中柳硝酸盐转运蛋白基因的克隆和功能研究

论文摘要

大多数陆生植物以硝酸盐作为主要氮源,硝酸盐既是植物的营养元素,也是调节基因表达、植物生长和发育的重要信号。水稻是农业生产上消耗氮肥最多的作物,提高水稻的氮素利用效率,在保证水稻产量和品质的前提下,减少水稻的氮肥施用,既可以降低水稻种植成本,也可以减少因水体富营养化而引起的环境污染。本研究的主要目的是从速生水生植物中克隆硝酸盐转运蛋白编码基因,将其转入水稻,研究目的基因对水稻氮素利用效率的影响,为实现该目标,主要开展了以下研究:1.速生水生植物的鉴定和筛选测定了21种速生水生植物在水培条件下生物量的增加速度,发现红灯笼、中柳、草皮、日本宫廷草和皇冠生物量增加的速度最快,28 d的时间里湿重分别增加了44%、46%、64%、52%和46%,确定这几种植物是适合开展后继研究的实验材料。2.中柳硝酸盐转运蛋白编码基因的克隆通过同源克隆和Race技术等,从中柳克隆得到2个硝酸盐转运蛋白编码基因,分别是HsNRT1.1-Family-8.1和HsNRT1.1-Family-8.3。HsNRT1.1-Family-8.1基因编码569个氨基酸,与辣椒、烟草、莲藕、大豆、鹰嘴豆、胡桃木和棉花中NRT的相似性最高,分别为81.5%、81.1%、80.0%、78.8%、78.6%、77.9%和77.4%。HsNRT1.1-Family-8.3编码584个氨基酸,与辣椒、烟草、胡桃木、陆地棉、荷花、大豆和茄子的NRT相似性最高,分别85.8%、83.9%、83.4%、83.2%、82.3%、81.2%和81.0%。HsNRT1.1-Family 8.1和HsNRT1.1-Family 8.3是首次从中柳这一物种中克隆得到的NRT基因,将于近期申请专利和Gen Bank登录号。3.HsNRT1.1-Family 8.1和HsNRT1.1-Family 8.3对不同浓度硝酸盐处理的反应以及在不同组织中的表达用不同浓度硝酸盐处理中柳,检测HsNRT1.1-Family 8.1和HsNRT1.1-Family 8.3在根、茎和叶中的表达发现,与低浓度硝酸钾处理组相比,高浓度硝酸钾中,HsNRT1.1-Family 8.1和HsNRT1.1-Family 8.3的表达均显著升高。组织特异性分析发现,无论用低浓度还是高浓度硝酸钾处理,HsNRT1.1-Family 8.1和HsNRT1.1-Family 8.3都主要在根中表达,在表达量上具有“根>茎>叶”的特征。4.利用多形汉逊酵母系统对HsNRT1.1-Family 8.1和HsNRT1.1-Family 8.3的功能进行初步研究。多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）基因组中只有一个硝酸盐转运蛋白编码基因（YNT1）,缺陷型多形汉逊酵母（△ynt）由于缺失该基因,在氮素存在时仍不能正常生长,因此缺陷型多形汉逊酵母可用于快速鉴定克隆基因的编码蛋白是否具有硝酸盐转运蛋白功能、在分类上属于低亲和还是高亲和硝酸盐转运蛋白以及编码蛋白转运硝酸盐功能的强弱。本研究将HsNRT1.1-Family8.1和HsNRT1.1-Family 8.3分别转入缺陷型酵母进行了功能互补实验,发现它们都能使缺陷型酵母的生长速度加快,生长速度基本恢复到WT型酵母水平。这说明它们都具有硝酸盐转运蛋白功能,HsNRT1.1-Family-8.1的Km值为1.27 mmol/L,HsNRT1.1-Family-8.3的Km值1.28 mmol/L,二者都属于低亲和硝酸盐转运蛋白家族。利用该系统,比较我实验室目前克隆的10个硝酸盐转运蛋白:拟南芥At NRT1.1,硅藻Cf NRT1.1、吊兰Cc NRT1.1-8.3.1、吊兰Cc NRT1.1-8.3.2、吊兰Cc NRT1.1-5.2、吊兰Cc NRT1.1-8.1,矮珍珠Ge NRT2.1、矮珍珠Ge NRT1.1,中柳HsNRT1.1-Family-8.1和中柳HsNRT1.1-Family-8.3的功能发现,吊兰Cc NRT1.1-8.1/△ynt重组酵母生长速度最快,进入平台期所需的时间最短,推测该基因编码蛋白具有更强的硝酸盐转运功能。5.HsNRT1.1-Family 8.1和HsNRT1.1-Family 8.3在水稻愈伤组织中的短暂表达为研究目的基因对水稻的影响,分别构建了以ubiquitin启动子驱动目的基因表达的单子叶植物表达载体p Ubiquitin::HsNRT1.1-Family 8.1/CAMBIA3301和p Ubiquitin::HsNRT1.1-Family8.3/CAMBIA3301。利用农杆菌介导法,转化水稻愈伤组织,共培养7 d,检测GUS基因在水稻愈伤组织中的短暂表达发现,转HsNRT1.1-Family 8.1和HsNRT1.1-Family 8.3基因的水稻中均能检测到GUS基因的表达,非转基因对照中无GUS基因的表达。6.实时荧光定量RT-PCR检测HsNRT1.1-Family 8.1和HsNRT1.1-Family 8.3对水稻内源基因的影响利用实时荧光定量RT-PCR研究HsNRT1.1-Family-8.1和HsNRT1.1-Family-8.3在转入水稻愈伤组织中1 d、2 d、3 d、5 d、7 d后,硝酸盐信号通路中靶基因的表达发现,转化HsNRT1.1-Family8.1的水稻愈伤在3d时,水稻内源基因CPSF30、NRG2、TGA1/4、CIPK23、NIA1、NRT2.1和Ni R的表达量分别比对照增加了12.78倍、12.15倍、5.86倍、3.91倍、3.74倍、1.61倍、0.51倍。转化HsNRT1.1-Family 8.3的水稻愈伤在3 d时,水稻内源基因NRG2、NIA1、CIPK23、CPSF30、TGA1/4、NRT2.1和Ni R的表达量分别增加了9.77倍、8.03倍、7.83倍、7.64倍、6.41倍、1.41倍、1.19倍。该结果表明,目的基因转入水稻愈伤组织后,能够诱导水稻硝酸盐信号通路中靶基因的表达,从而参与水稻的氮素利用和硝酸盐信号传导过程。硝酸盐转运蛋白广泛参与NO3-的吸收、运输和细胞内的再分配,水生植物的根系生长环境与水稻相似,从速生水生植物中克隆硝酸盐转运蛋白基因,对利用基因工程手段提高水稻的氮素利用效率,降低水稻的氮肥施用量,保证粮食安全和环境安全具有非常重要的意义。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 谭杰

导师: 刘昱辉

关键词: 硝酸盐转运蛋白,中柳,实时荧光定量,氮素利用效率

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国农业科学院

分类号: Q943.2

总页数: 80

文件大小: 4053K

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