李新梅[1]2003年在《CML细胞对干扰素-α的反应性及其应答基因的研究》文中研究表明临床研究表明干扰素-α(interferon-alpha，IFN-α)是造血系统恶性肿瘤和淋巴瘤的最有效治疗剂之一。然而,IFN-α仅可使约70％～80％的慢粒白血病(又称慢性髓系白血病，chronic myeloid leukemia，CML)患者获得血液学缓解，IFN-α治疗CML的分子机制和CML患者对IFN-α反应性不同的机制尚未阐明。本课题通过细胞和分子水平比较性研究K562和KT-1／A3两种CML细胞系对IFN-α的不同反应，证实KT-1／A3 CML细胞对IFN-α作用敏感，然后采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization，SSH)分离IFN-α诱导前后的KT-1／A3细胞内差异表达的基因，对这些基因的分析、鉴定将有助于了解IFN-α治疗CML的分子机制。 目的： 通过比较K562和KT-1／A3两种CML细胞系对IFN-α的不同反应性，选用KT-1／A3细胞，采用SSH技术分离IFN-α诱导前后的KT-1／A3细胞内差异表达的基因，为进一步阐明IFN-α治疗CML的分子机制提供直接的实验依据 方法： 1．比较K562和KT-1／A3两种CML细胞系对IFN-α的不同反应性。①采用MTT、半固体集落形成和台盼蓝染色液体培养细胞检测不同浓度IFN-α(100、500、1000、5000和10000IU／ml)对KT-1／A3及K562细胞生长的影响；②IFN-α(1000 IU／ml)诱导KT-1／A3及K562细胞48h后，采用流式细胞分析(FCM)、荧光染色和DNA片段化检测细胞凋亡；③加入IFN-α(1000 IU／ml)培养KT-1／A3及K562细胞48h后，采用相对定量RT-PCR分析bcr／abl基因表达水平。 2．在上述实验的基础上，选用KT-1／A3细胞和IFN-α(1000 IU／ml)诱导KT-1／A3细胞48h，并设对照组，用抑制性削减杂交技术筛选对IFN-α应答的差异性cDNA序列。①分离细胞mRNA，反转录合成cDNA，以IFN-α作用后的KT-1／A3细胞作为检测子，以 未加 IFN－口的 KT上八3细胞作为驱赶于，两组 cDNA都经 Rsa酶 切后，检测子CDNA分两组，与不同接头连接，分别与过量驱赶子， CDNA变性退火杂交，然后合并两组杂交CDNA，重新加入过量的变 性驱赶子CDNA，再次杂交，结果IFN－口诱导组和对照组中基因表 达水平相同的转录子cDNA被杂交消减，而IFN－a诱导表达基因转 录子CDNA被富集，可通过以接头序列为引物的抑制PCR反应扩增， 得到IFN－口诱导应答的差异性。DNA序列，将该差异性CDNA序列与 T／A克隆载体连接后转化大肠杆菌 DHS a，构建 IFN－日诱导差异性 cDNA文库；②通过蓝－白斑和氨芍青霉素（Amp）抗性的双重筛选 后，提取单个的白色克隆质粒，用 ECOR酶切质粒筛选阳性克隆， 再用载体上的Sp6、T7启动子序列为引物，扩增阳性克隆插入片段， 对PCR产物进行双酶切，初步去除重复克隆，筛选出22个不同的 卜性克隆。 3．差异表达基因的鉴定和测序、分析。反向Northern点杂交鉴 定筛选出的 22个不同的阳性克隆，与对照组比较，有 16个阳性克隆 表达上调，测序并与GenBank序列数据库进行同源性比较。 结果： 1．IFN－口呈剂量依赖性（从 100lU／ml 至 10000 I帅l）抑策 KT4八3细胞生长；IFN－口 （100 IU／ml）诱导48h后使 KTl／A3 细胞凋亡率从 3．29％升到 11．8％，并使 KT刁／A3细胞中 her／abl嵌合 基因的表达水平降至对照组的66．7％；IFN－Q对K562细胞的生长、 凋亡及her／abl嵌合基因表达无明显调节效应。 2．将IFNA诱导性表达的cDNA序列克隆入T／A载体后转化 大肠杆菌，筛选获得约80个克隆。利用载体上的酶切位点鉴定得到 50个阳性克隆，片段大小分布于100 ～800hp。 3．反向 Northern点杂交分析确定 16个片段为差异性表达的 CDNA序列。测序后进行同源性检索发现，这些CDNA序列为6个 不同基因的转录产物，大部分基因功能己明确，包括①与细胞增殖 或促进蛋白质合成相关基因，如抑制癌细胞生长的P4762，线粒体 DNA聚合酶合成基因 POLG，参与蛋白质合成起始的 eIF4G；②与 细胞凋亡有关的基因，如 ATP6L，MLC；③未知功能的基因，其作 用有待进一步研究如 FLJ20003。功能上分析这些基因涉及了细胞的 增殖、凋亡、信号转导、蛋白质合成和细胞骨架等几个重要的细胞 生物学代谢反应过程，显示IFN－口在KTl八3细胞中的诱导性基因 二二I的多样性。 结论： 1．不同类型的CML细胞对IFNJ的反应性不同，这些结果为进一步研究IFNA的作用机制提供了直接的实验依据。 2．利用抑制消减杂交技术，从 IFNA诱导前后的 KTl八3细胞的消减CDNA文库中筛选出了部分的IFN－口应答基因，这些基因可能在IFN
苏纪权[2]2007年在《RNAi干扰树突状细胞CD40基因对移植排斥反应影响的体外研究》文中研究说明目的:探讨RNAi (RNA interference)技术沉默树突状细胞CD40基因,建立DC(Dentritic cells)细胞培养及转染方法,对体外脾淋巴细胞的影响,对IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10分泌的影响,为寻求治疗急性移植排斥反应提供基础研究。方法:1.DC细胞培养:培养参照Giannoukakis等报道的方法[Molecular Therapy 2000;1(5):430-437]。从Dark Agouti (DA)供体大鼠股骨中获取的骨髓细胞在含2ml RPMI-1640的24孔培养板(2×106/孔)中培养,其中含抗生素10%(v/v)小牛血清FCS。加入基因重组大鼠GM-CSF(20ng/mL)以扩增未成熟DC。除GM-CSF外,加入基因重组大鼠IL-4 (20 ng/mL)以获得成熟DC。在选定的培养孔,于培养开始时分别加入pSilencer1:U6-CD40 siRNA和pSilencer空白质粒转染细胞,以鉴定siRNA-CD40抑制由IL-4诱导的DC成熟的能力和其抑制DC中CD40基因表达的能力。每2天更换富含细胞因子的培养液;轻微旋动培养板后,吸除一半旧培养液,再加入等量且含细胞因子的新鲜培养液。因此,非贴壁的粒细胞将被清除又可确保那些已生长出的松散地附在弹性帖壁巨嗜细胞单层上的DC细胞簇不被同时移除。10天后收集那些自动从DC细胞簇离开的未帖壁DC。2.大鼠Silencer2.1-U6- siRNA-CD40重组质粒的构建与鉴定(1)siRNA靶位点的选择及编码siRNA DNA模板的体外合成根据GeneBank(AF241231)大鼠CD40基因mRNA的已知序列,寻找符合特征的靶序列,合成分别针对其叁个编码区合成两条DNA寡核苷酸链(分别命名为CD40 -1,-2,-3)并用RNA structure 4.11软件对其二级结构预测,每条模板链的组成包括19个碱基正义链和与其互补的19个碱基的反义链,正反链之间有9个碱基(TTCAAGAGA)间隔,反义链之后有5个T作为转录终止信号,在模板链的两端加入Hind III及BamH I酶切位点。合成两条链在退火缓冲液(100mM K-acetate, 30mM HEPES-KOH pH 7.4, 2 mMMg-acetate)作用下退火(90℃,3min,37℃,1hr),形成双链结构。待连接。(2)pSilencer2.1-U6载体线性化及回收pSilencer?2.1-U6 neo质粒:全长4521bp,含有U6启动子,氨苄抗性,含NEO基因,可由新霉素筛选稳定转染。pEGFP质粒:带有增强绿色荧光蛋白的原核克隆和表达载体,全长3.4kb,含有LacZ启动子,氨苄抗性;同时与Silencer2.1-U6-siRNA重组共转染,估计细胞体系的转染效率。将pSilencer2.1-U6用BamH I及Hind III分别消化,对消化后产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将含有线性化质粒的凝胶在紫外灯下切下,放入1.5ml离心管中,加入3倍体积的融胶液,45℃-55℃水浴5-10min,使胶完全融化,加入10μl玻璃奶(通常1μgDNA用1μl玻璃奶),混匀,45℃-55℃冰水浴5-10min,其间每隔2-3min混匀一次,5,000转/min离心30-60s,弃上清,加入400μl洗液,轻弹管底,5,000转/min离心30s,弃上清,重复上述步骤一次,吸净洗液,室温干燥,加入10-30μl无菌双蒸水,将玻璃奶悬起,45℃-55℃水浴5-10min,10,000转/min离心1-2min,回收上清用λDNA mark做标准品定量,待连接。(3)载体与siRNA模板链连接连接体系中模板与载体的摩尔数比约为3-5:1,充分混匀,加入T4连接酶16℃反应过夜。连接产物可立即转化感受态细胞或于-20℃保存。同时进行空载体自身环化作为阴性对照。(4)感受态细胞的制备与连接产物的转化取-70℃保存的GM109大肠杆菌接种于平板,次日挑取单菌落接种于LB固体培养基中,370C培养过夜。用无菌签挑取单菌落,转到3mlLB液体培养基中,37℃300rpm振荡2h,取1ml菌液接种到100ml LB培养基中,37℃继续培养待OD600大约为0.4时取出,冰浴10min。将菌液转到灭菌的预冷50ml离心管中,4℃4000g离心10min回收细菌,重悬于10mlCaCl2(0.1mol/L)中,冰浴30min , 4℃4000离心10min ,弃上清,加4 ml预冷的CaCl2(0.1mol/L),置于4℃,16h后用于转化试验,或加入甘油至终浓度10%,-70℃保存备用。取100μl的感受态细菌,加入5μl pSilencer2.1-U6与siRNA连接产物,用空载体作对照,轻轻旋转混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速放置冰浴中2min,加入800μl LB培养基(不含Amp),37℃振荡培养60min,吸100μl培养液滴于含Amp的LB平板涂匀,待表面液体吸收后,倒置平皿37℃培养16-20h。(5)阳性重组克隆的筛选(碱裂解法)15,000rpm离心10min,弃上清,加入冰冷的75%乙醇洗一次,离心室温干燥,用含RNase(50μg/ml)的双蒸水10μl充分溶解沉淀。用M13F(-40): 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3' Rev: 5'-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3' primer测序。(6)重组质粒的转染DC细胞用RPMI1640培养基加10%小牛血清37℃,5% CO2培养。用100 ml培养瓶,当贴壁细胞达到80%-90%融合,用无血清培养基洗叁遍,将脂质体15μl加无菌水85μl室温放置10分钟,重组质粒18μg用无菌水加至总体积100μl室温放置10分钟,两者混合室温放置10分钟后加入细胞无血清培养液中,用pEGFP质粒与psilencer1.0-U6-CD40-siRNA按1:20的比例以慢病毒为载体共转染,以标记阳性转染的细胞;空质粒对照用psilencer1.0-U6质粒,另外一组只用脂质体加入培养细胞内;于转染后24-72小时,加G418(新霉素)进行稳定转染阳性克隆筛选,筛选21天后收集细胞,做Western blot分析。3.Western blot测定RNAi干涉后CD40基因在DC中的表达情况裂解RNAi干涉后的DC,用常规Western blot方法检测CD40表达情况。4.单向混合淋巴细胞反应(MLR)采用3HTdR掺入法。刺激物为RNAi干涉后的DC;反应物为Lewis大鼠的脾细胞。最后用自动液闪计数仪测定每分钟脉冲数值。5.通过ELISA的方法检测大鼠淋巴细胞分泌细胞因子的情况。6.统计学分析所得数据以均数±标准差表示,用SPSS软件包(10.0版)进行统计学处理,多组资料均数比较采用F检验,若差异有显着性,则进一步进行q检验。结果:1.成功从大鼠骨髓细胞中体外诱导培养出树突状细胞。2.通过感染含有RNAi序列的慢病毒可以抑制树突状细胞中CD40的表达。3.RNAi沉默后树突状细胞体外活化脾细胞的能力减弱。4.RNAi干涉后的DC活化的淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ的量显著减少结论:应用RNAi技术沉默DC上的CD40,切断第二信号传递使T细胞沉默,不被激活,达到抑制急性免疫排斥反应。
翁开枝[3]2007年在《临床注射用α-干扰素和粒巨—集落刺激因子诱导慢性髓性白血病细胞向树突状细胞分化》文中研究表明目的:研究临床注射用α-干扰素和粒巨-集落刺激因子在诱导慢性髓性白血病细胞向树突状细胞分化过程中的影响,以建立临床适用、稳定的培养体系。方法:取慢性粒细胞白血病患者慢性期的骨髓3～5mL,肝素抗凝,采用Ficoll分离获得骨髓单个核细胞(BMMNCs),分离后取1mL细胞密度为5×106/ mL单个核细胞作为后续杀伤实验的靶细胞,其余用RPMI1640洗4～5次去除血小板,用含10%人血清的RPMI1640调整细胞的密度为3~5×106/mL,接种于24孔培养板中,37℃、5%CO2培养箱中孵育2h后,洗去非贴壁的细胞,收集贴壁的细胞分成A、B两组,分别用含(A)GM-CSF(800U/mL)+IL-4(500U/mL),(B)临床注射用IFN-α(200U/mL)+临床注射用GM-CSF(600ng/mL)的完全培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养,每3d半量换液并补充新鲜的细胞因子,于培养的第5 d, 7~9 d,在倒置显微镜下观察细胞形态,通过流式细胞仪检测其表面标记,全自动血液分析仪分析培养后细胞数量并通过CD83表面标记的百分比计算出DCs数量,采用异基因混合淋巴细胞反应分析检测DCs的免疫刺激功能,用MTT比色法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性杀伤白血病细胞的活性。结果:经不同细胞因子组合分别培养诱导5 d和7~9 d后的细胞,其DCs特征性表面标记(CD80、CD86、HLA-DR、CD83、CD1a)表达率均高于培养前的表达率P<0.05);在培养的第5 d,B组DCs表面标记CD83的表达率(10.51±4.65)%高于A组(7.28±2.95)%(P<0.05);但培养7~9 d后两组表面标记的表达率无明显差异,培养后A、B两组的DCs计数值分别(0.382±0.126)×106/mL与(0.357±0.101)×106/mL,两者也无统计学意义(P<0.05);allo-MLR在DC:T为1:10时B组刺激指数高于A组(P<0.05);DCs能够刺激异体T淋巴细胞产生特异性的CTL。结论:体外CML患者的BMMNCs经临床注射试剂培养后可以分化为具有典型形态、免疫表型和功能的DCs,能够较强地刺激T细胞增殖并能特异性杀伤患者的白血病细胞,为培养更适合回输人体的“临床型”DCs提供新的培养体系。
冯晓荣[4]2007年在《小剂量阿糖胞苷联合干扰素诱导慢性髓细胞白血病细胞分化为树突状细胞的实验研究》文中认为目的自20世纪80年代起α-干扰素(interferon-α，IFN-α)治疗慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)以来，其临床疗效已被公认。并且IFN-α治疗CML达到细胞遗传学缓解的患者较之IFN-α治疗无效者其生存期明显延长。临床观察表明小剂量阿糖胞苷(low dose cytosine arabinoside，LD-Ara-C)联合IFN-α治疗CML患者较单用干扰素疗效更佳，且具有较高的细胞遗传学缓解率。IFN-α治疗CML有效的机制之一是与其增强树突状细胞(dendritic cells，DCs)的表型及功能有关。DC是体内唯一能激活初始型T细胞的抗原递呈细胞，在机体免疫系统中处于中心地位。而LD-Ara-C对急性白血病细胞有诱导分化的作用，那么，LD-Ara-C联合IFN-α治疗CML的有效性优于单用IFN-α是否与诱导CML细胞分化为更成熟DC，从而增强DC功能有关?目前尚无相关报道。为此，本实验拟采用LD-Ara-C联合IFN-α诱导CML骨髓单个核细胞分化为DC，探讨其治疗CML有效的可能机制，为临床治疗提供理论依据。方法Ficoll密度梯度离心法分离初诊未治CML患者骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell，BMMNC)，将所得细胞分别加入不同剂量Ara-C(5ng／ml、10ng／l、25ng／ml、50ng／ml)并以不加Ara-C为对照组，同时加入GM-CSF、IL-4诱导培养7天；倒置显微镜及光镜观察细胞形态；流式细胞仪检测细胞表面特异性标志(CD1a，CD83，CD86，HLA—DR，CD54)；MTT法测其混合淋巴细胞反应能力。结果CML-MNC在培养7d后，细胞聚集成簇，体积明显增大，胞桨丰富，具有树突状突起的细胞多且突起明显；瑞氏-吉姆萨染色光镜下可见细胞膜有明显的刺样突起，核偏在且不规则，部分含有偏心的双核，显示典型树突状细胞形态。流式细胞仪检测表明：DC特征性表面分子(CD1a，CD83，CD86，HLA-DR，CD54)的表达，实验组A和实验组B明显高于单用对照组组，差异有显着性(P＜0.05)；其中实验组A高于实验组B(P＜0.05)，实验组C则大部分细胞死亡，实验组D全部细胞死亡。MLR能力由强到弱分别为：实验组B＞实验组A＞对照组＞实验组C＞实验组D，差异均有显着性(P＜0.05)。结论IFN-α联合LD-Ara-C及细胞因子可以促使CML骨髓源性细胞诱导分化为具有形态和免疫表型特征的DC，促使其特征性表面分子上调，具有较高的MLR能力，其诱导DC形成的能力明显高于单用IFN组。提示LD-Ara-C联合IFN-α治疗CML优于单用IFN-α的机理可能与增强内源性DC功能有关。
参考文献：
[1]. CML细胞对干扰素-α的反应性及其应答基因的研究[D]. 李新梅. 中南大学. 2003
[2]. RNAi干扰树突状细胞CD40基因对移植排斥反应影响的体外研究[D]. 苏纪权. 吉林大学. 2007
[3]. 临床注射用α-干扰素和粒巨—集落刺激因子诱导慢性髓性白血病细胞向树突状细胞分化[D]. 翁开枝. 苏州大学. 2007
[4]. 小剂量阿糖胞苷联合干扰素诱导慢性髓细胞白血病细胞分化为树突状细胞的实验研究[D]. 冯晓荣. 兰州大学. 2007
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