论文摘要
量子点（Quantum Dots,QDs）是一种半导体纳米晶体,通常由ⅡB-Ⅵ A族元素（如CdTe,CdSe等）或者ⅢA-ⅤA族元素（如InP,GaAs等）组成。QDs为球状或半球状、粒径范围为2nm-100nm之间。对比传统的荧光材料,QDs具有荧光寿命长、光稳定性好、具有窄而对称的发射光谱、发射光谱可根据粒径和组成连续可调、表面修饰后有更好地生物相容性等优秀特点,因而QDs在高灵敏度检测、长时间动态观测、多指标检测等方面都有优异的表现。同时,QDs因其独特的物理学效应及优异的光学特性,在单电子器件、太阳能电池、光电器件等方面被广泛应用。随着QDs应用科学的不断发展,量子点开始更多的进入人们的工作、生活,而人们接触到QDs的机会也不断增加,这也使得人们开始越来越多的关注QDs对于生命体以及环境的潜在危害。QDs的暴露会使机体产生过量的活性氧物质从而导致体内氧化还原平衡被打破,造成DNA和蛋白质的氧化损伤、生物膜损害,从而导致细胞出现凋亡或坏死,因此氧化损伤被认为是多种损伤和疾病的一般机制。目前,QDs的暴露是否会引起实验动物体内的氧化应激水平变化尚存在争议;从分子水平上研究QDs与氧化应激相关生物大分子相互作用机理的报道较少;目前并没有对同一种生物学标志物在不同研究层面或暴露途径下（分子、细胞、动物）的相关性研究。因此,有必要从分子、细胞和动物水平阐明疏基丙酸包被的碲化镉量子点（MPA-CdTe QDs）暴露所诱发的机体氧化应激的相关毒性效应与机理,并对比、结合三个层面上的实验结果整体性的分析了 MPA-CdTe QDs在不同暴露途径下产生不同效应的原因。本文将主要围绕MPA-CdTe QDs诱发机体产生氧化应激从而导致细胞凋亡等毒性效应变化这一重点,以仪器分析为手段、以分子、细胞和动物毒理学为背景,从分子、细胞和动物水平分析MPA-CdTe QDs诱发机体产生氧化应激的作用机理,从而揭示MPA-CdTe QDs暴露损害健康的微观机制。主要研究内容与结果如下:（1）为了阐明MPA-CdTeQDs在实验动物水平上的毒性效应,我们将QDs溶于水后配置成不同浓度的溶液,以饲喂的方式进行小鼠暴露的MPA-CdTeQDs,孵育一段时间后取小鼠肝脏用于本部分实验。首先肝细胞石蜡切片的结果显示,30天的QDs暴露后小鼠肝脏细胞的细胞形态并未发生明显改变。然后我们取量子点孵育120天后的小鼠肝脏,制成细胞悬液后测定肝细胞的细胞活性、活性氧物质（ROS）水平和丙二醛（MDA）水平,来评价量子点暴露于小鼠后对其肝脏细胞的毒性效应,实验结果显示,通过饮水饲喂的方式将MPA-CdTe QDs暴露于小鼠体内后,并未引起小鼠肝脏的细胞活性改变以及相应氧化应激指标的改变。（2）我们以小鼠肝星状细胞、肝脏细胞和肾脏细胞作为研究对象,在体外进行QDs的孵育后,从细胞水平研究MPA-CdTe QDs在小鼠肝细胞和肾细胞内诱发的相关毒性效应与机理。实验结果表明,MPA-CdT QDs的暴露使肝星状产生了激活,细胞由静止型变为激活型,α-SMA和GFAP蛋白表达量增加,这说明MPA-CdTe QDs的暴露对细胞产生了外源刺激,使得肝星状细胞的表现型发生了改变。另外,本文选取QDs暴露后常见的两种靶器官-肝和肾作为研究对象,并在实验中引入了细胞外调节蛋白激酶信号通路（extracellular regulated protein kinases,ERK）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase）凋亡因子的活化情况的检测,来研究MPA-CdTe QDs暴露后诱发细胞内氧化应激、细胞凋亡的效应与机理。实验结果表明,MPA-CdTe QDs的暴露可导致小鼠原代肝细胞和肾细胞活力的显著下降（对比空白组,当实验组量子点浓度达到10×10-6 M后,肝细胞细胞活性由由94.9%降低到83.6%,对于肾细胞细胞活性由92.6%降低到64.1%）以及显著的细胞凋亡情况（对比空白组,实验组量子点浓度达到10×10-6 M时,肝细胞细胞凋亡率由9.3%升高到41.6%,肾细胞细胞凋亡率由1 6.2%升高到69.7%）。相对于肝细胞,肾细胞的细胞活性变化以及凋亡情况对MPA-CdTe QDs的暴露都更加敏感,呈现于更为明显的剂量效应关系。通过凋亡细胞及坏死细胞所占比例的统计结果分析,MPA-CdTeQDs引起的细胞死亡主要是通过细胞凋亡的方式。实验浓度下包被剂MPA的暴露并未引起肝细胞和肾细胞的活性降低,而相对于同浓度的Cd2+而言,MPA-CdTe QDs的暴露引起了肾细胞更为显著的活性降低,这表明量子点引起的细胞毒性不仅仅是其释放的Cd2+造成,MPA-CdTe QDs还会通过其他途径引起细胞活性的降低,我们猜测QDs与其释放的镉离子对细胞造成了联合毒性。MPA-CdTe QDs的暴露导致了细胞内活性氧物质ROS（如O2-·、H2O2等）的产生（对比空白组,实验组量子点浓度增加到10×10-6M时,肝细胞内ROS含量由3.5%增加到52.0%,肾细胞内ROS含量由6.5%增加到32.7%）,在细胞内抗氧化酶的作用下部分ROS被分解,而未被分解的ROS则激活了细胞的ERK信号通路（对比空白组,当实验组量子点浓度达到10×10-6 M后,肝细胞内ERK信号通路活化程度由1.5%升高到40.4%,肾细胞内ERK信号通路活化程度由1.4%升高到11.2%）,从而引起了细胞对于增殖、凋亡等生理过程的调控;同时,ROS的累积也造成了诱发凋亡的关键执行因子Caspases的活化（对比空白组,当实验组量子点浓度达到10×10-6M后,肝细胞内Caspase活化程度由0.92%升高到11.0%,肾细胞内Caspase活化程度由4.0%升高到18.8%）,启动了细胞对于凋亡的调控蛋白酶的级联反应,导致了Caspases靶蛋白的水解、细胞的脂质过氧化、膜蛋白及DNA的氧化损伤等生理过程,细胞的结构和功能发生变化,最终引发了细胞的凋亡。（3）我们以动物体内两种重要的抗氧化酶——过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）以及具有间接抗氧化作用的人绒毛膜促性腺激素和转铁蛋白为研究对象,从分子水平研究MPA-CdTe QDs与相关蛋白反应后对其结构及功能的影响,从而研究分子层面上MPA-CdTe QDs的毒性效应机理。研究结果表明,MPA-CdTe QDs与CAT发生了相互作用,轻微改变了酶的微环境且使其疏水性略有增强;同时,MPA-CdTe QDs改变了 CAT酶活性中心处Heme基团附近的构象,并改变了 CAT的二级结构,使其蛋白骨架变得松散,空间结构发生改变,这可能造成了酶活性中心口袋变大或接近蛋白质外层空间,使CAT与其底物—H2O2的接触面积或接触机会增多,从而导致了过氧化氢酶活性的增强。另一方面,MPA-CdTe QDs与SOD发生了相互作用,轻微改变了酶的微环境且使其疏水性略有增强;同时,MPA-CdTe QDs改变了 SOD的二级结构,使其蛋白骨架变得松散,空间结构发生改变,其酶活性中心附近结构遭到破坏,SOD与其底物的接触面积或接触机会发生改变,因而造成了超氧化物歧化酶活性的变化。结合细胞实验发现,MPA-CdTe QDs在分子水平对两种酶活性的影响与细胞水平造成的影响并不相同:MPA-CdTe QDs暴露后,肝细胞内的CAT活性未产生明显变化而SOD活性则呈现上升趋势;肾细胞内的CAT活性在量子点浓度达到5×10-6 M时呈现显著上升,而SOD的活性则从3×10-6 M时开始便表现出明显下降的趋势。实验结果表明除了与酶分子直接作用影响其活性外,在细胞内还有其他因素影响了两种抗氧化酶的活性,细胞内抗氧化酶活性的变化是一个复杂的生理过程。对于间接抗氧化蛋白,MPA-CdTe QDs虽然没有影响hCG的极性,但MPA-CdTe QDs与hCG发生了相互作用,改变了 hCG的骨架和二级结构,使其蛋白骨架变得松散,空间结构发生改变,并造成其活性中心受到影响,这可能造成了hCG活性的降低。另外,MPA-CdTe QDs与TRF发生了相互作用,MPA-CdTe QDs与TRF的相互作用使得TRF的骨架结构变得松散,二级结构展开,内部疏水区氨基酸残基外翻到外部亲水区域。MPA-CdTe QDs改变了 TRF芳香族氨基酸残基的微环境,使之趋于亲水。最后,我们从细胞水平和分子水平上阐明了 MPA-CdTe QDs暴露诱发DNA损伤的机理。细胞结果表明,在量子点浓度较低时（1×10-6 M）细胞即开始出现DNA损伤（对比空白组,当实验组量子点浓度达到10×10-6M后,肝细胞内DNA损伤程度由4.7%升高到46.3%,肾细胞内DNA损伤程度由27.5%升高到91.6%）;在同浓度量子点暴露时,肾细胞内的DNA损伤程度要高于肝细胞。DNA损伤的结果,与MPA-CdTe QDs造成的细胞脂质过氧化程度的结果相一致,这也说明MPA-CdTe QDs的暴露导致细胞内ROS含量的升高,从而引起了细胞的脂质过氧化反应,对细胞的DNA造成了氧化损伤。另外,抗氧化剂NAC的加入,明显降低了肝细胞和肾细胞内DNA的损伤程度（对于量子点浓度达到10×10-6 M的实验组,加入NAC后肝细胞内DNA损伤程度由46.3%降低到26.7,肾细胞内DNA损伤程度由91.6%降低到40.3%）,这也再次证明了 QDs诱导细胞内产生的ROS是造成DNA损伤的重要原因。此外,本章通过多种光谱学方法、ITC等方法研究了 MPA-CdTeQDs诱发DNA损伤的分子机理,研究表明MPA-CdTeQDs可自发与DNA进行结合,其结合方式为通过疏水作用力结合到DNA的磷酸骨架上,从而改变了 DNA的双螺旋结构。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 郝明路
导师: 刘汝涛
关键词: 氧化应激,毒性效应,抗氧化蛋白,暴露途径
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,环境科学与资源利用
单位: 山东大学
基金: 国家自然科学基金(21477067,21777088),高等学校博士学科点专项科研基金(20130131110016),高等学校科技创新工程重大项目培育资金项目(708058),山东省科技计划项目(2014GSF117027)
分类号: X171.5
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