论文摘要
二盐酸组胺在治疗肿瘤方面具有很大作用。2008年,EpiCept公司将其作为一种免疫调节类药物在欧盟成功上市,其主要用途是与白介素-2联用缓解和防止急性骨髓白血病成人首次缓解治疗后的复发。目前生产组胺主要采用化学合成法,存在高温高压、转化率低、专一性不强和成本高等问题。本研究尝试开发生物催化法这一高效绿色的新兴合成工具,即利用组氨酸脱羧酶（Histidine decarboxylase,HDC）催化L-组氨酸生成组胺,为工业化生产组胺奠定基础。研究首先实现了HDC基因（P.damselae JCM 8968:AB259289）在大肠杆菌中的重组表达。实验结果表明:IPTG诱导浓度对蛋白表达影响不大,但是酶活随着诱导时间的延长而增加,最佳诱导表达时间为20 h。通过对反应温度和pH优化,明确最适反应条件为温度30℃,pH 6.0。为了进一步提高酶活力,减少酶生产成本,成功构建了pACYCDute-1-HDC载体。通过对发酵工艺的优化,培养基中蛋白胨浓度提高至2%,菌浓提高了23.8%。最佳诱导条件:菌浓为1%时,加40μmol/L诱导剂,30℃诱导,检测该酶活为10U/mL（10%菌浓）,成功建立5 L发酵工艺。10%组氨酸（w/w）,2%细胞破碎酶液,9 h转化率达到98.5%。
论文目录
致谢摘要Abstract第1章 文献综述 1.1 组胺的价值及其制备 1.1.1 生物胺的简介 1.1.2 组胺和组胺受体简介 1.1.3 组胺的生理效应 1.1.4 组胺的应用价值 1.1.5 组胺的制备方法 1.2 氨基酸脱羧酶的简介及应用 1.3 组氨酸脱羧酶简介及催化机制 1.4 组氨酸脱羧酶研究现状 1.5 课题研究的目的与意义 1.6 课题研究的内容第2章 组氨酸脱羧酶蛋白的表达及纯化 2.1 引言 2.2 实验材料与仪器 2.2.1 实验质粒和菌株 2.2.2 实验试剂与仪器设备 2.2.3 主要培养基与缓冲液配置 2.3 实验方法 2.3.1 感受态细胞的制备 2.3.2 质粒转化 2.3.3 菌种的培养与保藏 2.3.4 HDC粗酶液的制备 2.3.5 pET-28a-HDC载体的构建 2.3.6 IPTG浓度和诱导时间对HDC表达的影响 2.3.7 HDC蛋白纯化及定量 2.3.8 产物分析方法 2.4 实验结果与讨论 2.4.1 pET-28a-HDC载体构建 2.4.2 HDC蛋白纯化以及蛋白浓度测定 2.4.3 底物L-组氨酸和产物二盐酸组胺液相分析方法建立 2.4.4 诱导剂IPTG浓度和诱导时间对HDC表达的影响 2.5 小结第3章 组氨酸脱羧酶酶学性质分析 3.1 引言 3.2 实验材料与仪器 3.2.1 实验质粒和菌株 3.2.2 实验试剂和仪器 3.2.3 主要培养基与缓冲液配置 3.3 实验方法 3.3.1 菌浓测定 3.3.2 全细胞与粗酶液酶活比较 3.3.3 底物浓度对HDC酶活的影响 3.3.4 HDC最适温度和热稳定性 3.3.5 HDC最适pH和pH稳定性 3.3.6 小试反应体系建立 3.4 实验结果与讨论 3.4.1 全细胞与粗酶液酶活的比较 3.4.2 底物浓度对HDC酶活的影响 3.4.3 最适温度和热稳定性 3.4.4 最适pH和pH稳定性 3.4.5 5%L-组氨酸反应进程 3.5 小结第4章 组氨酸脱羧酶发酵工艺的优化 4.1 引言 4.2 实验材料与仪器 4.2.1 实验质粒和菌株 4.2.2 实验试剂及器材 4.2.3 主要培养基及缓冲液的配置 4.3 实验方法 4.3.1 酶活测定方法的建立 4.3.2 pACYCDuet-Ⅰ-HDC载体构建 4.3.3 HDC发酵培养基成分的优化 4.3.4 pACYCDuet-Ⅰ-HDC重组子表达优化 4.3.5 5L发酵工艺建立 4.3.6 提高底物反应浓度 4.4 实验结果与讨论 4.4.1 构建pACYCDuet-Ⅰ-HDC载体的结果 4.4.2 pACYCDuet-Ⅰ-HDC重组子培养基成分的优化 4.4.3 pACYCDuet-Ⅰ-HDC重组子表达的优化 4.4.4 5L发酵工艺 4.4.5 10%L-组氨酸反应进程 4.5 小结第5章 结论与展望 5.1 结论 5.2 展望参考文献附录 本研究所使用的组氨酸脱羧酶的基因序列信息作者简历及在研究生期间所取得的科研成果
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 周霞
导师: 陈振明
关键词: 组氨酸脱羧酶,组胺,发酵工艺
来源: 杭州师范大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,药学
单位: 杭州师范大学
分类号: R915;Q814
总页数: 62
文件大小: 2368K
下载量: 43
相关论文文献
标签：组氨酸脱羧酶论文; 组胺论文; 发酵工艺论文;
