朱光泽[1]2007年在《戊型肝炎流行病学和戊型肝炎病毒全基因克隆与表达研究》文中指出本研究应用酶联连免疫吸附分析法(ELISA)和本课题组建立的免疫捕获多联RT-PCR方法,对吉林省人群和动物群戊型肝炎病毒的血清抗体和HEV RNA进行了检测和分析。克隆猪戊型肝炎病毒吉林分离株Ch-S-1全基因组。并对全长cDNA克隆的表达进行了初步鉴定。对吉林省猪血清HEV抗体阳性率为86.61%(427/493),从猪胆汁中检测到的HEV RNA片断(348 bp)序列分析为基因Ⅳ型。牛、羊、鹿、鸡、马血清HEV抗体阳性率为45.86%(122/266)、7.52%(7/93)、43.61%(348/798)、4.87%(18/369)、15.73%(31/197)。对吉林省人群血清(7,514份)HEV抗体阳性率为22.79%。其中男性阳性率为34.27%、女性阳性率为10.88%。20岁以下人群HEV抗体阳性率低于1.00%。HEV抗体男女抗体阳性率之比为2.64:1。HEV在各年龄段人群中均有流行,在不同职业人群中流行情况不同。从急性戊肝患者血清中检测到HEV RNA(348 bp),序列分析为基因Ⅳ型。设计8对PCR引物分片段扩增猪戊型肝炎病毒长春分离株Ch-S-1全基因,两端采用RACE法扩增,得到HEV Ch-S-1全长基因组(GenBank登录号EF077630) 7,261bp。HEV Ch-S-1全序列与已报道的36株人源和猪源HEV序列比较,其基因结构特征与HEV IV型一致。用质脂体转染法将pBlueScriptⅡKS(-)-HEV体外转录得到的HEV基因组RNA转染至HepG2细胞,并对其克隆的表达进行了初步鉴定。
于水生[2]2008年在《上海地区猪戊型肝炎流行病学调查和基因型分析》文中提出戊型肝炎(Hepatitis E,HE)属于人畜共患病,是由戊型肝炎病毒(Hepatitis Evirus,HEV)引起,该病对人类健康具有很大的危害。HEV在动物宿主中以猪的感染率最高,病毒载量最大,而且从中分离到的病毒和人源毒株也有较高的同源性。因此,摸清猪群中该病的存在状况,对防控人戊型肝炎的发生具有重要的公共卫生学意义。为了能够准确的了解上海地区戊型肝炎在猪群中的流行情况,从上海市10个辖区的40个猪场中采集918份粪便样品,其中444份为首次采集,474份为追踪调查采集。通过nested-PCR的方法,扩增HEV ORF 2的部分片断,通过测序和系统进化分析来研究病毒的存在状况。实验结果表明,918份份样品中的220份样品为HEVRNA阳性,阳性率24%。全过程分析显示各个猪场阳性率在0.0%～75%之间,在36号猪场中同时发现基因3型和基因4型存在,并进行连续追踪调查,结果显示该猪场基因4型在感染中占主导优势。选择部分阳性样品PCR产物,扩增的片断克隆T载体,进行测序。系统进化分析表明,基因4型HEV共有28株,和上海地区从人体内分离到的两株戊肝病毒有很高的同源性。基因3型HEV共有14株,在进化树中,这些病毒株形成一个新的分支,但是和一株日本离株较高的同源性。这说明基因3型在上海分布已经较为广泛,但在以前的研究显示,中国境内猪群中只存在基因4型,因而其来源还需进一步研究。用北京万泰生物药业有限公司提供的动物用HEV总抗体检测试剂盒,采用双抗原夹心法,检测来自上海某猪场的4周龄、8周龄、16周龄和经常母猪血清样品118份,以了解该猪场HEV抗体的存在情况。同时用RT-nPCRA方法检测血清中HEV RNA.结果显示:抗体总阳性率为90.7%(107/118),其中4周龄、8周龄、16周龄和经常母猪抗体阳性率分别为:85.7%(30/35)、88%(32/35)、94%(33/35)、92.3%(12/13)。血清中HEV RNA阳性率为10.2%(12/118)。结果表明该猪场HEV抗体阳性率高,而血清中HEV RNA阳性率较低,并且在较高抗体水平血清中可以检测出HEV RNA阳性。为了进一步了解,HEV不同基因型是否存在混合感染,参照中国流行基因型,设计两套型特异性引物进行扩增,基因4型目的片段为440bp,位于ORFI和ORF2结合处,基因3型目的片段为ORF2内的164bp,发现同一个体内同时存在基因4型和基因3型HEV。其中4型分离株SW-CSH4与中国分离株T21同源性高达94.5%,而与其他基因型HEV-序列比较同源性均在81%以下,属于4a亚型。基因3型分离株SW-CSH3与美国分离株US2同源性高达95.7%,与其他基因3型参考序列同源性均在85%以上,属于3a亚型。
赵慧[3]2009年在《猪戊型肝炎DNA疫苗的构建及免疫效果的初步研究》文中提出目的:构建猪戊型肝炎病毒ORF3基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/ORF3,并在COS-7细胞中进行表达。通过肌肉注射与IL-2联合免疫Balb/C小鼠,检测其产生的免疫应答水平,以期望通过基因疫苗作用使小鼠对戊肝病毒产生免疫防御能力。方法:用PRIMER5.0软件设计引物,PCR扩增ORF3全基因,将PCR产物纯化后插入pcDNA3.1(+)载体,将重组质粒pcDNA3.1(+)/ORF3转化入感受态细胞DH5α进行大量复制。转染COS-7细胞,用免疫细胞化学和Westenrn-Blot验证其在真核细胞得到表达后,将重组质粒pcDNA3.1(+)/ORF3、对照空质粒pcDNA3.1(+)及生理盐水分组通过肌肉注射免疫6周龄Balb/C雌鼠,隔两周免疫一次,共免疫3次,第二周加白介素2辅佐免疫。初免后每隔2周采用ELISA间接法测定小鼠血清中抗ORF3 IgM抗体水平。通过PCR法检测小鼠肌细胞中ORF3基因的存在。结果:成功克隆了ORF3基因,构建了pcDNA3.1(+)/ORF3重组真核表达载体,重组质粒能在COS-7细胞内有效表达目的蛋白。小鼠接种pcDNA3.1(+)/ORP3核酸疫苗后能产生特异性IgM抗体。PCR检测ORF3基因可在小鼠肌细胞中存在。结论:(1)成功克隆了猪戊型肝炎病毒ORF3基因。(2)成功构建了pcDNA3.1(+)/ORF3真核表达载体且其能在真核细胞中表达。(3) pcDNA3.1(+)/ORF3核酸疫苗在小鼠体内可诱导产生免疫应答。(4) pcDNA3.1(+)/ORF3核酸疫苗接种Balb/C小鼠后能在肌细胞中存在。
参考文献：
[1]. 戊型肝炎流行病学和戊型肝炎病毒全基因克隆与表达研究[D]. 朱光泽. 吉林大学. 2007
[2]. 上海地区猪戊型肝炎流行病学调查和基因型分析[D]. 于水生. 南京农业大学. 2008
[3]. 猪戊型肝炎DNA疫苗的构建及免疫效果的初步研究[D]. 赵慧. 上海交通大学. 2009