非酒精性脂肪性肝炎的作用及其机制研究》文中指出非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)是非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)这一疾病谱中的关键阶段,可发展至肝硬化甚至肝癌,并且随着生活水平的提高,发病率逐年上升,严重威胁人类健康。NASH常见于肥胖、糖尿病、高血脂等患者,遗传因素、营养因素、代谢障碍等多重因素可参与疾病的发展。大量研究证实,先天免疫在非酒精性单纯性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver, NAFL)向NASH的发展中发挥了至关重要的作用。Kupffer细胞是肝脏内最主要的免疫细胞,是肝脏中天然免疫的重要组成部分。免疫细胞能够表达一系列的模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs), Nod样受体家族(nucleotide-binding oligomerization domainlike receptors, NLRs)成员NALP3 (NACHT-LRR-PYD-containing protein3)是模式识别受体成员之一,主要表达于单核／巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞等。已有文献报道,在NASH中, NALP3的表达明显增高,活性增强。敲除其效应蛋白caspase-1后可明显改善NASH。表明ALP3炎性小体在NASH的发生发展中具有十分重要的作用。而NALP3的组装活化及其效应蛋白caspase-1的激活则与活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生密不可分。Kupffer细胞是肝脏内大量ROS的主要来源,其特异性表达的NADPH氧化酶能够快速产生大量ROS以应对机体所受到的损害。有文献报道,MAPKs和NF-κB能够影响NADPH氧化酶的表达活化,对ROS的产生及其下游NALP3的表达及活化发挥重要的调控作用。最近,TIR/BB环拟似物AS-1, AS-1是一种小分子化合物,我们实验室的研究发现,在心脏中,AS-1能够抑制MAPKs信号通路的转导以及NF-κB的活化,对缺血再灌注损伤及压力后负荷诱导的心肌肥大均有一定的保护作用。但在肝脏中,AS-1是否能通过抑制MAPK s和NF-κB来影响NADPH氧化酶和ROS的产生,从而阻断NALP3炎性小体的活化,减少促炎因子的分泌,进而对NASH的发生发展发生作用仍不清楚。为了观察AS-1是否对NASH有改善作用,并阐明其中可能存在的机制,本实验拟采用整体动物实验及体外细胞实验两部分进行。在体实验采用经典的db/db小鼠给予蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine-choline-deficient, MCD)饮食4周构建NASH疾病模型,通过腹腔注射的方法给予AS-1 (25mg/kg/d)。实验分为四个组,分别为：MCS组(对照组)；MCD组(疾病模型组)；MCD+DMSO组(溶剂对照组)以及MCD+AS-1组(药物治疗组),4周后观察各组肝脏大体形态的改变；测量肝脏指数(肝脏湿重／体重)；通过甘油叁酯酶法检测血液及组织中甘油叁酯(Triglyceride, TG)含量；通过油红O染色的方法检测各组脂质沉积的异同；通过检测谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde, MDA)评价各组肝脏损害和氧化应激的程度；通过苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin, H E)及免疫荧光染色的方法检测各组脂质沉积和炎症浸润状况。并提取肝脏组织nRNA及蛋白,通过Quantitative real time-PCR(qRT-PCR)和western blot的方法探讨AS-1对NALP3炎性小体产生的影响及其机制。Kupffer细胞是肝脏中炎症反应的主要效应细胞。为了进一步探讨AS-1调控NASH的机制,我们对体外培养的肝实质细胞给予游离脂肪酸(freefatty acid, FFA)刺激以及对Kupffer细胞给予FFA和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的共同刺激,通过油红O染色及qRT-PCR禾口western blot的方法,观察AS-1对肝实质细胞脂质沉积及Kupffer细胞炎症反应的影响。在体实验结果显示,与MCS对照饮食组相比,给予MCD饮食4周后,db/db小鼠的肝脏明显肿大变黄,体重下降,肝脏指数升高,而给予AS-1则可明显改善MCD饮食诱导的肝脏形态的变化及肝脏指数的升高；肝脏中TG含量检测与油红0染色结果显示MCD饮食诱导了更为严重的脂质沉积,但AS-1对脂质沉积的影响没有统计学意义；血浆中TG含量和FFA含量各组间无明显差异：与MCS对照饮食组相比,MCD饮食的db/db小鼠血浆中ALT含量增加了111.02%(50.99±12.64Vs.107.6±11.92, P<0.05, n=6),而AS-1显着地降低了ALT的水平。苏木素-伊红(HE)染色显示,与MCS对照饮食组相比,MCD饮食组发生了更为严重的脂质沉积和炎症浸润,AS-1则可明显改善MCD诱导的炎症浸润情况。采用免疫荧光和qRT-PCR检测显示,与MCS组相比,MCD组F4/80免疫荧光染色中阳性细胞的数量及mRNA表达水平都有明显的增高,进一步说明了MCD组小鼠肝脏中更为严重的炎症反应。而AS-1能够明显减少F4/80的表达。以上结果表明,AS-1能够有效抑制MCD诱导的NASH的炎症反应,改善肝功能,延缓NASH的进展。给予MCD饮食后,db/db小鼠肝脏中氧化应激损伤严重,qRT-PCR检测显示NADPH氧化酶mRNA水平高表达,脂质过氧化产物MDA含量明显增高,间接说明MCD诱导产生了严重的氧化应激损伤。而同时给予AS-1的db/db小鼠肝脏中NADPH氧化酶表达水平明显下降,MDA含量下降,说明AS-1显着减轻了MCD饮食所诱导的db/db小鼠NASH中氧化应激的程度。Pro-caspase-1活化后裂解为具有活性的两个亚基P10和P20,Western blot结果显示,MCD饮食引起了caspase-1的活化,较之MCS组增加了122.2%(1±0.000Vs.2.22±0.405,P<0.05,n=6)而AS-1抑制了这种活化作用。相应的,比色法检测caspase-1酶活性显示,MCD饮食增强了caspase-1酶活性,而AS-1抑制了caspase-1酶活性的增强。Western blot结果显示,AS-1可显着降低MCD饮食诱导的p38和ERK磷酸化水平的增加。以上结果提示,AS-1可以通过抑制MAPK信号通路,调控NADPH氧化酶的表达影响caspase-1的活化,从而对MCD诱导的NASH发挥一定的保护作用。体外肝实质细胞油红O染色结果显示,FFA导致了肝实质细胞中脂质的蓄积,AS-1对这一过程没有明显的阻断作用。比色法检测caspase-1活性,结果显示FFA和LPS引起了caspase-1的活化,而AS-1抑制了其活化。体外细胞部分实验结果提示,AS-1可能通过阻断FFA引起的Kupffer细胞中caspase-1的活化,对FFA诱导的Kupffer细胞的炎症反应具有一定的调控作用。综合在体及体外两部分实验结果提示,AS-1对MCD诱导的db/db小鼠肝脏及FFA诱导的肝实质细胞脂质沉积无明显影响,对小鼠肝组织的炎细胞浸润及Kupffer细胞的炎症反应具有明显的保护作用,其机制与AS-1能够减轻氧化应激损伤,抑制炎性小体的激活有关。
黄海琇[8]2013年在《非酒精性脂肪性肝病中Kupffer细胞激活方式的研究》文中指出研究背景及目的：近年来,随着社会经济水平的提高,人们生活方式的改变,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已成为我国导致慢性肝病的重要原因之一。NAFLD包括一系列相互联系的病理改变,从单纯性脂肪肝(Nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis, NASH),到肝纤维化、肝硬化,甚至可以进展为肝细胞癌。目前,NAFLD的发病机制尚不明确,随着人们对巨噬细胞在机体免疫及脂质稳态中的作用的了解不断增加,关于Kupffer细胞(Kupffer cells, KCs)与NAFLD发病机制关系的研究逐渐升温。KCs是定居于肝血窦的单核-巨噬细胞,能够在窦实质和脉管腔隙间迁移,在两者间建立联系。已有一些研究表明,在异常情况下,激活的KCs可通过产生多种生物活性介质如细胞因子、趋化因子、蛋白水解酶、ROS和NO等在多种肝损伤中起重要作用。CD4+T细胞可分为Th1和Th2两个亚群,Th1和Th2细胞分泌不同的细胞因子分别刺激KCs向两个方向激活,故相应的KCs存在两种表型,即M1型(经典激活巨噬细胞),M2型(选择性激活巨噬细胞)。M1型由促炎介质激活如IFN-γ,能诱导一些细胞因子释放(如IL-12, IL-6, TNF-α,IL-23)。M2型则被IL-4和IL-13等激活,参于组织的修复、组织纤维化和血管形成等。在NAFLD形成机制中,KCs在经典激活和选择性激活两种状态之间的转换可能影响NFALD的发病,目前尚未见文献做体内研究的扳道。本研究旨在通过体内实验的方法,探索KCs在NAFLD早期的激活方式变化。方法：(1)小鼠非酒精性脂肪性肝病模型构建：将C57BL/6J雄性小鼠分为对照组和高脂模型组,分别饲养4周,8周,12周叁个时间点,同时观察每个阶段小鼠的一般情况,检测血清肝功能指标,并固定部分肝组织做病理切片,留取部分肝组织按TG测定试剂盒说明书步骤测定肝中TG含量。饲养环境明暗各12小时,实验小鼠可自由进食和饮水,4只一笼饲养。(2)小鼠肝脏原代KCs流式分选及评价：小鼠隔夜禁食麻醉后,采用胶原酶原位消化,肝离体后继续消化,细胞悬液以差速离心去除肝实质细胞(HC),非实质细胞通过密度梯度离心获得,KCs通过流式细胞仪,标记CD45-APC和F4/80-PE抗体进行分选纯化,CD45+F4/80+即为KCs。(3) KCs的培养及油红O染色：用DMEM(H)培养基加10%胎牛血清加1%双抗(链霉素+青霉素)培养KCs,24h后吸弃培养基,用PBS轻柔漂洗后加入4%多聚甲醛固定15min,然后用油红稀释液染色15min,60%异丙醇漂洗后用苏木素复染5min,显微镜下观察并拍照。(4) qRT-PCR检测：反应体系为：KCs的cDNA为模板,SYBR Green II为荧光染料,不同基因的引物(内参基因和待测基因),MiX (DNA聚合酶,四种脱氧核苷酸,缓冲溶液,内参染料),设置反应参数条件进行定量PCR,最后分析数据。(5)流式分析对照组和模型组中KCs所占比列及表面标志物CD206：流式分析检测管中加入F4/80-PE和CD206-FITC抗体进行检测。结果：(1)小鼠脂肪肝模型构建：与对照组相比,造模4周病变轻微,8周呈以小泡性为主的混合性脂肪变性,造模12周,肝细胞脂肪变性程度较8周时明显加重,肝细胞表现为大泡性脂肪变性,叁个阶段肝小叶及汇管区都无炎症细胞浸润、肝细胞坏死和纤维化等其他组织学表现。肝中TG的含量随着造模时间延长也逐渐增加。(2)流式细胞术分选KCs：细胞纯度可达95%以上。(3)油红O染色：模型组细胞较对照组细胞变圆,核大,部分细胞核被挤到一侧,呈印戒样改变,胞浆内可见大量红染的脂滴。(4)KCs的M1型和M2型标志物检测结果：M1型标志物TNF-α, IL-6,IL-12b水平显着上调,而M2型的标准物Arg-1, CD206水平显着下调,表明脂肪肝阶段,M1型KCs占优势。(5)流式结果分析：模型组较对照组KCs细胞比例未发生显着变化,而M2型表面标志物CD206表达强度下降,与qRT-PCR结果相符。结论：(1)单纯性脂肪肝阶段KCs并未通过增加数量发挥作用；(2)单纯性脂肪肝阶段KCs形态上发生变化：吞噬大量脂滴,呈现泡沫状；(3)单纯性脂肪肝阶段虽然炎症尚未发生,但KCs表型已呈现M1型优势,可能影响脂肪肝进一步发展。
潘晓莉[9]2014年在《从肝细胞的成脂性改变探讨非酒精性脂肪性肝病的发病机制》文中认为目的：建立高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型,并明确其病理生理变化。方法：选取雄性C57BL/6J小鼠60只,随机分为正常饮食组和进食高脂饲料组(42%脂肪供能),每组30只。持续喂养24周,分别于造模12周、16周、20周和24周各组随机抽取5只动物处死。观察体重、肝脏湿重和肝脏组织学的变化。心脏取血检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、白蛋白(Alb)、甘油叁酯(TG)和空腹血糖(Glu)的变化。SABC免疫组化技术检测小鼠肝组织中CD68的变化。运用RT-PCR技术检测肝组织中c-Jun氨基末端激酶1(JNK1)的表达水平。结果：从12周开始,HE染色显示超过70%的高脂饲养小鼠的肝脏发生了脂肪变,到20周所有高脂饮食组小鼠的肝脏均发生了脂肪变,其肝脏脂肪变的程度未随着喂养时间的延长而明显加重。油红O染色显示高脂饮食组小鼠肝细胞内出现大小不等的橘红色脂滴。从12周开始高脂饮食组小鼠体重、肝脏湿重明显高于正常饮食组小鼠(P<0.05)。高脂小鼠血清ALT、TG和Glu的水平逐渐升高,并从16周开始与正常饮食小鼠相比有显着差异(P<0.05)。而高脂饮食组血清Alb水平逐渐降低。免疫组化染色显示高脂饮食小鼠肝脏组织中CD68的表达较正常饮食组增加。RT-PCR显示在喂养24周后高脂饮食小鼠肝组织中JNKl的表达量是正常饮食组的3-7倍。结论：高脂饮食饲养C57BL/6J小鼠12～24周可成功构建NAFLD模型,该模型的特征为肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗和肝脏脂肪变。高脂饮食能激活肝组织JNK1的表达,诱导和加重肝脏的胰岛素抵抗。目的：研究非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠模型和患者肝穿标本肝脏中脂肪细胞特异性蛋白的表达变化及意义。方法：对高脂饮食造模的雄性C57BL/6J小鼠及正常饮食的同种小鼠分别在12周、16周、20周和24周运用RT-PCR和Western blot技术检测肝脏组织中脂肪细胞标志物的变化：脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(aP2)、过氧化物酶体增殖物激活受体y (PPARγ)、 CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPa)和脂联素(adiponectin)。Western blot技术检测肝脏组织中上皮细胞的标志蛋白E-Cadherin的表达。对16例肝穿病理诊断脂肪肝患者和10例正常肝组织石蜡包埋标本行切片及SABC免疫组化染色检测PPARy的表达定位,并应用免疫荧光双重染色技术明确脂肪细胞标志物aP2在NAFLD患者肝组织中的表达定位。结果：RT-PCR检测发现,高脂饮食组小鼠在喂养24周过程中肝脏aP2和PPARy的表达较正常饮食组小鼠分别增加了2-3倍和4-9倍,Western blot也显示了其同样的变化。而高脂饮食组小鼠肝脏C/EBPa和adiponectin的mRNA表达较正常饮食组小鼠降低,仅C/EBPa在喂养24周时表达较正常饮食组升高约1.4倍,Western blot检测也显示了高脂饮食组C/EBPa和adiponectin蛋白的表达均较正常饮食组降低。肝脏组织中E-Cadherin蛋白的表达在高脂饮食组随着喂养时间的延长逐渐减低。免疫组化染色发现PPARy在NAFLD患者肝脏中表达增加,并主要表达于细胞核内。组织切片免疫荧光双重染色结果显示NAFLD患者肝脏中有aP2表达,并且aP2与白蛋白的表达位置重迭,均出现在肝细胞胞浆内,而白蛋白的表达明显较对照组降低。结论：在高脂饮食小鼠NAFLD模型和NAFLD患者肝脏中,我们发现肝细胞内可表达部分脂肪细胞特异性蛋白,即发生了成脂性改变,而其自身上皮细胞表型和分泌功能均降低。目的：研究原代分离的脂肪变肝细胞对kupffer细胞系RAW264.7活化的影响。方法：在高脂饮食组和正常饮食组均喂养到20周时,利用胶原酶灌流+低速等密度percoll离心法分离培养小鼠原代肝细胞。油红O染色检测肝细胞的脂肪变情况。免疫荧光染色检测肝细胞内脂肪细胞标志物aP2和上皮细胞标志物E-cadherin的变化。原代分离的肝细胞体外培养24小时后,在transwell小室中与6孔板内的kupffer细胞系共培养。共培养48小时后,ELISA法检测细胞上清液中炎症因子TNF-α、MCP-1、 IL-6、IL-18的变化。CFSE染色kupffer细胞及流式细胞术检测其增殖情况。Western blot检测kupffer细胞CD68表达的变化。结果：油红O染色可显示高脂饮食组小鼠原代肝细胞内存在大量橘红色脂滴。免疫荧光双重染色可见高脂饮食组小鼠原代肝细胞内脂肪细胞标志物aP2与白蛋白(Alb)共定位,并且其Alb和E-cadherin的表达均较正常饮食组降低。共培养48小时后,脂肪变肝细胞+kupffer细胞组的细胞上清液中炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-18的表达较其他对照组明显升高(P<0.05),并且脂肪变肝细胞自身也能分泌炎症因子。流式细胞术检测CFSE染色与脂肪变肝细胞共培养的kupffer细胞出现明显增殖。Western blot检测脂肪变肝细胞+kupffer细胞组共培养的kupffer细胞CD68蛋白的表达量较对照组明显升高(P<0.05)。结论：成脂性改变的肝细胞虽然其自身分泌功能和上皮细胞表型被削弱,但是能分泌细胞因子,并能在体外刺激kupffer细胞的活化,促进其增殖,从而共同参与了脂肪性肝炎的发生。
赵海洋[10]2016年在《鼠李糖乳杆菌对酒精性肝病的预防作用及分子机制研究》文中认为酒精性肝病是临床上常见的肝脏疾病,主要是由于长时间大量饮用各种含酒精的饮料所引发的肝脏损害性病变。虽然近年来在酒精性肝病发病的分子机制研究方面取得了突破性的进展,但针对治疗酒精性肝病的有效措施尚有待研究。因此对酒精性肝病的研究日益引起了广泛的关注,是当前急需研究和解决的重要医学课题之一。益生菌具有抑制肠道内革兰氏阴性细菌生长、保护肠上皮细胞的屏障功能,从而阻止内毒素从肠道转移到肝脏,因此国内外研究学者开始把益生菌作为研究预防治疗酒精性肝病的新途径,其中鼠李糖乳杆菌的效果较为显着。相对于其他益生菌来说鼠李糖乳杆菌耐肠道酸性环境的能力较强,具有较强的定植及黏附能力,能够有效地调整肠道菌群结构,改善肠道屏障功能,提高机体免疫力。但鼠李糖乳杆菌治疗酒精性肝病的研究机制及其潜在的应用价值还有待继续深入的发掘。越来越多的研究认为长期饮酒会增加肠道通透性,改变紧密连接以及促使肠道菌群发生异常。本论文旨在研究肠道屏障功能和肠源性内毒素在酒精性肝病中的作用,探讨鼠李糖乳杆菌对于酒精性肝病保护作用的分子机制。本研究首先通过建立8周慢性酒精性肝损伤模型,观察到对照组小鼠在慢性酒精喂养后肝脏脂肪堆积以及肝损伤明显,而喂食含有鼠李糖乳杆菌(LGG)的实验组小鼠显着改善了肝脏脂肪堆积及肝损伤情况。同时LGG能够抑制酒精介导的肠道紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1及Occludin的表达,并增强HIF介导的ITF、HIF-2α的信号途径从而改善酒精引起的肠屏障功能障碍。由于凋亡的益生菌菌体及其代谢物仍具有一定的生理活性,为此本论文利用鼠李糖乳杆菌上清液(LGGs)作为活益生菌的替代物,通过给予雄性C57BL/6N小鼠急性酒精灌胃建立急性酒精性肝损伤模型,研究发现LGGs同样具有改善小鼠肝脏脂肪堆积及肝损伤的作用,并且也同样地抑制酒精介导的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1及Occludin的表达,同时通过增强ITF、Cathelin相关抗菌肽(CRAMP)及HIF-1α、HIF-2α等来改善肠屏障功能障碍。为了进一步证实LGGs对酒精性肝损伤的保护作用,采用Caco-2结肠癌细胞系建立体外肠上皮细胞屏障模型,观察到LGGs对酒精损伤的Caco-2细胞同样具有保护功能,能够改善上皮细胞屏障完整性和通透性。为了进一步研究酒精刺激后肠道紧密连接蛋白的调节机制,本研究通过慢性酒精性肝损伤模型以及Caco-2体外肠上皮细胞屏障模型,观察到LGGs能够有效降低miR122a的表达水平,同时发现酒精介导occludin的表达主要由miR122a调节。通过慢性酒精喂养小鼠4周后观察到肝组织细胞凋亡现象显着增加,而LGGs作用后肝细胞凋亡现象得到明显改善,抗细胞凋亡蛋白Bcl-2在肝脏组织中的表达水平升高,促细胞凋亡蛋白Bax的表达水平降低,进一步证明了 LGGs通过减少肝细胞凋亡改善慢性酒精性脂肪性肝病,进而有效预防慢性酒精引起的肝损伤。本研究通过建立体外细胞模型以及体内动物模型,系统地探讨了鼠李糖乳杆菌在预防和治疗酒精性肝病中的重要作用。深入剖析了其作用机制主要通过增强HIF介导的信号转导,改善肠上皮细胞屏障完整性和通透性,上调miR122a以及抑制肝细胞凋亡等实现的。研究结果一方面为研究酒精及益生菌对肠道完整性、微生态平衡以及内毒素血症的影响提供新的机制,另一方面为临床上治疗酒精性肝病提供更完善的理论依据以及潜在的预防、治疗手段。
参考文献：
[1]. Kupffer细胞在非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用[D]. 徐正婕. 复旦大学. 2003
[2]. 枯否氏细胞在大鼠非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用[J]. 范建高, 钟岚, 王国良, 巫协宁, 李明升. 中华肝脏病杂志. 2001
[3]. NASH肝细胞凋亡与COX-2表达的实验研究[D]. 程琦. 同济大学. 2005
[4]. 内毒素在高糖高脂诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝炎发病机制中的作用[D]. 王文军. 山西医科大学. 2016
[5]. IETM在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用[D]. 赵文慧. 山西医科大学. 2008
[6]. 不同治法方药对大鼠脂肪肝kupffer细胞ERK1/2蛋白活性的影响[D]. 王强. 暨南大学. 2006
[7]. TIR/BB环拟似物AS-1对非酒精性脂肪性肝炎的作用及其机制研究[D]. 高云. 南京医科大学. 2014
[8]. 非酒精性脂肪性肝病中Kupffer细胞激活方式的研究[D]. 黄海琇. 浙江大学. 2013
[9]. 从肝细胞的成脂性改变探讨非酒精性脂肪性肝病的发病机制[D]. 潘晓莉. 华中科技大学. 2014
[10]. 鼠李糖乳杆菌对酒精性肝病的预防作用及分子机制研究[D]. 赵海洋. 南京理工大学. 2016
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