罗瑛[1]2003年在《急性冠脉综合征患者sICAM-1与NF-κB p65活性水平变化关系的研究》文中指出急性冠脉综合征(ACS)的发生与冠脉狭窄程度无关，而与斑块的稳定性和继发血栓形成密切相关。国外研究证实在由斑块破裂所致死亡的急性心肌梗塞患者中，10％-40％破裂斑块不能发现。相反10％-25％未确诊为心脏病患者却发现斑块破裂。但是目前的诊断技术即使是血管造影术也不能够辨认易破裂的粥样斑块。于是人们开始意识到炎症介导的斑块破裂是ACS发生的重要机制，如何通过一些炎性标志物识别和预测ACS是目前研究的热点，最近研究表明一系列炎症标志物可帮助发现高危病人。可溶性细胞间黏附因子(sICAM-1)是较有潜力且研究较多的一种炎性标志物，参与多种炎症及免疫过程，核因子-κB是调控炎性细胞基因表达的主要转录因子，二者均参与急性冠脉综合征发生的病理过程，但二者的关系未见文献报道。本研究试图采用夹心酶联免疫吸附法测定血浆可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)浓度和免疫组化染色测定外周血单核细胞核因子-κBp65(NF-κB p65)阳性率，旨在观察冠心病不同类型患者sICAM-1及其与NF-κB p65活性水平变化的关系，进一步探讨急性冠状动脉综合征临床识别和预测的炎性指标。结果发现急性冠脉综合征(ACS)患者血浆sICAM-1浓度和外周血单核细胞NF-κBp65的阳性率显着高于稳定型心绞痛(SA)组(P＜0.01)和对照组(P＜0.01)，而且sICAM-1浓度与＊＊－。B＊5的阳性率显着正相关（＊O．378，P＜0＊5）。急性冠脉综合征患者血浆SICAMJ浓度的阳性率和外周血单核细胞Wb儿B p65升高，提示其可能与急性冠脉综合征的发生有关，可能是动脉粥样斑块不稳定的标志。血浆SICAM浓度水平升高可能是通过Wb－KB调节途径而实现。
刘会丹[2]2017年在《AML细胞中miR-10a-5p与NF-κB/p65相互关系的研究》文中进行了进一步梳理研究基础:本课题组在前期实验研究中发现mi R-10a-5p表达在急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia,AML)患者中较正常人明显升高;miR-10a-5p表达水平在AML患者不同疾病时期存在动态变化:完全缓解期AML患者的miR-10a-5p表达水平较初治组患者下调,而复发AML患者中mi R-10a-5p表达水平较完全缓解期患者上调;阿霉素耐药细胞株HL-60/ADM与其亲本敏感细胞株HL-60相比,miR-10a-5p表达呈显着升高。同时,在初治组中miR-10a-5p高表达组患者一疗程化疗后的完全缓解率低于miR-10a-5p低表达组。AML患者血清表达mi R-10a-5p水平与骨髓细胞表达miR-10a-5p水平呈正相关;初治AML患者中miR-10a-5p高表达者总生存期较短,提示miR-10a-5p可能是AML不良预后的评估分子。研究目的:大量的研究表明在血液系统疾病中,有大量的微小RNA表达异常,部分微小RNA表达异常与NF-κB通路表达异常相关。结合本课题组前期研究结果及NF-κB/p65相关研究结论,本课题进一步研究急性髓系白血病细胞中miR-10a-5p与NF-κB/p65的相互关系,探索miR-10a-5p表达是否可能受NF-κB/p65的活化调控,并讨论其临床意义。方法:2015年1月至2015年10月在我院血液科住院治疗的AML患者,均符合国内AML诊断标准,收集9例患者的骨髓细胞(2例为初治白血病,3例为复发难治白血病,4例为化疗中未缓解的白血病患者;1例为女性患者,8例为男性患者),本研究所有对象或其监护人均签署知情同意书。收集骨髓后,提取单个核细胞,流式细胞仪分选出CD34阳性细胞,进行培养,培养后的细胞,一部分直接检测CD34阳性细胞中的miR-10a-5p的浓度;另一部分用于实验。具体方法为:一部分细胞利用p65活性检测试剂盒检测AML的CD34阳性细胞中NF-κB/p65的活性随着NF-κB/p65激动剂TNF-α浓度及时间改变的变化;并且以NF-κB/p65的抑制剂SN50作用于TNF--α作用后的CD34阳性细胞后再次检测其NF-κB/p65活性的变化;并用QT-PCR法同步检测细胞miR-10a-5p浓度的变化,观察在NF-κB/p65的激动剂TNF-α和抑制剂SN50作用下,AML患者CD34阳性细胞表达NF-κB/p65和miR-10a-5p水平的变化。结果:经过培养后,检测发现miR-10a-5p在AML患者的CD34阳性细胞中较阴性细胞明显高表达;体外AMLCD34阳性细胞,随着TNF-α浓度的增加,检测到NF-κB/p65活性和mi R-10a-5p表达的增加;随着TNF-α作用时间的延长NF-κB/p65活性在第48小时时达到高峰,miR-10a-5p表达在第72小时时达到高峰,miR-10a-5p的表达高峰在NF-κB/p65之后;利用SN50抑制NF-κB通路后,检测到NF-κB/p65和miR-10a-5p的表达都被抑制。结论:AML患者体内中miR-10a-5p的异常表达可能与NF-κB/p65通路调节有关。
李卡[3]2017年在《DNA-PKcs对CD133阳性骨肉瘤细胞顺铂耐药性和骨肉瘤转移的作用及机制研究》文中提出第一部分 DNA-PKcs在骨肉瘤细胞和组织中的表达及其临床意义研究背景骨肉瘤是起源于恶性间充质细胞,以产生骨或骨样组织为特点的恶性肿瘤,是儿童和青少年中最常见的原发恶性骨肿瘤,发病率为4～5/100万。虽然接受手术结合化学治疗的骨肉瘤患者5年生存率可以达到50%-70%,然而近30年来,骨肉瘤患者的5年生存率无明显提高,而且已发生转移的患者5年生存率仅为20%-30%。因此,探索骨肉瘤发生和发展的机制,对改善治疗效果、提高患者生存率具有重要意义,具有一定的研究价值。DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)是磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PIKK)家族成员之一,它与异源二聚体复合物Ku70和Ku80共同组成DNA依赖性蛋白激酶复合体(DNA-PK),主要通过非同源末端连接(NHEJ)的方式进行DNA双链断裂的修复,在维持基因组稳定中发挥着重要作用。除此之外,研究发现DNA-PKcs在人类细胞的功能活动中还发挥着诸多其他的生物学功能,如维持染色体端粒稳定、调节能量代谢、促进有丝分裂等。在多种恶性肿瘤中,DNA-PKcs的基因、蛋白表达水平或酶活性明显偏高,且与患者预后相关。但是,目前有关DNA-PKcs在骨肉瘤中的表达情况及其临床意义的研究较少,因此我们拟以骨肉瘤细胞和骨肉瘤组织为研究对象,探索DNA-PKcs在骨肉瘤中的表达及其临床意义。研究目的研究DNA-PKcs在骨肉瘤细胞和组织中的表达情况,及其表达与骨肉瘤临床特征的相关性,为后续研究DNA-PKcs在骨肉瘤中的生物学功能及其机制提供理论基础。研究方法1.采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot)方法分别检测人成骨细胞(hFOB 1.19)和人骨肉瘤细胞(MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2)中DNA-PKcs的mRNA和蛋白表达情况。2.采用细胞免疫荧光技术分别检测hFOB1.19细胞和MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2四种人骨肉瘤细胞中DNA-PKcs蛋白的表达位置和表达量。3.采用免疫组织化学方法分别检测骨软骨瘤、骨肉瘤组织中DNA-PKcs蛋白表达情况,并分析骨肉瘤组织中DNA-PKcs蛋白表达与对应标本临床特征(性别、年龄、肿瘤部位、Enneking分期)的相关性。研究结果1.qRT-PCR和Western Blot结果显示,DNA-PKcs在四种人骨肉瘤细胞(MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2)中均有表达,而且其mRNA和蛋白在人骨肉瘤细胞中的表达水平均明显高于在人成骨细胞(hFOB 1.19)中的表达水平(P<0.05)。2.细胞免疫荧光结果显示,DNA-PKcs蛋白主要在人骨肉瘤细胞(MNNG/HOS、MG-63、U2-OS、Saos-2)的核内表达,且比在 hFOB 1.19 细胞中的表达水平高。3.骨肉瘤组织中DNA-PKcs蛋白的阳性表达率显着高于骨软骨瘤组织(70.83%vs 5.00%,P<0.05),且 DNA-PKcs 蛋白在骨肉瘤中的表达与 Enneking分期具有相关性,EnnekingⅢ期标本中DNA-PKcs蛋白阳性表达率显着高于EnnekingⅡ期标本(P<0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤部位无关(P>0.05)。结论1.骨肉瘤细胞中DNA-PKcs的基因和蛋白水平高于人成骨细胞,DNA-PKcs蛋白主要在骨肉瘤细胞核内表达。2.骨肉瘤组织中DNA-PKcs蛋白的阳性表达率显着高于骨软骨瘤,且DNA-PKcs蛋白的表达与骨肉瘤的Enneking分期相关。第二部分 DNA-PKcs在CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药性中的作用及其分子机制研究背景自辅助化疗应用到骨肉瘤治疗以来,骨肉瘤患者5年生存率已提高到50%-70%,然而近30年来,骨肉瘤的治疗效果已进入平台期。其中,化疗耐药是阻碍骨肉瘤治疗效果进一步提高的重要原因,因此有必要对骨肉瘤化疗耐药发生的机制展开进一步的研究。在有关恶性肿瘤耐药的研究中,肿瘤干细胞理论受到人们越来越多的关注,该理论认为肿瘤干细胞除具有干细胞的一般生物学特性外,还具有更强的化学药物耐受性,在恶性肿瘤耐药中发挥着重要作用。现研究表明,骨肉瘤中CD133阳性细胞具有自我更新、多向分化、成瘤等肿瘤干细胞的生物学特性,且对化疗药物具有更强的耐受性。但是,目前对CD133阳性骨肉瘤细胞的耐药机制仍缺乏更为深入的研究。DNA-PKcs的DNA损伤修复功能已被大量研究证明,它与异源二聚体复合物Ku70和Ku80共同参与,通过非同源末端连接的方式参与DNA双链断裂的修复。研究发现,DNA-PKcs可通过DNA损伤修复促进肿瘤细胞对化疗药物的抵抗,且DNA-PKcs在骨肉瘤肿瘤干细胞中高表达,因此DNA-PKcs是否可以通过DNA损伤修复导致骨肉瘤肿瘤干细胞耐药,值得研究。P-糖蛋白(P-gp)是ATP结合盒(ABC)膜转运蛋白家族中的重要成员,可通过药物泵出功能降低细胞内药物浓度,增强肿瘤细胞对化疗药物的耐受性,而且它在骨肉瘤肿瘤干细胞中的表达明显高于在非肿瘤干细胞中的表达。尽管DNA-PKcs和P-gp在肿瘤耐药中都发挥着重要作用,且均在骨肉瘤肿瘤干细胞中高表达,但是有关DNA-PKcs是否可以通过调节P-gp的表达在骨肉瘤肿瘤干细胞耐药中发挥作用的研究还未见报道。另外,PI3K/Akt信号通路中活化的Akt可作用于核因子κB抑制蛋白激酶(IKK),进而降解核因子κB抑制蛋白(IκB),使核因子κB(NF-κB)进入细胞核内发挥功能。研究表明,NF-κB能够激活P-gp编码基因的启动子,促进基因的转录。因此我们推测,DNA-PKcs作为PI3K相关激酶(PIKK)家族中的一员,或许可以通过Akt/NF-K信号通路调节P-gp的表达,从而增强骨肉瘤肿瘤干细胞的耐药性。在该部分研究中,我们拟以CD133阳性MG-63细胞为研究对象,探索DNA-PKcs在骨肉瘤肿瘤干细胞顺铂耐药性中的作用及其分子机制。研究目的1.研究DNA-PKcs在CD133阳性骨肉瘤细胞顺铂耐药中的作用。2.研究DNA-PKcs是否可以通过DNA损伤修复或调节P-gp的表达而影响CD133阳性骨肉瘤细胞顺铂耐药性。研究方法1.采用免疫磁珠分选的方法获取CD133阳性和阴性MG-63细胞,对比检测其对顺铂的耐受能力、DNA-PKcs的基因和蛋白表达情况;小干扰RNA(siRNA)下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后,检测细胞顺铂耐药性的变化,以说明DNA-PKcs在CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药中的作用。2.顺铂作用后,对比检测CD133阳性和阴性MG-63细胞DNA损伤情况;siRNA下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后,检测顺铂作用后DNA损伤的变化情况,以说明DNA-PKcs在CD133阳性MG-63细胞DNA损伤修复中的作用。3.分别检测CD133阳性和阴性MG-63细胞中P-gp的基因和蛋白表达情况;采用P-gp抑制剂作用于CD133阳性MG-63细胞后,检测细胞顺铂耐药性的变化,以说明P-gp在CD 133阳性MG-63细胞顺铂耐药中的作用。4.下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后,检测P-gp基因和蛋白水平的变化,以说明CD 133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs对P-gp表达的影响。5.对比检测Akt/NF-KB信号通路在CD133阳性和阴性MG-63细胞中的活性;采用抑制Akt活性或下调NF-κB表达的方法抑制Akt/NF-KB信号通路的活性后,检测P-gp基因和蛋白水平的变化,以说明CD133阳性MG-63细胞中Akt/NF-KB信号通路对P-gp表达的影响。6.下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后,检测Akt/NF-KB信号通路活性的变化,以说明CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs对Akt/NF-KB信号通路活性的影响。研究结果1.与CD133阴性MG-63细胞相比,CD133阳性MG-63细胞对顺铂具有更强的耐药性且DNA-PKcs mRNA和蛋白均高表达。然而,下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后,细胞对顺铂的耐受性降低。该结果说明,DNA-PKcs在CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药中发挥着促进作用。2.与CD133阴性MG-63细胞相比,CD133阳性MG-63细胞在接受顺铂作用后产生的DNA双链断裂较少。但是,下调DNA-PKcs的表达后,CD133阳性MG-63细胞DNA损伤修复能力降低,接受顺铂作用后DNA双链断裂增加。以上结果说明,DNA-PKcs可通过DNA损伤修复增强CD133阳性MG-63细胞的顺铂耐药性。3.与CD133阴性MG-63细胞相比,CD133阳性MG-63细胞中P-gp mRNA和蛋白均高表达;抑制P-gp作用后,CD133阳性MG-63细胞的顺铂耐药性显着降低。该结果说明,P-gp具有增强CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药性的作用。4.下调CD133阳性MG-63细胞中DNA-PKcs的表达后,P-gp mRNA和蛋白表达水平均降低,即DNA-PKcs参与P-gp的表达。5.与CD133阴性MG-63细胞相比,Akt/NF-κB信号通路在CD133阳性MG-63细胞中处于活化状态;抑制Akt/NF-κB信号通路可以降低CD133阳性MG-63细胞中P-gp的基因和蛋白水平;下调DNA-PKcs可以降低CD133阳性MG-63细胞中Akt/NF-KB信号通路活性。以上结果说明,DNA-PKcs可以通过Akt/NF-KB信号通路调节P-gp的表达,从而增强CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药性。结论1.DNA-PKcs在CD133阳性MG-63细胞中高表达且具有增强细胞顺铂耐药性的作用。2.DNA-PKcs可以通过DNA损伤修复和经Akt/NF-κB信号通路调节P-gp的表达,发挥增强CD133阳性MG-63细胞顺铂耐药性的作用。第叁部分 DNA-PKcs在骨肉瘤转移中的作用及其分子机制研究背景骨肉瘤具有较高的转移发生率,最常见的转移部位为肺脏,远处转移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。发生转移的骨肉瘤患者预后较差,据统计,已发生远处转移的患者5年生存率仅为20%-30%。因此,有必要对骨肉瘤转移的发生和发展机制进行研究,以减少远处转移的发生、提高患者生存率。DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)作为磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PIKK)家族成员之一,可以通过调节下游靶基因的转录,参与细胞的生存、炎性反应、代谢调节、细胞凋亡和细胞周期等多种功能活动。研究表明DNA-PKcs在多种恶性肿瘤中高表达且与预后相关,而且在论文第一部分中我们也发现DNA-PKcs在骨肉瘤中高表达且与Enneking外科分期相关。但是,目前能够明确证明DNA-PKcs在肿瘤转移中的作用研究甚少,且尚无有关DNA-PKcs与骨肉瘤转移之间关系的报道。在该部分中,我们将探索DNA-PKcs在骨肉瘤转移中的作用。另外,基质金属蛋白酶2(MMP2)和磷酸化的肌球蛋白轻链2(p-MLC2)分别可以通过降解细胞外基质和增强肌动蛋白-肌球蛋白收缩,直接影响细胞的运动能力,而且研究发现MMP2和p-MLC2的表达均与Rho/ROCK信号通路有一定关系。因此,我们推测DNA-PKcs或许可以通过Rho/ROCK信号通路调节MMP2和p-MLC2的表达,从而在骨肉瘤转移中发挥作用。在该部分研究中,我们拟以骨肉瘤细胞为研究对象,通过体外和体内实验探索DNA-PKcs在骨肉瘤转移中的作用及其分子机制,从而为针对DNA-PKcs的靶向治疗在骨肉瘤转移治疗中的应用提供一定的理论基础。研究目的1.研究DNA-PKcs对骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭能力、体内转移瘤形成和发展的影响。2.研究DNA-PKcs是否可以通过Rho/ROCK信号通路调节MMP2和p-MLC2的表达,从而在骨肉瘤转移中发挥作用。研究方法1.采用DNA-PKcs特异性抑制剂NU7026作用于骨肉瘤细胞(MNNG/HOS细胞、MG-63细胞、Saos-2细胞、U2-OS细胞,下同)后,采用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验检测骨肉瘤细胞迁移能力的变化,采用Transwell细胞侵袭实验检测骨肉瘤细胞侵袭能力的变化,以说明DNA-PKcs在骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭中的作用。2.采用DNA-PKcs siRNA慢病毒载体感染骨肉瘤细胞后,荧光显微镜下观察病毒感染效率,并采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot)实验分别检测DNA-PKcs mRNA和蛋白水平的变化情况,以评价siRNA的沉默效果。3.采用DNA-PKcs siRNA慢病毒载体感染骨肉瘤细胞,下调DNA-PKcs表达后,Western Blot检测细胞中MMP2和p-MLC2蛋白水平的变化,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞上清中MMP2分泌的变化,以说明DNA-PKcs对MMP2和P-MLC2表达的调节作用。4.下调DNA-PKcs表达后,检测骨肉瘤细胞中具有生物活性的RhoA-GTP酶表达水平的变化,采用qRT-PCR和Western Blot分别检测骨肉瘤细胞中ROCK 1、ROCK2的基因和蛋白表达水平的变化,以说明DNA-PKcs对RhoA/ROCK信号通路的调节作用。5.采用ROCK2特异性抑制剂SLx-2119作用于骨肉瘤细胞后,同样采用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力的变化,采用Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化,以说明RhoA/ROCK2信号通路在骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭中的作用。6.在骨肉瘤细胞中,采用脂质体转染siRNA下调ROCK2表达后,Western Blot检测细胞内MMP2和p-MLC2蛋白水平的变化,ELISA检测细胞上清中MMP2分泌的变化,以说明RhoA/ROCK2信号通路对MMP2和p-MLC2表达的调节作用。7.将阴性对照siRNA和DNA-PKcs siRNA慢病毒载体分别稳定感染MNNG/HOS细胞后,经尾静脉注入NOD/SCID小鼠体内,建立骨肉瘤转移模型,继续饲养,并观察、记录小鼠一般生长情况,10周后对比两组小鼠体内转移病灶形成率、转移病灶体积。研究结果1.DNA-PKcs抑制剂NU7026作用于骨肉瘤细胞后,细胞的迁移和侵袭能力明显降低,与阴性对照组相比,具有统计学差异(P<0.05),说明DNA-PKcs具有促进骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭的作用。2.按照合适的MOI值,DNA-PKcs siRNA慢病毒载体感染四种骨肉瘤细胞,感染效率均可达80%以上。qRT-PCR和Western Blot结果显示,与感染阴性对照siRNA慢病毒载体的细胞相比,感染DNA-PKcs siRNA慢病毒载体的骨肉瘤细胞中DNA-PKcs mRNA和蛋白水平均显着降低(P<0.05),DNA-PKcs基因沉默效果满意。3.下调DNA-PKcs表达后,骨肉瘤细胞中MMP2和p-MLC2蛋白白表达水平显着降低,细胞上清中MMP2的分泌量显着减少(P<0.05),说明DNA-PKcs可以通过调节MMP2和p-MLC2的表达参与骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭。4.下调DNA-PKcs表达后,具有活性的RhoA-GTP酶表达降低,H.ROCK2在mRNA和蛋白水平均有下降,与阴性对照组相比,具有统计学差异(P＜0.05),说明DNA-PKcs对RhoA/ROCK2信号通路具有调节作用。5.采用ROCK2抑制剂SLx-2119作用于骨肉瘤细胞后,细胞体外迁移和侵袭能力均显着降低(P<0.05);siRNA下调ROCK2表达后,细胞中MMP2和P-MLC2蛋白的表达显着降低,细胞上清中MMP2的分泌量显着减少(P＜0.05)。该结果说明,RhoA/ROCK2信号通路可以通过MMP2和p-MLC2促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。6.与阴性对照siRNA慢病毒载体感染的MNNG/HOS细胞相比,DNA-PKcs siRNA慢病毒载体感染的MNNG/HOS细胞在NOD/SCID小鼠体内形成的转移病灶数量明显减少,且肿瘤平均体积减小,两组相比具有统计学差异(P<0.05)。该结果表明,DNA-PKcs具有促进骨肉瘤体内转移形成和发展的作用。结论1.DNA-PKcs具有促进骨肉瘤细胞体外迁移和侵袭、体内转移瘤形成和发展的作用。2.DNA-PKcs可以通过RhoA/ROCK2信号通路调节MMP2和p-MLC2的表达,促进骨肉瘤细胞转移。
罗瑛, 谢秀梅, 刘惠霞[4]2004年在《阿伐他汀对急性冠状动脉综合征患者NF-κB和可溶性细胞间黏附因子-1的影响》文中指出目的 :探讨阿伐他汀对急性冠状动脉综合征 (ACS)患者治疗后核因子 κBp6 5 (NF κBp6 5 )阳性率和可溶性细胞间黏附因子 1(sICAM 1)浓度的影响及其临床意义。方法 :6 8例ACS患者随机分成阿伐他汀治疗组(阿伐他汀组 ,37例 )及常规治疗组 (常规组 ,31例 ) ,治疗前及治疗 12周后采用夹心酶联免疫吸附法 (ELISA法 )测定血浆sICAM 1浓度和免疫组织化学染色法测定外周血单核细胞NF κBp6 5阳性率 ,比较两者的变化。结果 :治疗前两组比较NF κBp6 5阳性率和sICAM 1浓度水平差异无显着性 (P >0 .0 5 ) ;治疗 12周后 ,常规治疗组NF κBp6 5阳性率和sICAM 1浓度水平前后差异无显着性 (P >0 .0 5 ) ;而阿伐他汀组NF κBp6 5阳性率和sICAM 1浓度水平治疗后明显低于治疗前 (P <0 .0 5 )。结论 :阿伐他汀对ACS患者有抗炎和稳定粥样斑块作用 ,其作用可能与降低NF κB活性和sICAM 1浓度水平有关
王坛[5]2016年在《饲用溶菌酶在吉富罗非鱼体内吸收利用机制的研究》文中认为溶菌酶是动植物界中广泛存在的一种天然活性物质,因其独特的抗菌和调理功能而被应用于动物生产、食品防腐以及医药制剂等诸多领域。其中,溶菌酶作为一种新型绿色的饲料添加剂在畜禽动物上的研究已久,但在水产动物上的应用研究仍较为薄弱,仅见于异育银鲫(Carassius auratus gibelio)和草鱼(Ctenopharyngodon idellus)。在现有的研究结果中我们发现溶菌酶的作用效果并不完全一致,可能在于鱼的种属和消化道内环境不同,使溶菌酶进入鱼体内后的活性发挥和吸收利用存在差异性,最终导致其利用效果的不同。为此,我们选用吉富罗非鱼(GIFT,Oreochromis niloticus)为本次研究对象,开展溶菌酶作用效果和吸收利用机制的研究,为提高饲用溶菌酶的利用率及其在水产饲料中的合理应用提供参考。内容主要包括六章:第一章通过研究在饲料中添加溶菌酶后对吉富罗非鱼生长、免疫–抗氧化能力和血清抗菌性能的影响,综合评估在正常养殖条件下溶菌酶在吉富罗非鱼饲料中的最适添加量;第二章设计氨氮应激试验,从血清生化、抗菌性能和肝脏抗氧化能力方面评估不同溶菌酶添加水平对吉富罗非鱼抗氨氮应激能力的影响,为溶菌酶在应激条件下的使用提供参考剂量;第叁章从消化生理方面探究不同溶菌酶添加水平对吉富罗非鱼消化道组织结构及营养物质消化吸收的影响,深入解析溶菌酶与罗非鱼生长之间的内在关系;第四章探究外源性溶菌酶的添加对吉富罗非鱼内源c型溶菌酶和NF–κB基因表达的影响,以期从分子水平寻找外源溶菌酶与内源免疫基因和其调控通路中关键基因之间的相互联系,解析溶菌酶的添加对吉富罗非鱼免疫机能的影响;第五章根据前期研究结果设计四个溶菌酶添加水平下的胃排空试验,根据胃排空时间和消化道(包括内容物)内环境的变化探究添加不同水平的溶菌酶对罗非鱼消化生理上的影响规律;第六章采用体内外试验结合法,通过测定饲用溶菌酶对罗非鱼肝脏和胃肠道各部位的耐受性以及运用FITC–lysozyme体内示踪技术来探索溶菌酶在鱼体内主要部位的吸收代谢规律,从而得出其在吉富罗非鱼体内的适宜作用部位和功效发挥时间。试验一:饲料中添加溶菌酶对吉富罗非鱼生长、免疫–抗氧化功能及血清抗菌性能的影响为探究正常养殖条件下溶菌酶在吉富罗非鱼(11.35±0.08)g饲料中的最适添加量,设置6个溶菌酶添加水平的试验饲料,分别在基础组饲料中添加0(l0)、18(l18)、36(l36)、54(l54)、72(l72)和90(l90)mg/kg的溶菌酶制品(5×103u/mg),在室外水泥池中的等大尼龙网箱中饲喂吉富罗非鱼60d,考察不同溶菌酶添加水平对吉富罗非鱼生长、免疫–抗氧化能力和血清抗菌性能的影响。结果表明:(1)54mg/kg溶菌酶添加组鱼的生长性能和饲料利用情况最优,增重率和蛋白质效率均显着高于对照组,饲料系数显着低于对照组(p<0.05);肝体比随溶菌酶添加水平的增加呈现下降趋势,90mg/kg添加组显着低于对照组(p<0.05);脾脏指数在36和54mg/kg添加组显着低于对照组(p<0.05);全鱼粗蛋白和粗灰分含量在54mg/kg添加组均呈现较高水平,显着高于对照组(p<0.05)。(2)溶菌酶添加水平对罗非鱼的免疫–抗氧化能力产生影响,54和72mg/kg添加水平能显着提高鱼体血清和肝脏的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性,降低丙二醛含量(p<0.05);肝脏溶菌酶活性在54和72mg/kg添加组均显着高于对照组(p<0.05),而血清溶菌酶活性随溶菌酶添加水平的增加呈现下降趋势(l90组除外),显着低于对照组(p<0.05)。(3)血清抗菌试验显示,54和72mg/kg溶菌酶添加组罗非鱼对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和溶藻弧菌的抑制能力显着高于对照组(p<0.05),而对枯草芽孢杆菌的抵抗能力最低,比对照组分别低34.71%和42.21%(p<0.05)。综上所述,在吉富罗非鱼饲料中添加54mg/kg溶菌酶制品可改善其生长性能;当添加水平为54和72mg/kg时,罗非鱼的免疫-抗氧化能力和血清抗菌性能均得到了显着提高。本试验条件下,适宜添加量为54和72mg/kg。试验二:饲料溶菌酶添加水平对氨氮应激下吉富罗非鱼血清生化指标、抗菌性能和肝脏抗氧化能力的影响为探究溶菌酶对吉富罗非鱼抗氨氮应激能力的影响并确定非正常情况下的适宜添加量,本试验以养殖试验结束后的吉富罗非鱼(83.74±3.02)g为研究对象,以氯化铵为应激源,并调整水体总氨氮(t–an)的表观浓度为50mg/l,进行24h急性氨氮胁迫,通过比较各组鱼的血清生化指标、抗菌活性和肝脏抗氧化指标来综合判断其抗氨氮应激能力并由此确定溶菌酶在特定条件的适宜添加量。结果表明:(1)应激后,各组鱼的血清生化指标在组间存在较大差异(p<0.05),不同溶菌酶添加水平下的鱼体对氨氮应激产生了不同的响应机制。l54组鱼主要通过激发免疫系统并调节蛋白质代谢来抵抗氨氮浓度突变;l72和l90组鱼主要通过调节高密度脂蛋白和低密度脂蛋白、胆固醇和甘油叁酯之间的动态变化来缓解氨氮对机体的应激。(2)血清抗菌试验表明,l54和l72组鱼对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌的抑制能力最大,且显着高于对照组(p<0.05);l36~l90组对溶藻弧菌的抑制作用显着高于对照组和l18组(p<0.05);各溶菌酶添加组的鱼对枯草芽孢杆菌具有不同程度的保护作用。(3)应激后肝脏的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性随溶菌酶添加水平的增加总体呈现先升后降的变化趋势,l54组显着高于对照组(p<0.05);各添加组丙二醛含量均显着低于对照组(p<0.05)。综上所述,54和72mg/kg溶菌酶添加水平对氨氮应激下吉富罗非鱼的血清生化指标、抗菌活性和肝脏抗氧化指标产生了最积极有效的调控,能够增强鱼体的抗应激能力,此添加水平为氨氮应激条件下的适宜添加量。试验叁:饲料溶菌酶添加水平对吉富罗非鱼消化道组织结构及营养物质消化吸收的影响在实验一吉富罗非鱼的饲养过程中,每15d收集粪便用于检测各组鱼对营养物质的表观消化吸收率,饲养60d后取消化道各组织检测消化酶活性并做石蜡切片。结果显示:(1)饲料中添加溶菌酶对吉富罗非鱼肝脏和胃肠道消化酶活性产生了不同程度的影响(p<0.05)。l36~l72组的胃、前肠和中肠蛋白酶活性显着高于对照组(p<0.05),而肝脏和后肠蛋白酶活性无组间差异(p>0.05);l72或l90组的肝脏、胃和后肠淀粉酶活性显着对照组(p<0.05),前肠淀粉酶活性在l54组显着高于对照组(p<0.05),中肠淀粉酶活性在除l72组外的其余添加组均显着高于对照组(p<0.05);l54或l72组的脂肪酶活性显着高于对照组(p<0.05)。(2)肠道切片统计结果表明,l54和l72组的前肠和中肠绒毛密度、高度和宽度均显着高于对照组(p<0.05),肌层厚度与对照组无显着性差异(p>0.05);l36~l72组的后肠绒毛密度和高度显着高于对照组(p<0.05),绒毛宽度在溶菌酶添加组有升高趋势,除l90组外均无显着差异(p>0.05),而肌层厚度在除l54组外的其余溶菌酶添加组有下降趋势(p<0.05);杯状细胞数量在l54和l72组均显着高于对照组(p<0.05)。(3)肝脏切片图显示,l36和l54组鱼肝细胞排列整齐,形状饱满,相较于对照组更加致密,但高剂量添加组的肝脏健康程度有下降趋势。(4)消化吸收率方面,在养殖i(1~15d)和ii(16~30d)期内,l36~l90组对粗蛋白的消化吸收率显着高于对照组(p<0.05),但对粗脂肪的消化吸收率无组间差异性(p>0.05);在养殖iii(31~45d)和iv(46~60d)期,l36~l90组在整体水平上对干物质、粗蛋白和粗脂肪的消化吸收率均显着高于对照组(p<0.05)。由此得出,本试验条件下,在吉富罗非鱼饲料中添加36~72mg/kg溶菌酶能提高消化酶活性并促进肝肠发育和健康;添加36~90mg/kg溶菌酶能不同程度地提高鱼体对饲料干物质、粗蛋白和粗脂肪消化吸收率。。在实验一吉富罗非鱼饲养60d后取各组鱼头肾、脾脏、肝脏和肠道组织并运用rt–pcr技术探索吉富罗非鱼不同组织内源c型溶菌酶和nf–κb信号通路相关基因表达水平对外源性添加溶菌酶的响应。结果发现:头肾中,l54和l90组鱼c1、c2、c3型溶菌酶和nf–κb(p65)基因mrna表达量下调(p<0.05);脾脏中,3种c型溶菌酶和nf–κb(p65)mrna表达量均随溶菌酶添加水平的提高而呈现先升后降的变化趋势,l54和l90组3种c型溶菌酶分别显着高于或低于对照组(p<0.05),nf–κb(p65)mrna表达量在l18组显着高于对照组和其余各组(p<0.05);肝脏中,l18组的c1型溶菌酶和l54组的c2、c3型溶菌酶mrna表达量均显着上调(p<0.05),而nf–κb(p65)基因的相对表达量在除l18组外均显着低于对照组(p<0.05);肠道中,l18和l54组的c2、c3型溶菌酶表达量均低于或显着低于对照组(p<0.05),nf–κb(p65)mrna相对表达量随溶菌酶添加水平的提高呈现先升后降的变化趋势,l18组显着高于对照组(p<0.05),l54和l90组显着低于对照组(p<0.05)。由此得出,添加18和54mg/kg的外源溶菌酶饲喂吉富罗非鱼60d可分别提高肝脏和脾脏中nf–κb(p65)和叁种内源c型溶菌酶的表达水平,而nf–κb(p65)和溶菌酶基因在mrna表达水平上没有直接相关性。试验五:不同溶菌酶添加水平下吉富罗非鱼的胃排空及消化道内容物特性研究为考察吉富罗非鱼摄食不同溶菌酶添加水平饲料的胃排空时间和在摄食消化过程中内容物特性的变化规律,本试验首先用溶菌酶添加水平分别为0(l0)、18(l18/低)、54(l54/中)和90(l90/高)mg/kg的饲料饲喂吉富罗非鱼60d,然后采用fe2o3标记和连续取样法对初始体重为(160±11.23)g的各组试验鱼进行胃排空试验,通过分析胃内容物总铁含量的变化确定其胃排空时间,同时对比研究了各组鱼摄食消化过程中内容物水分、ph、营养成分含量以及内容物和组织消化酶活性的变化规律。结果表明:(1)指数模型和平方根模型均能较好地描述各组鱼的胃排空曲线,但通过r2比较,l0和l18组更适合指数模型,l54和l90组更适合平方根模型。据各自的最优模型分别计算l0、l18、l54和l90组鱼胃50%排空时间依次为:7.97h、6.68h、6.74h、5.49h。(2)在24h的摄食消化过程中,溶菌酶添加组鱼消化道各段内容物的水分含量总体高于对照组(p<0.05),同时有一个较快的上升速率(摄食后0~12h)和较长时间的峰期;l54和l90组鱼胃内容物ph值在摄食初期(0~6h)下降速率较快,食物到达肠道后仍能保持较低的ph值(p<0.05),随摄食时间的延长和食物的推移,l54组鱼内容物ph值能较快地恢复或接近初始水平;消化酶活性方面:l54和l90组鱼胃组织和内容物中消化酶比活力均显着高于对照(p<0.05),l54组前肠蛋白酶和脂肪酶活性在摄食0.5~6h均显着高于对照组(p<0.05),而组织淀粉酶活性无显着性差异(p>0.05);摄食0~12h内,l54和l90试验四:外源性添加溶菌酶对吉富罗非鱼不同组织内源性c型溶菌酶及nf–κb信号通路基因表达的影响组鱼中肠内容物的蛋白酶和淀粉酶比活力在整体水平上高于对照组(P<0.05),各组内容物脂肪酶比活力在整个摄食过程中均无显着性差异(P>0.05);L54组鱼后肠内容物蛋白酶活性在数值上高于其他组(P>0.05),而淀粉酶和脂肪酶基本没有太大差异。(3)营养成分方面:L54和L90组鱼内容物粗蛋白和粗灰分含量显着高于对照组(P<0.05),而粗脂肪含量显着低于对照组(P<0.05)。由此可见,饲料中添加54和90 mg/kg溶菌酶能够缩短吉富罗非鱼的胃排空时间,并通过加速水分吞饮、酸化食物以及提高消化酶活性和分泌量来提高机体对营养物质的消化利用。试验六:饲用溶菌酶在吉富罗非鱼消化道的耐受性和吸收代谢规律体内外研究为探究饲用溶菌酶在吉富罗非鱼消化道和体内的适宜作用和吸收部位并确定其药效发挥时间,本试验采用体外模拟实验测定饲用溶菌酶对吉富罗非鱼肝脏和胃肠道各部位的耐受性,运用FITC–lysozyme体内示踪技术探索溶菌酶在鱼体内主要部位的吸收代谢规律。结果表明:(1)吉富罗非鱼肝脏和胃肠道粗酶液对溶菌酶制品活性有明显的抑制作用,随反应时间延长,其相对保留率逐渐降低。溶菌酶在吉富罗非鱼消化道各部位的相对保留率从高到低依次为后肠>中肠>胃>肝脏>前肠。说明其在吉富罗非鱼后肠的耐受性最佳,在前肠最差。另外,该溶菌酶制品在L54组鱼肝脏和胃中的相对保留率最高,并分别显着高于L18、L72、L90组和L0、L18、L36组(P<0.05)。(2)FITC–lysozyme示踪结果表明,吉富罗非鱼单次口服溶菌酶48h内,其在鱼体各部位的相对吸收率从高到低依次为中肠>前肠>后肠=胃=肝脏=中肾=血清>肌肉,因此溶菌酶主要在吉富罗非鱼肠道上半部被吸收(P<0.05);此外,从溶菌酶在血清中的药—时曲线图上可以看出,此溶菌酶制品的血药浓度可以维持12h,之后慢慢消除。综上认为,后肠是溶菌酶的最适存活部位,而前肠和中肠是其主要吸收部位,其药效发挥时间为12h。
牛蕾蕾[6]2014年在《地钱素M下调前列腺癌细胞炎症水平及抑制其侵袭转移的作用机制》文中研究指明前列腺癌(prostate cancer, PCa)是常见的男性恶性肿瘤,在西方发达国家发病率高,仅次于肺癌。我国虽是前列腺癌发病率较低的国家,但近年来随着人口老龄化、饮食生活习惯、环境因素等变化,其发病率迅速升高。前列腺癌是雄激素/雄激素受体依赖性肿瘤,因此通过睾丸切除、或使用抗雄激素药物等降低体内的雄激素水平而进行的内分泌治疗是治疗前列腺癌的首选方案,但大多数患者会在治疗后一年左右复发,并发展成为激素难治性前列腺癌(Hormone Refractory Prostate Cancer, HRPC)。HRPC具有较强的抗凋亡能力,易侵袭转移,预后差、死亡率高。尽管已对HRPC的演变进行了诸多深入系统的研究,但机制仍不完全清楚,也无有效的治疗策略。因此研究HRPC的恶性转化机制、寻找有效的治疗靶点依然是任重而道远。除了雄激素/雄激素受体依赖途径、非依赖途径在HRPC发生发展中的重要作用,近年来,慢性炎症在前列腺癌的发生、HRPC的演变过程中的重要性日益凸显。由于前列腺癌几乎都发生在外周区,与慢性前列腺炎的发生部位相同。在炎症反应中发挥重要作用的基因, MIC-1(Macrophage Inhibitory Cytokine-1, or growth differentiation factorl5), RNASEL, MSR-1(macrophage scavenger receptor1), TLR-4(Toll-like receptors4)等,因其基因型的改变参与前列腺癌的发生。而在前列腺癌恶性发展、侵袭转移过程中,肿瘤微环境中促炎细胞因子IL-6, TNF-a, IL-1等,发挥促进细胞存活增殖、血管形成的作用。其中IL-6是关键因子,可诱导产生Thl7的CD4+T细胞,后者拮抗具有肿瘤抑制作用的Thl CD4+T细胞；作为具有促瘤作用的炎性因子,IL-6可通过IL-6/gp130激活STAT3途径发挥促细胞增殖、抗凋亡作用。临床资料显示,IL6、MIC-1在转移性的前列腺癌患者血清中表达水平显着升高,在前列腺肿瘤的恶性发展过程中可能具有重要作用。另外,两条重要的炎症中枢信号途径IKK/NF-κB、JAK/STAT3,同时也是细胞增殖存活信号,在HRPC中均高表达、持续活化,与HRPC的抗凋亡、侵袭转移、预后差密切相关。因此,慢性炎症反应通过NF-κB、STAT3等信号促进前列腺癌的发生,而持续活化的NF-κB、STAT3进一步诱导产生炎症因子如IL6,形成循环活化,促进HRPC的形成,导致HRPC患者血清中IL6水平显着升高。炎症反应与前列腺癌化疗耐受的研究报道不多。已发现HRPC患者血清中IL-6、MIC-1水平增高与多西紫杉醇的耐药有关。由于慢性、复发性炎症在前列腺肿瘤的发生、侵袭转移、药物耐受等方面都发挥重要作用,因此,靶向炎症因子及其相关通路的治疗策略具有重要的理论和临床意义。如利用人源化的单克隆抗IL-6抗体CNTO328阻断IL-6作用,能显着抑制激素依赖前列腺癌LNCaP细胞增殖,同时抑制移植瘤生长。同样,趋化因子CCL2可促进巨噬细胞在肿瘤的浸润及极化为M2型,利用抗CCL2的抗体以及联用多西紫杉醇能显着提高HRPC的治疗效果并延长生存期。近年来,我们重点对源自苔藓植物的双联苄(Bisbibenzyls)化合物进行了系统的生物活性筛选,发现这类化合物毒性较低、具有良好的抗真菌、抗肿瘤活性。同时也对潜力化合物进行较为深入的作用机制研究、结构修饰、衍生物制备等。前期研究结果发现,某些联苄化合物可能具有一定的抗炎活性。基于上述研究,本论文对51种联苄化合物及其衍生物、结构修饰产物进行了系统的抗炎活性筛选,并通过结构特点、化合物的理化性质分析其与抗炎活性的关系。发现片叶苔素类化合物抗炎活性较弱,而地钱素类联苄化合物特别是地钱素M(Marchantin M, Mar M)的抗炎活性显着,而且Mar M可显着抑制前列腺癌细胞的侵袭转移。结合基因表达差异谱芯片数据及机制分析,发现Mar M可显着上调G蛋白信号途径调节蛋白4(Regulators of G-protein signaling4, RGS4), RGS4可抑制MMPs的表达、进而在侵袭转移过程中发挥重要作用。并且抑制IL6信号可更为显着增加Mar M诱导的RGS4的表达。本论文将分两部分研究Mar M的抗炎、抑制前列腺癌侵袭转移的作用机制。第一部分地钱素M抑制促炎因子的表达,提高前列腺癌细胞对多西紫杉醇的敏感性本课题组前期已对几百个联苄化合物进行抗肿瘤活性筛选,并对部分潜力化合物进行了较为深入的机制研究。同时也发现个别双联苄化合物可能具有一定的抗炎活性。本论文首先利用脐静脉内皮细胞(HUVEC)和外周血单核细胞(PBMC)为筛选模型,对51种联苄化合物进行了抗炎活性的筛选,其中也包括部分具有抗肿瘤活性的联苄化合物、衍生物、结构修饰化合物。发现地钱素M具有显着的抗炎活性,而且对肿瘤细胞的促炎因子也同样具有良好的效果。具体实验结果如下：1.地钱素类化合物具有良好的抗炎活性我们利用脐静脉内皮细胞(HUVEC)和外周血单核细胞(PBMC)为模型,以经典的促炎因子IL6为检测指标,对两种结构类型(片叶苔素类、地钱素类)的51种联苄化合物及其衍生物进行抗炎活性分析。ELISA和定量PCR实验结果显示,地钱素类双联苄化合物可以有效抑制HUVEC细胞中IL6的表达,而片叶苔素类化合物对IL6的表达无显着影响。其中地钱素M的抑制IL6的活性最为显着。2.地钱素M抑制多种炎症因子的表达抗炎活性筛选结果表明,地钱素M在所有筛选化合物中活性最高,对IL6的抑制率为34.3%,显示出良好的抗炎活性。ELISA和定量PCR实验结果进一步表明,地钱素M可以显着抑制HUVEC中ILlβ、IL6和CCL2的表达,且具有浓度和时间依赖性。PBMC细胞经LPS刺激后炎症因子表达增加,而地钱素M可显着抑制LPS刺激后的IL1β、IL6和CCL2的表达,片叶苔素化合物的抑制作用较弱。MTT结果显示,地钱素M具有抗炎作用的实验条件(作用浓度和时间)对正常的HUVEC细胞的增殖并无明显的抑制作用,进一步证实地钱素M可显着抑制促炎因子的表达。3.地钱素M显着抑制肿瘤细胞促炎因子的表达由于地钱素M具有良好的抗肿瘤活性,我们进一步分析地钱素M是否对肿瘤细胞也具有抗炎活性。激素非依赖的前列腺癌PC3细胞表达较高水平的炎症因子,地钱素M显着下调细胞中IL1β、IL6和TNFa的表达、抑制炎性因子的分泌,且呈时间和剂量依赖性。同样,地钱素M能够显着下调激素非依赖的前列腺癌DU145细胞、白血病K562细胞、肺癌H460细胞、以及结直肠癌HT一29细胞中IL6的表达和蛋白分泌,表明地钱素M对肿瘤细胞也具有良好的抗炎活性。4.地钱素M的抗炎机制分析由于地钱素M对多种促炎因子均有抑制作用,而炎症的中枢信号IKK/NF-κ B、JAK/STAT3在HRPC中均高表达、持续活化,与HRPC的抗凋亡、侵袭转移等密切相关,NF-κB/STAT3同时也是重要的转录因子,可介导多种下游靶基因的表达。因此我们分析NF-κB/STAT3信号通路是否参与地钱素M介导的抗炎活性。(1)地钱素M显着抑制LPS刺激后的HUVEC中p50和p65的表达：NF-κB与DNA的结合能力是其发挥作用的重要方式。NF-κB中的两个亚基p50和p65的DNA结合活性检测结果表明, HUVEC细胞经LPS刺激后p50和p65的DNA结合能力显着增加,而地钱素M可显着抑制p50和p65的结合活性、抑制NF-κ B的转录激活功能。(2)地钱素M显着抑制肿瘤细胞中IκBα/NF-κB的活化：Western blotting实验结果表明,地钱素M不仅可以抑制PC3细胞(NF-κB基础表达水平高)中NF-κB亚基p65的磷酸化,也可抑制NF-κB的抑制因子Ⅰκ B α的磷酸化水平。同时,地钱素M也可显着抑制H460和HT-29细胞(NF-κB基础表达水平低)中经LPS诱导激活的p65和I K B α的磷酸化水平,表明地钱素M可抑制持续活化、或者诱导激活的NF-κB的活性。(3)地钱素M可能是通过抑制IKK的活性进而抑制NF-KB的活性：在PC3细胞中,利用干扰RNA下调IκBα的表达后,可略微逆转地钱素M抑制p65磷酸化的作用,表明I K B α可能不是地钱素M抑制p65活性的主要靶点。此结果提示,地钱素M可能部分抑制了IKK的活性,从而导致I K B α磷酸化水平降低、依赖磷酸化降解的I K B α降解减少并抑制NF-κB的活化。(4)地钱素M显着抑制STAT3的活化：STAT3是位于NF-κB/IL6信号通路下游的重要介质,Western blotting实验结果表明,地钱素M不仅可以抑制PC3细胞中STAT3的磷酸化水平,还可抑制H460和HT-29细胞中经LPS刺激后显着上调的phospho-STAT3。而干扰iκBa后,并不显着逆转地钱素M对STAT3的磷酸化抑制作用,表明地钱素M也可通过其它机制抑制STAT3的活化。5.地钱素M的抗炎活性可增加前列腺癌细胞对多西紫杉醇的敏感性由于多西紫杉醇可显着增加肿瘤细胞中IL6的表达,我们利用流式分析技术检测地钱素M的抗炎活性是否能够提高细胞对多西紫杉醇的敏感性。结果显示,单纯使用中和抗体可封闭IL6介导的信号,但并不显着增加PC3和DU-145细胞对多西紫杉醇的敏感性。而联用地钱素M和多西紫杉醇后,细胞的凋亡率明显上升。另外细胞增殖实验结果表明,随着多西紫杉醇作用浓度的加大,PC3和DU-145的生存率逐渐降低,而若联用地钱素M后,对细胞的生存能力产生非常显着的协同抑制作用。因此,地钱素M对多种促炎因子的抑制作用可显着增加前列腺癌细胞对多西紫杉醇的敏感性。第二部分地钱素M通过上调RGS4、下调MMPs的表达而抑制前列腺癌细胞的侵袭转移由于促炎细胞因子IL-6, TNF-a, IL-1等对肿瘤细胞的增殖、血管形成、侵袭转移等都具有显着的促进作用。因此,本论文第二部分将分析具有抗炎活性的地钱素M对前列腺癌细胞侵袭转移能力的影响并对其机制进行初步探讨。研究表明,G蛋白信号途径调节蛋白(Regulators of G-protein signaling, RGS)家族成员和肿瘤的血管生成、转移以及细胞凋亡等诸多活动有密切关联。其中RGS4被报导在乳腺癌和卵巢癌中的表达与肿瘤细胞的恶性程度呈负相关,该蛋白在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达上调可以显着抑制肿瘤细胞的侵袭转移。目前尚未有文献报导RGS4在前列腺癌中的表达和功能。前期的基因表达差异谱数据显示,地钱素M可影响多个RGS蛋白的表达,本论文也将探讨RGS4是否参与地钱素M抑制细胞侵袭转移过程,并初步分析IL6是否也参与其调节过程。1.地钱素M显着抑制PC3细胞的迁移能力和侵袭能力前期结果表明,地钱素M能非常显着的抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。我们首先确定地钱素M对肿瘤细胞侵袭转移的影响。划痕实验和Transwell细胞体外侵袭实验表明,地钱素M可以显着抑制PC3细胞迁移的距离和转移到下室的细胞数量。而且其抑制细胞移动的作用显着高于多西紫杉醇(可增加IL6表达)、无抗炎活性的顺铂。2.地钱素M显着上调RGS4的表达基因芯片分析结果显示,地钱素M对18种RGS基因的表达都有较大影响。其中RGS4上调2.26倍。定量PCR验证结果表明,地钱素M可以显着上调RGS4的表达。另外,Western blotting实验和定量PCR结果表明,RGS4在前列腺正常上皮细胞RWPE1中高表达,在恶性程度较低的激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP中表达量较高,在恶性程度较高的激素非依赖性前列腺癌PC3和DU-145中表达量低,提示我们RGS4的表达量高低可能与前列腺癌的恶性程度有关。3.地钱素M上调RGS4的同时显着下调MMP7和MMP16由于NF-κ B的下游靶基因如MMPs等具有促进细胞侵袭转移的作用,我们分析地钱素M对MMPs表达的影响。恶性程度较高的PC3和DU145细胞经地钱素M处理后,细胞内MMP7和MMP16的mRNA水平显着下调,同时Western blotting也显示地钱素M显着抑制MMP7和MMP16的蛋白水平,同时,也明显上调RGS4的表达。4.RGS4能显着增强地钱素M对细胞MMP7和MMP16表达的抑制作用我们将质粒pcDNA3.1-RGS4转入PC3细胞使其过表达RGS4,再经地钱素M处理,结果显示,高表达RGS4可以抑制MMP7和MMP16的表达,再与地钱素M联用后,MMP7和MMP16的下调趋势变得更为明显。此结果表明,RGS4可抑制MMPs的表达,可增强地钱素M抑制细胞迁移的作用。5.RGS4显着增强地钱素M对细胞侵袭转移的抑制作用划痕实验和Transwell细胞体外侵袭实验结果显示,RGS4可以显着抑制PC3细胞的迁移能力和侵袭能力,而过表达RGS4后细胞再经地钱素M处理后,PC3细胞迁移的距离和转移到下室的细胞数量下降更加明显。因此,RGS4可负调控细胞的侵袭转移、增强地钱素M的抑制作用。第叁部分结论及创新点一、结论1.地钱素类双联苄化合物可显着抑制正常细胞和多种恶性肿瘤细胞的促炎因子活性。2.地钱素M显着抑制NF-κB/IL6/STAT3信号通路。3.地钱素M的抗炎活性提高了前列腺癌细胞对多西紫杉醇的敏感性。4.在半数抑制浓度下,具有抗炎活性的地钱素M比无抗炎活性的多西紫杉醇、顺铂具有更为显着的抑制细胞侵袭转移的能力。5.上调RGS4参与地钱素M抑制MMP7和MMP16表达、抑制细胞的侵袭转移。二、创新点与不足之处1.首次报导地钱素M具有显着抗炎活性,且地钱素M介导的抗炎活性可能是由于抑制NF-κB/IL6/STAT3信号通路而增强多西紫杉醇的功效。但该化合物抗炎活性的动物药效学实验尚需进行。2.首次报导地钱素M通过下调MMP7和MMP16的表达显着抑制激素非依赖性前列腺癌细胞PC3的侵袭转移,但具体机制有待于进一步研究。3.首次报导RGS4通过下调MMP7和MMP16的表达显着抑制细胞的侵袭转移,但具体机制有待于进一步研究。
郝洪平[7]2014年在《氯化锂抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制机制的研究》文中指出猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起以妊娠母猪繁殖障碍以及仔猪和生长育肥猪呼吸道症状和高死亡率为特征的猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),给世界养猪业造成了巨大的经济损失。尽管对PRRSV致病机制进行了广泛的研究,取得了一系列有重要意义的成果,但由于该病毒本身的高变异性及其与宿主之间复杂的作用机制,使得传统的治疗方法和疫苗预防不能有效控制疾病发生。因此对PRRSV与宿主相互作用机制的深入研究以及新型化学药物的研发对该病的有效控制有着重要的意义。本研究主要对氯化锂(LiCl)抗PRRSV活性进行了评估并对其作用机制进行了探讨。主要研究内容包括:1 LiCl抗PRRSV感染效果的研究通过Western Blot、Q-PCR、空斑实验等方法在MARC-145细胞上对LiCl的抗病毒活性及其机制进行研究。Western Blot和Q-PCR结果表明,LiCl能够在蛋白水平和RNA水平上有效地抑制PRRSV感染,且抑制效果具有剂量依赖性。空斑结果同样证明了LiCl对PRRSV感染的抑制效果。LiCl预先处理病毒粒子或者宿主细胞对病毒感染没有抑制效果,说明LiCl的抗病毒效果并不是通过改变病毒粒子或影响病毒粒子入胞产生的。进一步结果表明LiCl对PRRSV的释放与组装没有影响。2 Wnt途径与LiCl抗病毒效果关系的研究通过Western-blot、激光共聚焦、RNA干扰、药物抑制以及双荧光素酶报告基因系统等方法研究Wnt途径在LiCl抗PRRSV过程的具体作用机制。作为Wnt信号途径中的组成成分以及LiCl在生物机体内最重要的作用底物之一的GSK-3β调节着众多生理过程,本章中对GSK-3β与病毒复制的关系进行了研究。之前的研究表明LiCl能够抑制GSK-3β的活性,为了探究LiCl是否通过降低GSK-3β活性而抑制PRRSV的复制,我们利用GSK-3β特异性抑制剂GSK-3βinhibitorⅡ处理感染过PRRSV后的MARC-145细胞,然后通过Western-blot检测PRRSV N蛋白表达水平的变化。结果表明,GSK-3β抑制剂并不能对PRRSV感染产生明显的抑制效果。为了进一步探究GSK-3β活性对PRRSV复制的影响,我们利用RNA干扰方法减低细胞内GSK-3β的表达,结果证明,GSK-3β表达水平的降低对PRRSV感染未产生明显的抑制效果。为了探究GSK-3β在PRRSV复制过程中的作用,我们还利用紫外线灭活过的病毒以及未灭活过的病毒感染MARC-145,通过Western-blot检测其β-GSK-3β(ser9)磷酸化水平。结果表明灭活过的病毒不能增加p-GSK-3β(ser9)磷酸化水平,这说明GSK-3β的磷酸化与病毒的吸附和入胞无关,而与病毒的复制有关。此外我们还分析了在病毒感染24h内LiCl以及病毒感染对细胞内p-GSK-3β(ser9)磷酸化水平的影响。结果证明,LiCl能引起比病毒感染更强烈的p-GSK-3β(ser9)磷酸化水平。通过Western-blot方法对Wnt途径中β-catenin以及c-Myc蛋白表达水平的检测发现,虽然PRRSV与LiCl同样能够引起p-GSK-3β(ser9)磷酸化水平的升高,但是PRRSV感染却不能引起β-catenin以及Wnt途径目的基因之一的c-Myc水平的升高,而LiCl本身能引起MARC-145内β-catenin水平的显着升高,更重要的是LiCl能够在PRRSV感染的MARC-145内引起β-catenin水平的以及Wnt途径下游基因c-Myc的升高。这表明LiCl能在PRRSV感染的细胞内激活Wnt途径。为了进一步研究LiCl是否能在感染PRRSV的细胞内引发β-catenin的核转移及Wnt途径的激活,我们通过激光共聚焦观察了β-catenin在PRRSV感染细胞内以及LiCl处理的细胞内的分布情况。结果表明,LiCl能够明显刺激β-catenin的入核,而PRRSV的感染不能明显的促进β-catenin入核。在Wnt经典途径;中,β-catenin入核后会与转录因子Tcf/Lef家族成员结合,从而激活包括c-Myc在内的多种基因的表达。通过双荧光素酶报告基因系统,我们证明了LiCl能显着增强感染细胞内Tcf/Lef因子的转录活性,而PRRSV感染却不能增加其转录活性。以上数据表明LiCl可以通过促进感染细胞内β-catenin的积累,从而促进其入核以及增强转录因子Tcf/Lef的转录活性。PRRSV感染没有引起β-catenin表达量的增多及核转移。最后,为了探究LiCl是否通过激活Wnt信号通路抑制PRRSV复制,我们利用RNA干扰技术以及Wnt信号通路抑制剂,对LiCl的抗病毒活性进行了评估。结果表明,两者均能逆转LiCl的抗病毒效果,这说明LiCl通过激活Wnt途径来起到抗病毒效果,而抑制Wnt途径则能减弱LiCl对PRRSV复制的抑制效果。3 LiCl抑制PRRSV诱导的炎症反应及其作用机制的研究研究中我们主要对LiCl的抑制促炎症因子表达及作用机制进行了研究。通过实时荧光定量PCR方法,我们分析了在PRRSV感染6h、12h、18h、24h后促炎症因子(白细胞介素-6、白细胞介素-8以及白细胞介素-1β)在MARC-145细胞以及PAM细胞中的基因变化,以及感染后加入LiCl对它们表达的影响。结果显示,在MARC-145和PAM中LiCl均能明显抑制PRRSV引起的促炎症因子的基因表达。尤其是在感染18h后的抑制作用更加明显。为了研究LiCl抗炎作用的作用机制,我们利用Western-blot检测处理过后的MARC-145细胞内NF-κB信号通路的变化。结果表明,PRRSV在感染24h后能够通过抑制IκB的蛋白水平增强NF-κB的磷酸化水平。在加入LiCl的感染细胞内,NF-κB的磷酸化水平明显受到抑制。NF-κB作为体内重要的转录因子,其入核后能激活大量目的基因的表达,尤其是对促炎性因子基因的表达有着重要的作用。因此为了探究LiCl抑制促炎性因子分泌的的机制,我们利用激光共聚焦荧光免疫方法,观察LiCl在PRRSV感染细胞内对NF-κB入核情况的影响。结果显示,PRRSV的感染能够明显激活NF-κB的入核,而LiCl处理的感染细胞内,入核的情况受到明显的抑制。此外在PRRSV感染MARC-145后用Wnt途径抑制剂PNU74654以及LiCl处理24h后,通过实时荧光定量分析发现,Wnt抑制剂能够明显提高PRRSV感染引起的IL-6、IL-8、IL-1β基因水平的升高,而Wnt激活剂LiCl则能明显抑制PRRSV感染引起的IL-6、IL-8、IL-1β基因的表达。这表明Wnt途径可能在PRRSV感染过程中对IL-6、IL-8、IL-1β基因的表达具有负调节作用。以上结果表明LiCl能够有效抑制PRRSV感染引起的IL-6、IL-8、IL-1β基因水平的升高,其作用机制主要是通过激活Wnt途径抑制NF-κB的磷酸化以及入核情况,从而最终抑制IL-6、IL-8、IL-1β基因的表达。
薛娉娉[8]2016年在《RY10-4逆转乳腺癌多药耐药性及其抗肺腺癌活性研究》文中研究指明黄酮(flavonoids)大量存在于我们的饮食中,有着优良的药理、保健活性于一体的多种功效。它是一种在草本植物当中广泛存在的化合物,对人类的身体健康起着重要的维系作用。黄酮类化合物不仅可以从基本的日常生活中去调节身体机能的基本状态,还可以预防肿瘤以及心血管等重大疾病。近年来随着科学水平的深入研究,在临床治病的角度上来看,有一些黄酮有着纯天然且几乎无毒性等特点而广受人们的青睐。普通针毛蕨主要生长在我国长江以南的位置,是一种金星蕨科针毛蕨属植物。民间古方中普遍认为该种草本植物在清热解毒,散结软坚方面具有独特的功效,因此在传统祖国中医学里,它常常被用来做消除水肿及治疗止血之用。这种植物当中含有一种特殊的黄酮成分叫做原芹菜素(Protoapigenone)。它在体内外的抗癌活性细胞筛选中均有很好的抗瘤表现。Protoapigenone对很多不同来源的癌症细胞都能够表现出很明显的细胞毒作用,因此抗肿瘤谱较为全面,这让广大科研工作者为之欣喜。在后续科学研究中发现,一系列的非芳香B环的黄酮类化合物例如原芹菜素都有着强大的抗瘤活性。原芹菜素近几年在多药耐药方面也表现出不俗的成绩,可以有效的治疗和逆转肿瘤细胞多药耐药。根据构效关系研究及相关文献的报道,结合前人对Protoapigenone的研究基础,采用化学全合成的方法合成了毒性更低,药效更强,含1-hydroxy cyclohexa-2,5-dien-4-one基团的新型化合物RY10-4,其化学名为2-(1-hydroxy-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-yl)-4H-Pyran-4-one。本课题主要对RY10-4的药效活性进行了深入研究,主要内容包括两个部分：第一部分主要进行了RY10-4体内和体外逆转多药耐药性的乳腺癌的作用及其所涉及影响的相关信号传递通路；第二部分主要研究了RY10-4体外抑制人肺腺癌A549细胞增殖、侵袭以及诱导凋亡的作用,并对其抗肺癌活性相关的作用机制进行了研究。第一部分：RY10-4体内外对多药耐药乳腺癌的杀伤及逆转作用研究目的：本实验在前期工作中证实RY10-4在体外可以诱导乳腺癌细胞MCF-7的凋亡,同时我们在对RY10-4的一个初步预实验中发现,RY10-4作为原芹菜素类似物能逆转阿霉素(Adriamycin, ADR)激活的p-AKT,提示其可能和原芹菜素一样对阿霉素耐药的肿瘤细胞也发挥抗肿瘤作用,在临床运用上可能具有潜在意义,但RY10-4是否真正具有逆转耐药作用及可能的作用机制尚不清楚,因此本部分对此进行着重探讨。首先,研究RY10-4在体外水平对乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR生长增殖的影响；其次,进一步研究RY10-4对化疗药物ADR运用于MCF-7/ADR细胞的敏感性及其对药物转运相关功能的改变；然后,我们更进一步探讨了RY10-4在逆转MCF-7/ADR多药耐药时所涉及的相关信号传导通路；最后,在体内水平研究了RY10-4对耐药型乳腺癌的抗肿瘤效应及逆转作用。方法：本实验采用了乳腺癌敏感细胞系MCF-7和对阿霉素耐药的多药耐药细胞系MCF-7/ADR,观察RY10-4体内和体外抗癌和逆转耐药的作用。(1)采用四氮唑盐还原法(MTT法)绘制细胞生长曲线,观察RY10-4对MCF-7和MCF-7/ADR细胞生长的影响；采用/Annexin V/PI染色法,流式细胞术检测RY10-4对细胞MCF-7和MCF-7/ADR凋亡状态的改变和影响。(2)采用MTT法体外检测RY10-4对药物ADR敏感性的分析,探究细胞MCF-7/ADR在RY10-4作用下对ADR药物敏感程度的影响。(3)采用罗丹明(Rhodamine)外排实验检测MCF-7和MCF-7/ADR细胞膜在RY10-4作用下的药物转运泵功能的影响；运用Western Blot实验技术检测MCF-7/ADR细胞在RY10-4作用下细胞内P-gp蛋白表达水平的改变；运用Real-time PCR技术检测RY10-4作用后细胞MCF-7/ADR内多药耐药基因MDR1的转录水平的改变。(4)通过ATP水平检测实验,研究RY10-4对MCF-7/ADR细胞中过量表达的P-gp的影响。(5)通过、Western Blot和Real-time PCR等实验方法检测RY10-4对MCF-7/ADR细胞内Akt, p-Akt, NF-κB蛋白表达的影响,进一步联合使用Akt抑制剂LY294002和NF-κB抑制剂PDTC检测对MDR1基因和P-gp蛋白的影响。(6)运用移植瘤模型研究RY10-4体内逆转阿霉素的作用并用HE染色研究肿瘤组织的病理学改变。结果：RY10-4具有很强的逆转乳腺癌多药耐药作用。(1)细胞生长曲线显示,化合物RY10-4对敏感株MCF-7细胞及耐药株MCF-7/ADR细胞均有生长抑制作用,和对照组阿霉素相比,RY10-4可显着抑制MCF-7/ADR细胞的生长；用流式细胞仪采用Annexin/PI染色法检测对乳腺癌细胞的凋亡,结果显示：RY10-4可显着诱导MCF-7/ADR细胞的凋亡。(2)MTT法体外分析检测乳腺癌多药耐药细胞对药物敏感性影响的结果显示：MCF-7/ADR细胞虽对ADR耐药但对RY10-4的细胞毒作用敏感,且RY10-4能够增强MCF-7/ADR细胞对化疗药物ADR的敏感性,改变耐药的状况。(3)罗丹明123外排实验结果显示：RY10-4能够增高细胞MCF-7/ADR内罗丹明潴留量和蓄积量,提示RY10-4可降低MCF-7/ADR细胞膜外排泵的药物转运功能；Western Blot实验技术检测P-gp蛋白,结果显示：RY10-4能够上调细胞MCF-7/ADR内P-gp蛋白的表达水平；Real-time PCR对MDR1基因的检测结果显示：RY10-4可以上调MCF-7/ADR细胞内MDR1基因的转录水平。(4)通过ATP水平检测实验显示：RY10-4可以抑制ATP酶活性,降低ATP的水平从而逆转多药耐药。(5)通过Western Blot及Real-timePCR方法对逆转耐药的相关信号通路蛋白检测发现：RY10-4通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路调控MDR/P-gp介导的耐药型乳腺癌细胞MCF-7/ADR的多药耐药。(6)通过移植瘤模型发现：RY10-4可以体内逆转耐药型乳腺癌对阿霉素的抵抗,不论单用RY10-4还是联用ADR均能使组织中的肿瘤细胞死亡,表现出强大的抗癌效应和逆转耐药效力。结论：RY10-4作为原芹菜素类似物,一方面可抑制耐药的乳腺癌细胞增殖,诱导其凋亡,下调ATP水平并抑制P-gp的外排功能,另一方面可通过抑制PI3K/Akt/NF-KB信号通路,下调MDRl/P-gp的表达,逆转MCF-7/ADR的多药耐药,而且体内水平也可以抑制耐药型乳腺癌肿瘤组织的生长情况。因此,RY10-4在体内水平以及体外水平均表现出抗癌和逆转耐药的双重作用。在前期研究中,RY10-4的抗乳腺癌作用虽然已经做出了比较深入的研究,但本课题首次报道并验证了RY10-4具有逆转耐ADR乳腺癌的多药耐药作用,首次考察了RY10-4逆转耐药的分子机制,并且没有明显的毒副作用,在保证了强大的逆转耐药作用同时特保证了其应用的安全性,可以说RY10-4比传统的逆转剂维拉帕米(Verapamil)在逆转多药耐药方面有更明显的优势。我们的实验研究结果也提示了两个逆转多药耐药的潜在靶点：NF-κB及Akt。本实验的研究内容为RY10-4今后在临床上的抗癌运用(与化疗药联合使用或者单独使用)治疗肿瘤多药耐药提供了宝贵的指导基础。第二部分：RY10-4体外抗肺腺癌活性研究目的：本部分在体外水平研究RY10-4化合物抑制人源肺腺癌细胞A549的增殖作用,探究药物RY10-4在体外抗肺腺癌的药效活性,同时研究其抗肺腺癌药效活性所涉及的相关分子机制及信号通路。方法：本实验选用人肺腺癌细胞株A549,观察RY10-4体外抗肺癌作用。(1)运用MTT法和台盼蓝拒染法研究RY10-4抑制A549细胞体外增殖的作用。(2)运用Annexin V/PI双染法并用流式细胞仪进行检测、Hoechst33258荧光染色法,同时研究RY10-4对诱导肺腺癌A549细胞凋亡的作用。(3)通过PI染色法流式细胞仪分析RY10-4对细胞周期的阻滞作用。(4)通过Transwell法来评价RY10-4对A549细胞体外侵袭能力的影响。(5)运用Western Blot实验方法检测RY10-4对凋亡侵袭相关蛋白及相关通路蛋白表达水平的影响。(6)用流式细胞仪检测RY10-4对活性氧自由基(ROS)的影响。结果：RY10-4在体外表现出很强的抗肺腺癌活性。(1)RY10-4可以显着抑制A549细胞体外增殖活性。(2)RY10-4可以显着诱导A549细胞凋亡,染色法中经过RY10-4处理过的细胞呈现出明显的凋亡细胞的形态特征,凋亡细胞比率增高,且经STAT3抑制剂AG490预处理可以显着促进RY10-4诱导的凋亡反应。(3)RY10-4处理后,细胞的G1期细胞比率显着增加。(4)当A549细胞使用不同浓度RY10-4干预后发现,能够透过聚碳酸酯膜的细胞也梯度性减少,说明A549的侵袭行为受到了RY10-4的明显抑制。(5)在RY10-4处理后的A549细胞中我们检测到,线粒体中的细胞色素C向胞浆位置释放,线粒体凋亡途径被激活,P38、ERK信号传导通路被磷酸化活化。A549细胞被抑制剂预处理后,则发现U0126 (ERK特异性抑制剂)及AG490 (STAT3特异性抑制剂)明显地能够促进化合物RY10-4所诱导的细胞凋亡现象,而SB203580(P38特异性抑制剂)则抑制了RY10-4诱导的凋亡反应。(6)RY10-4处理后可显着增高ROS水平,且与U0126及AG490联用可进一步协同增高ROS水平,而联用SB203580则使ROS水平降低。结论：本研究首次证实了RY10-4体外抗肺腺癌A549细胞的药效活性,并考察了其分子机制。RY10-4通过抑制增殖,促进凋亡,阻滞细胞周期进程,抑制侵袭作用发挥良好的体外抗肺癌活性,ERK和p38MAPK通路介导的STAT3/ROS途径是RY10-4诱导凋亡和抑制侵袭的重要机制。
陈诚[9]2013年在《PI3K/Akt信号通路在重症急性胰腺炎大鼠发病早期的作用及其机制的研究》文中研究指明背景和目的重症急性胰腺炎发病早期,在各种损伤因子的刺激下单核/巨噬细胞等被激活,释放出大量的促炎细胞因子。多种促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)在SAP的病情演变过程中起着至关重要的作用。研究表明NF-κB、p38MAPK信号通路在SAP发病中起重要作用,促炎细胞因子产生与NF-κB、p38MAPK等细胞内信号转导通路异常激活有关。我们的前期工作发现SAP时NF-κB、p38MAPK信号通路均可被活化,并通过产生大量细胞因子,在SAP发病中起重要作用。近年来,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路信号转导通路介导炎症、应激等细胞反应在急性胰腺炎发生发展中的作用引人注目。有研究表明SAP时促炎细胞因子的表达和释放与PI3K/Akt信号转导通路异常激活有关,在重症急性胰腺炎的全身炎症反应中发挥作用,而抑制PI3K/Akt信号通路的激活可以明显减轻SAP发病时的炎症反应,但作用机制尚不清楚。本研究观察SAP发病早期PI3K/Akt信号转导通路在大鼠胰腺组织中的表达情况,并通过抑制PI3K/Akt信号转导通路来研究PI3K/Akt通路对细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)转录和表达以及胰腺组织病理评分的影响和PI3K/Akt通路在NF-κB、p38MAPK通路活化中的作用,探讨PI3K/Akt信号通路在重症急性胰腺炎大鼠发病早期的作用及其机制。方法第一部分:将SD大鼠60只随机分为重症急性胰腺炎组(S组)、假手术组(C组)、生理盐水组(NS组)、溶剂(DMSO)对照组(R组)、SAP+PI3K/Akt抑制剂wortmannin组(W组)。采用改良的Aho法制作SAP模型,分别在造模3、6h后抽血并处死大鼠,收集胰腺组织。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)表达。Real-time PCR方法检测胰腺组织细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)m RNA转录水平变化,并常规HE染色进行胰腺组织病理评分,同时观察各组腹水量、血清及腹水淀粉酶的变化。第二部分:72只SD大鼠随机分为:假手术对照组(SO组)、重症急性胰腺炎组(SAP组)、SAP+PI3K抑制剂wortmannin组(W组),每组24只。采用改良的Aho法制作SAP模型。假手术或造模3、6h后分别处死12只大鼠并立即心脏取血,收集大鼠胰腺组织。采用实时定量PCR(Real-time PCR)和Western Blot检测胰腺组织中Akt、p38MAPK、NF-κBp65 m RNA及蛋白磷酸化的表达情况。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)表达。同时检测血清淀粉酶水平,HE染色评估胰腺损伤程度。结果第一部分:S组和R组大鼠术后3、6小时的腹水量、血清及腹水淀粉酶水平、胰腺组织病理评分较C组和NS组增高,差异有统计学意义(P<0.05);W组的腹水量、血清及腹水淀粉酶水平、胰腺组织病理评分较同时段的S组和R组有所降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与C组和NS组相比,S组和R组大鼠术后3、6小时的血清细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平和胰腺组织内TNF-α、IL-1β、IL-6 m RNA转录水平增高,差异有统计学意义(P<0.05);W组的上述指标均低于S组和R组,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分:SAP组与SO组比较,大鼠胰腺组织中Akt、p38MAPK、NF-κBp65 m RNA表达及蛋白磷酸化水平、血清细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)含量、血清淀粉酶表达水平和胰腺组织病理学评分在3h、6h均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。SAP模型建成3h、6h后,W组与同时段的SAP组相比,大鼠胰腺组织中Akt的转录活性和蛋白磷酸化程度降低(P<0.05)的同时,p38MAPK、NF-κBp65 m RNA表达和磷酸化水平也明显降低(P<0.05)。W组的血清细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)表达、血清淀粉酶、胰腺组织病理学评分均低于同时段的SAP组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PI3K/Akt信号转导通路的激活介导重症急性胰腺炎时p38MAPK、NF-κB通路的活化,影响SAP大鼠细胞因子的转录和表达水平,与SAP大鼠早期炎症反应密切相关。抑制PI3K/Akt信号转导通路不仅可以抑制Akt活化,还可以下调p38MAPK、NF-κB的活性,减少促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的转录和表达,减轻大鼠胰腺组织的病理损伤,对SAP大鼠具有保护作用。
龙宇鹏[10]2015年在《miR-669n/SENP6及Rab5/7对LPS/TLR4信号转导通路的调控机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景及目的:在哺乳动物细胞中,普遍存在着Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)家族,其归属于模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),遗传性状被种属基因所调控,行使着识别病原体相关模式分子(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的功能。相应的PAMPs,例如细菌、病毒及真菌等对免疫细胞的刺激,可促使其表达此类受体分子。与其它TLRs类似,TLR4凭借着特异性识别功能,使其能够结合细菌脂多糖(lipopolysaccharide/endotoxin,LPS)而活化。TLR4是介导针对病原体相关分子的免疫反应的一个非常重要的分子,其活化能够促进固有免疫系统的抗原提呈细胞功能性成熟,并触发促炎介质的释放。TLR4在细胞膜上识别并结合LPS后,沿MyD88(myeloid differentiation primary response gene 88)依赖以及TRAM-TRIF依赖两条途径,开始了各自独立的炎症信号级联传递。此过程中接头蛋白TIRAP和TRAM起着分别募集信号适体蛋白MyD88和TRIF的作用,并与之配对从细胞膜及早期内体分别启动两条分子信号通路,将炎症信号级联传递到胞内,活化核转录因子,引起炎症因子和Ι型干扰素的释放。由于该通路过度激活会引起严重的炎症及脓毒症,因此信号转导过程中还有多种负调节蛋白分子参与信号转导反馈性抑制作用。这些负调控分子与炎症信号通路中的效应分子交互作用,构成精密而又复杂的网络调节体系,最终决定着炎症细胞活化的程度。目前对LPS/TLR4信号转导通路的研究仍在不断进行中,有些调节机制尚待明确,许多调控分子还有待发现。NF-κB作为LPS/TLR4炎症信号转导通路中的最重要的核转录因子,参与了两条信号通路的转导,对通路中炎症介质的转录合成到了起关键调控作用。正常状态下,它与其抑制物IκB形成复合物处于无活性状态。细胞感受到外界刺激信号后,会将胞外这些信号转导至胞浆,使IκB发生磷酸化降解,NF-κB得到活化而进入细胞核,继而相关基因启动转录表达,释放炎症细胞因子TNF-α、IL-6及IFN-γ。因此,寻找针对NF-κB调控的新方式能够使了解LPS/TLR4信号通路的相关作用机制的程度得到进一步深化。泛素(ubiquitin,Ub)可与靶分子共价结合介导蛋白质降解,在转录调节、信号传递、炎症免疫等方面发挥着重要作用。关于小泛素相关修饰物特异性蛋白酶6(sumo-specificprotease6,senp6),据最近研究报道,也会产生类似泛素的功效,令nf-κb必需调节蛋白(nf-κbessentialmodifier,nemo)去sumo(smallubiquitinrelatedmodifier)化,使nf-κb活性受到抑制,进而展现其负调控nf-κb相关信号通路的功能。由于senp6是一个新发现的nf-κb的抑制分子,目前对其在巨噬细胞中的表达调控机制尚不明确。小分子rna是一段长度约20-24核苷酸的非编码小分子rna,能够在目标分子的mrnas上,锁定其3’端非翻译区(3’-untranslatedregion,3’-utr)进行结合,从而介导目标mrna的降解或是遏制目标分子在翻译水平的表达。多项研究表明,作为近年来的研究热点之一的小分子rna(micrornas,mirnas)是蛋白质在翻译后水平的重要调控元件,有着非常广泛的作用范围。目前的研究表明,有多种与感染、炎症免疫相关的蛋白均受到mirnas的调控。另外,mirnas在调节tlrs信号转导方面也发挥着重要作用。而mirnas是否能够通过调节使senp6高表达从而调控nf-κb转录活性,这仍需要后续的研究来确认。除转录因子nf-κb外,其上游的受体分子tlr4也在myd88/tram-trif两条信号通路的转导中都起到了重要作用。活化的tlr4能够分别启动并调控两条通路的信号转导,因此对两条信号转导通路而言,它均具有重要生物学意义。而且有研究表明,在lps介导的细胞活化中,细胞活化程度的强弱及相应的信号转导很大程度上受质膜上tlr4的数量及其在胞内转运效率的影响;抑制tlr4-lps复合物的内化会促进myd88信号通路的活化。因此,tlr4将tram-trif信号途径跟myd88信号途径紧密联系在了一起,tlr4在胞膜及细胞器的分布变化可能对两条通路信号的产生发挥了平衡调控作用。在真核细胞中,细胞内的转运活动由关键调控分子rab蛋白(rasrelatedinbrain)调节。rab蛋白不仅对tlr4的转运过程起到了调控作用,而且其转运效率对tlr4的分布可能产生了重要影响。简而言之,有很大可能,胞内转运蛋白rab介入了对lps/tlr4活化单核、巨噬细胞效应的调控过程,但是还有待进一步的实验来揭示在此过程中rab蛋白具体是如何发挥作用的。之前,本课题组发现,氯喹(chloroquine,cq)能够使脓毒症小鼠的生存率发生显着提高;氯喹预处理人外周血单个核细胞(hpbmc)以及小鼠巨噬细胞(ana-1)会对lps的活化(tnf-α、il-6等多种细胞因子释放)产生显着的负调控效果。而cq本身不能结合和直接拮抗lps的活性,因此其对炎症的抑制效应只能作用于lps/tlr4信号通路的效应分子。研究显示,作为一种得到广泛应用的抗炎药物,氯喹能够对lps/tlr4介导的单核、巨噬细胞过度活化产生抑制效果,但是迄今仍未明确该作用的潜在分子机制。这些提示我们,由于转录因子nf-κb能够控制炎症细胞因子的释放,cq很可能对的细胞因子上游的重要转录因子nf-κb产生抑制作用,这使我们考虑是否senp6也可能与cq对lps/tlr4信号通路的抑制作用有关。另外,课题组在之前的实验中还发现,cq可能对细胞膜表面的tlr4表达有影响。这提示tlr4可能受到cq的药效影响,导致其在胞内的转运效率发生变化。该过程很可能与胞内转运分子rab对tlr4分布的调节有关,从而促使tlr4在质膜上的数量及细胞内的分布发生变化,造成tlr4聚集至胞内细胞器或内体而不再参与信号转导,进而使lps诱导的单核巨噬细胞活化受到抑制。鉴于cq对lps/tlr4信号通路中多个效应分子的调节作用,我们应用此功能将其作为工具对lps/tlr4信号转导通路进行深入研究。本课题从cq对lps/tlr4的两条信号转导通路的抑制功能研究切入,藉由对不同炎症效应分子作用的实验,从两个方面阐述lps/tlr4信号通路的负调控作用可能的发生机制。一方面研究senp6/mirnas直接对炎症信号通路中最重要的转录因子nf-κb产生的调控作用及相应机制;另一方面则探讨胞内转运关键分子rab通过调节细胞中tlr4分布表达,而对tlr4介导的两条下游信号通路活化的影响及其可能机制。综上所述,本课题以cq的炎症抑制作用作为切入点,藉由对lps/tlr4信号通路被抑制的效应进行生物学机制研究,为进一步阐明lps/tlr4介导的巨噬细胞活化中一些关键环节的调节机制并发掘新的炎症调控分子奠定实验基础。方法:1.氯喹抑制lps/tlr4信号转导通路的功能研究1.1用浓度20μg/mlcq对小鼠巨噬细胞raw264.7预处理1h后,加入lps(100ng/ml)刺激24h,细胞因子tnf-α、il-6、ifn-β蛋白表达情况以elisa法确定;1.2westernblot(wb)检测tlr4下游炎症信号通路分子变化:nf-κb上游抑制物iκb-α、干扰素调节因子3(irf3)及信号通路mapks中的jnk、erk1/2、p38蛋白及其磷酸化水平;1.3激光共聚焦定位检测转录因子nf-κb的亚基p65及irf3转位入核情况。2.mir-669n调控senp6在抑制lps/tlr4信号通路中作用的机制研究2.1检测senp6和cq之间是否存在量效关系及其对lps刺激的巨噬细胞活化的作用:(1)用不同剂量cq(0、5、10、20μg/ml)对小鼠巨噬细胞raw264.7预处理1h后,加入lps(100ng/ml)刺激24h,然后senp6mrna及蛋白水平分别以实时荧光定量pcr(rt-pcr)及westernblot(wb)法确定;(2)以构建的senp6过表达及shrna干扰载体(pcdna3.1)对raw264.7细胞进行24h的转染,通过以实时荧光定量pcr和westernblot确定的senp6基因及蛋白水平变化对转染效果进行评估;(3)senp6过表达及干扰载体转染raw264.7细胞,然后lps处理24h,以elisa法进行细胞因子tnf-α、il-6、ifn-γ蛋白变化的检测。2.2生物信息学预测并确定raw264.7细胞中以senp6为靶标分子的mirnas(1)通过靶标分析软件targetscan、miranda、mirecords预测,选择与靶基因senp6的3’utr序列互补的mir-669n;(2)用不同剂量cq(0、5、10、20μg/ml)对小鼠巨噬细胞raw264.7预处理1h后,加入lps(100ng/ml)刺激24h后收样,经rt-pcr检测确定mir-669n在mrna水平上出现的变化;(3)构建mir-669n过表达及反义表达载体(antisenseofmir-669n,as-mir-669n)转染raw264.7细胞,mir-669n的mrna水平通过实时荧光定量pcr确定,以对转染效果进行评估;(4)构建目标靶点萤光素酶报告载体,与mir-669n过表达及反义抑制表达载体共转染raw264.7细胞,根据荧光表达情况判断mir-669n是否能影响靶基因的表达。2.3确认mir-669n通过senp6调控lps刺激的巨噬细胞活化(1)将raw264.7细胞以mir-669n过表达以及反义表达载体分别进行转染处理至24h,实时荧光定量pcr和westernblot检测mir-669n对senp6基因及蛋白水平的影响;(2)mir-669n过表达及反义表达载体分别转染raw264.7细胞24h,后lps(200ng/ml)处理24h,以elisa法进行细胞因子tnf-α、il-6及ifn-γ改变情况的测定;(3)通过尾静脉注射mir-669n及as-mir-669n载体,建立mir-669n过表达及表达抑制的脓毒症小鼠模型:将c57bl/6雌性小鼠(10周龄)分为对照组、mir-669n过表达组和抑制表达组,每组10只。分别尾静脉注射生理盐水配制的载体,48h后腹腔注射lps(20mg/kg),3h后收集外周血elisa法检测细胞因子,分离肝脏枯否细胞提取mrna及蛋白,实时荧光定量pcr和westernblot检测mir-669n、senp6基因及蛋白水平以评价转染效果;观察、记录小鼠状态至40h,以确定mir-669n的表达变化对脓毒症小鼠的影响。3.rab5/7调节tlr4分布在抑制lps/tlr4信号通路中作用的机制研究3.1氯喹调节tlr4的表达及分布的功能研究(1)以wb确定细胞tlr4总蛋白被cq调节而产生的改变;(2)以流式细胞术对cq调节胞膜上tlr4表达的改变进行检测;(3)激光共聚焦定位检测tlr4细胞内定位情况:免疫荧光分别标记tlr4(cy3)、早期内体(eea1,fitc)、晚期内体/溶酶体(lamp1,fitc)、高尔基体(giantin,fitc)、rab11(循环内体,fitc)在lps及cq处理前后观察tlr4在细胞内的定位分布情况。3.2rab5/7调控lps/tlr4信号通路的机制研究3.2.1表达改变的rab5、7造成的lps/tlr4信号通路变化(1)结合rab的已知功能筛选出对tlr4分布产生明显影响的rab5和rab7,通过rt-pcr和wb法分别检测其mrna及蛋白水平变化,以确定cq是否对早期内体转运分子(rab5)以及晚期内体转运分子(rab7)产生调节作用。(2)采用sirna技术分别干扰rab5、7表达,将其转染raw264.7细胞24h后,rab5、7基因及蛋白水平分别通过实时荧光定量pcr及westernblot法确定,以对干扰效果进行评估;(3)以sirna对raw264.7细胞进行转染,之后cq预处理1h细胞,再以lps(100ng/ml)刺激24h,以elisa法进行细胞因子tnf-α、il-6、ifn-β的变化测定;(4)sirna分别干扰rab5、7后,按照前面实验方法药物处理细胞,westernblot检测tlr4下游炎症信号通路分子变化:iκb-α、irf3、mapks信号转导通路中jnk、erk1/2、p38及其蛋白磷酸化水平;(5)sirna分别干扰rab5、7后,激光共聚焦定位检测转录因子nf-κb的亚基p65及irf3转位入核情况;(6)构建目标靶点nf-κb及irf3的反应性基因(ifn-β)的萤光素酶报告载体,分别与sirnarab5、7共转染raw264.7细胞24h,cq预处理细胞1h,再加入lps(100ng/ml)刺激6h,双萤光素酶实验检测能够反映nf-κb及irf3活性的变化水平。3.2.2nh4cl预处理引起的lps/tlr4活化巨噬细胞作用的变化:(1)用浓度500μg/mlnh4cl对小鼠巨噬细胞raw264.7预处理1h后,加入lps(100ng/ml)刺激24h,细胞因子tnf-α、il-6及ifn-β的变化以elisa法测定;(2)westernblot检测nh4cl预处理对rab5、7分子的蛋白表达水平的影响。4.统计学分析:全部计量资料以均值±标准差(mean±sd)形式体现。统计数据采用单因素比较(one-wayanova),以p<0.05为有显着性差异。选择spss13.0进行数据统计学处理。结果:1.氯喹抑制lps/tlr4信号转导通路的功能研究1.1elisa结果显示,cq能够显着下调炎症细胞因子tnf-α、il-6、ifn-β的表达(p<0.05);1.2westernblot结果表明,cq能够显着下调tlr4下游多个炎症信号通路分子的磷酸化水平(piκb-α、p-irf3、p-jnk、p-erk1/2、p-p38),显着促进表达iκb-α(p<0.05);1.3激光共聚焦结果显示,cq能够明显抑制核转录因子nf-κb亚基p65及irf3的转位入核。2.mir-669n调控senp6在抑制lps/tlr4信号通路中作用的机制研究2.1检测senp6的表达是否与cq相关及其对lps介导的巨噬细胞活化的影响(1)senp6的蛋白表达与cq具有正向量效关系,而其基因表达与cq无相关性;(2)通过rt-pcr及wb检测senp6的表达,发现构建的senp6过表达及shrna干扰载体转染效果明显;(3)senp6过表达后,炎症细胞因子明显下调(p<0.05),反之亦然。2.2生物信息学预测并确定raw264.7细胞中以senp6为靶标分子的mirnas(1)通过生物信息学预测结合文献得到以senp6为靶基因的mir-669n;(2)mir-669n分子的表达与cq具有负向量效关系;(3)构建的mir-669n过表达及反义表达载体转染细胞后对其表达影响效果明显;(4)通过以senp6为靶点的双荧光素酶报告载体,验证了mir-669n能与senp6的mrna预测位点结合。2.3确认mir-669n通过senp6调控lps刺激的巨噬细胞活化(1)结果显示,mir-669n能显着抑制raw264.7细胞的senp6蛋白水平的表达(p<0.05),但对其基因水平无显着影响;(2)mir-669n过表达使巨噬细胞炎症因子表达显着上调(p<0.05),而其表达抑制则使巨噬细胞炎症因子表达显着减少(p<0.05);(3)在mir-669n过表达及表达抑制的脓毒症小鼠模型中,mir-669n过表达使小鼠外周血细胞因子表达显着上调(p<0.05),而其表达抑制则使外周血细胞炎症因子表达显着减少(p<0.05);小鼠枯否细胞的mir-669n检测结果表明转染效果明显,而且mir-669n能显着抑制senp6蛋白水平的表达(p<0.05),但对其基因水平无显着影响;mir-669n过表达会使脓毒症小鼠生存率显着降低,而其表达抑制使脓毒症小鼠生存率显着提高(p<0.05)。3.rab5/7调节tlr4分布在抑制lps/tlr4信号通路中的作用机制研究3.1氯喹调节tlr4的表达及分布的功能研究(1)westernblot结果表明,经cq对raw264.7细胞进行预处理,并没有显着变化出现在tlr4总蛋白水平上;(2)流式细胞术结果表明,cq预处理后,细胞表面tlr4表达明显减少;(3)激光共聚焦定位结果显示,cq预处理后,tlr4与早期内体(eea1)及晚期内体/溶酶体(lamp1)标志物的共定位明显增强(黄色荧光共定位增强)。3.2rab5/7调控lps/tlr4信号通路的机制研究3.2.1表达改变的rab5、7造成的lps/tlr4信号通路变化(1)rt-pcr以及wb结果显示,早期内体转运分子(rab5)及晚期内体转运分子(rab7)的mrna及蛋白水平受到cq的作用,均分别发生了显着上调(p<0.05);(2)sirna分别沉默rab5、7分子后,rt-pcr及wb检测结果显示对两个分子具有良好干扰效果;(3)sirna分别沉默rab5、7分子后,elisa结果显示,炎症细胞因子tnf-α、il-6、ifn-β的表达显著上调(p<0.05);(4)sirna分别沉默rab5、7分子后,westernblot结果表明,tlr4下游多个炎症信号通路分子的磷酸化水平(piκb-α、p-irf3、p-jnk、p-erk1/2、p-p38)显着上调,iκb-α的表达显著下调(p<0.05);(5)sirna分别沉默rab5、7分子后,激光共聚焦结果显示,核转录因子nf-κb亚基p65及irf3的转位入核明显增加;(6)rab5、7分子分别被相应sirna沉默之后,通过双萤光素酶实验结果发现,nf-κb及irf3的转录活性显着上调,即nf-κb反应性基因及ifn-β的荧光比值分别发生显著上调(p<0.05)。3.2.2nh4cl处理细胞后,elisa结果显示,炎症细胞因子tnf-α、il-6、ifn-β表达水平无显著变化;westernblot结果显示,rab5、7分子的蛋白表达水平无显着变化。结论:1.确定cq的预处理对lps/tlr4介导的myd88依赖及trif/tram依赖的两条信号途径均起到了抑制作用。2.senp6蛋白能够负调控巨噬细胞活化;验证了mir-669n的靶标分子是senp6,而mir-669n的表达下调可以促进senp6蛋白水平增加;mir-669n对靶标senp6的负调控作用可能是通过两者mrna的结合而抑制其蛋白翻译的功能。mir-669n表达抑制引起的SENP6蛋白高表达能够显着抑制巨噬细胞的活化,并且对脓毒症小鼠具有保护作用。3.CQ预处理能够促进LPS-TLR4复合体的内化,使TLR4在早期内体及晚期内体中聚集;Rab5、7的表达上调会使其细胞内转运效率提高,可能进而影响到TLR4的胞内分布;Rab5、7两者中任何一个发生表达抑制,均会造成CQ抑制LPS/TLR4介导的细胞活化的作用显着减弱。因此,转运分子Rab5、7可能协同合作以调节TLR4在细胞中分布的方式,从而发挥其炎症抑制效应;CQ的炎症抑制效应与其酸化抑制作用无关,而是与Rab5、7分子的表达水平相关。4.对LPS/TLR4介导的细胞活化的抑制作用可能需要多个调控分子的协同作用,藉由对炎症信号通路的中不同的效应分子的调节,从多方面发挥炎症抑制作用。
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