肥大细胞与巨噬细胞对口蹄疫病毒样颗粒的应答效应

论文摘要

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（FMD virus,FMDV）感染偶蹄动物引起的一种高度接触性传染病,可感染牛、羊和猪等70多种动物。FMDV主要通过呼吸道和消化道黏膜侵入机体,对动物的健康、生长、动物及动物产品的全球贸易造成了严重影响,目前仍无安全高效的疫苗用于本病的预防。肥大细胞和巨噬细胞是天然免疫系统的重要免疫细胞,主要分布于皮肤和粘膜中,与树突状细胞共同构成抗感染的第一道防线,可通过其表面的模式识别受体（pattern-recognition receptors,PRRs）识别细胞内外病原及病原相关产物,作为效应细胞以吞噬或非吞噬途径杀死病原体,在抗感染过程中发挥重要作用,因此被称为机体的“哨位细胞”。肥大细胞通过PRRs识别病原体,可引起脱颗粒释放多种活性物质,改变血管通透性、启动炎症反应,并调节其他细胞功能,但目前对肥大细胞在抗FMDV感染中的作用了解甚少。清道夫受体（scavenger receptor,SR）是巨噬细胞等表达的吞噬受体和PRRs,可识别多种病毒和细菌,引起巨噬细胞活化,分泌TNF-α、IL-6与IFN-γ等。本实验室研究发现,巨噬细胞可通过SR识别重组FMDV VP1-VP4,SR在树突状细胞提呈FMDV VP1-VP4抗原中发挥负调节作用,但对SR介导巨噬细胞抗FMDV的免疫应答作用尚不清楚。本研究用口蹄疫病毒样颗粒（FMDV virus-like particles,FMDV-VLPs）分别负载小鼠腹腔肥大细胞（peritoneal mast cells,pMCs）和脱颗粒抑制剂丹参酮ⅡA预处理的pMCs,以不做处理的pMCs为对照组,培养6 h收集各组pMCs及其上清液,分别作用于脾初始淋巴细胞,以单纯脾初始淋巴细胞为对照组,同时每个组均设刀豆蛋白A处理的对照组,用CCK-8试剂盒检测淋巴细胞增殖,并对各组pMCs进行甲苯胺蓝染色,观察脱颗粒现象。结果显示,负载FMDV-VLPs的pMCs组未脱颗粒的pMCs数量极显著低于单纯pMCs组（P<0.01）和丹参酮ⅡA预处理组（P<0.01）,这说明FMDV-VLPs刺激pMCs可引起明显的脱颗粒。负载FMDV-VLPs的pMCs上清液对脾总淋巴细胞的增殖具有一定的促进作用。丹参酮ⅡA可抑制FMDV-VLPs诱导的pMCs脱颗粒,并降低pMCs上清液促进淋巴细胞增殖的作用,但FMDV-VLPs刺激pMCs后的上清液对脾T淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用,丹参酮ⅡA处理组pMCs的上清液使脾T淋巴细胞增殖进一步降低。这表明,在肥大细胞不与淋巴细胞接触和无抗原存在的条件下,FMDV-VLPs诱导的pMCs脱颗粒产物具有促进脾初始淋巴细胞增殖的作用,而其分泌成分则对脾T淋巴细胞增殖发挥抑制作用。用FMDV-VLPs分别负载小鼠腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophages,pMΦ）、以及紫草素和番泻苷B同时预处理的pMΦ,以不做处理的pMΦ为对照组,培养6h收集各组上清液,分别作用于脾初始淋巴细胞,以单纯脾初始淋巴细胞、FMDV-VLPs处理的脾初始淋巴细胞、负载FMDV-VLPs的pMΦ-脾初始淋巴细胞为对照组,同时每个组均设刀豆蛋白A预处理的对照组,用CCK-8试剂盒检测淋巴细胞增殖。结果显示,FMDV-VLPs可直接促进脾总淋巴细胞增殖（P<0.01）,但不能直接促进T淋巴细胞增殖;负载FMDV-VLPs的pMΦ可极显著促进脾总淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖（P<0.01）,而且FMDV-VLPs通过pMΦ的提呈作用促进脾淋巴细胞增殖的作用强于其直接刺激脾淋巴细胞增殖的作用;但负载FMDV-VLPs的pMΦ上清液不能促进脾总淋巴细胞和T淋巴细胞增殖作用,而且单纯pMΦ上清液也不能促进脾总淋巴细胞和T淋巴细胞增殖作用。这表明,B淋巴细胞可通过B细胞受体直接特异性识别FMDV-VLPs启动活化与增殖,而不需要抗原提呈细胞（antigen presenting cell,APC）的加工和处理,同时B淋巴细胞的活化需要抗原信号与共刺激信号的同时存在。尽管FMDV-VLPs刺激可引起pMCs和pMΦ分泌多种蛋白质分子（如G-CSF、IL-13、IL-15、IL-17、IL-17BR等）,但与pMCs相比,负载FMDV-VLPs的pMΦ只有与淋巴细胞接触才能将其激活。值得注意的是,可抑制TNF-αmRNA成熟的紫草素和可抑制SR的番泻苷B预处理后负载FMDV-VLPs的pMΦ上清液对脾总淋巴细胞和T淋巴细胞均发挥极显著的抑制作用（P<0.01）,这表明巨噬细胞分泌的TNF-α和SR所介导的生物学作用对脾脏免疫应答的建立具有促进作用。用FMDV-VLPs分别负载单纯pMΦ、以及NF-κB抑制剂汉黄芩素和SR抑制剂番泻苷B预处理后的pMΦ,以分别负载OVA或重组FMDV蛋白VP1-VP4的pMΦ为对照组,同时以不做处理的pMΦ为空白组。培养4 h分别收集各组pMΦ,用染色质免疫共沉淀法（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）检测NF-κB与TNF-α启动子的结合活性。用兔抗小鼠NF-κB1 p105/p50抗体进行ChIP,与无关抗原的兔IgG进行ChIP比较,所捕获的TNF-α启动子片段的%Input值差异极显著,其中pMΦ组所捕获的TNF-α启动子片段的%Input值升高3.28倍（P<0.001）,OVA组升高11.27倍（P<0.001）,VP1-VP4组升高14.54倍（P<0.001）,FMDV-VLPs组升高4.65倍（P<0.001）,抑制剂处理组升高3.53倍（P<0.001）。而比较各组用兔抗小鼠NF-κB1p105/p50抗体沉淀的NF-κB水平发现,单纯pMΦ组极显著低于OVA组（P<0.001）和VP1-VP4组（P<0.001）,显著低于FMDV-VLPs组（P<0.05）。OVA组极显著高于FMDV-VLPs组（P<0.01）和抑制剂处理组（P<0.001）。VP1-VP4组显著高于FMDV-VLPs组（P<0.05）,极显著高于抑制剂处理组（P<0.001）。结果表明,兔抗小鼠NF-κB1 p105/p50抗体可与NF-κB-TNF-α启动子复合物特异性结合,FMDV-VLPs和FMDV VP1-VP4均能刺激NF-κB活化进核并结合TNF-α启动子。VP1-VP4组NF-κB与TNF-α启动子的结合活性最高,其次是OVA和FMDV-VLPs。用VP1-VP4作为FMD疫苗抗原可能会加剧接种动物注射部位的组织炎症,而FMDV-VLPs可缓解接种动物注射部位的组织炎症。汉黄芩素通过抑制NF-κB与TNF-α启动子的结合活性降低TNF-α的表达,可抑制疫苗注射部位的炎症,减轻疫苗接种动物的痛苦。以上结果表明,肥大细胞可识别FMDV-VLPs,且能被刺激活化引起明显的脱颗粒。同时,被FMDV-VLPs活化的pMCs分泌的颗粒成分可促进脾总初始淋巴细胞增殖,而其分泌成分则抑制初始T淋巴细胞增殖。巨噬细胞也能识别FMDV-VLPs,并可通过抗原提呈作用启动淋巴细胞增殖,但需巨噬细胞与淋巴细胞直接接触;巨噬细胞分泌的TNF-α和其表面的SR所介导的生物学作用对脾脏免疫应答的建立具有促进作用。FMDV-VLPs和FMDV VP1-VP4刺激均可显著提高巨噬细胞NF-κB与TNF-α启动子的结合活性,但VP1-VP4刺激活化NF-κB与TNF-α启动子结合的作用强于FMDV-VLPs,这表明VP1-VP4刺激TNF-α产生的作用较强,可能会引起注射部位的炎症反应,而FMDV-VLPs较弱,不会引起炎症反应,可减轻接种疫苗的痛苦。汉黄芩素可通过抑制NF-κB的结合活性降低TNF-α,缓解疫苗注射部位的炎症,减轻疫苗接种动物的痛苦,故可用作口蹄疫疫苗的佐剂成分。

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摘要

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1 引言

1.1 口蹄疫的研究进展

1.1.1 口蹄疫病毒病原学

1.1.2 口蹄疫流行病学

1.1.3 口蹄疫疫苗研究进展

1.2 肥大细胞的研究进展

1.3 巨噬细胞的研究进展

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验试剂

2.2 主要的试验仪器和设备

2.3 本试验所用实验动物及试剂

2.3.1 实验动物

2.3.2 SDS-PAGE及 Western blot相关溶液

2.3.3 细胞培养用液

2.3.4 收集肥大细胞、巨噬细胞、脾淋巴细胞用液

2.3.5 抑制剂配制

2.3.6 ChIP试验用试剂

2.4 FMDV重组VP1-VP4 蛋白和FMDV-VLPs表达与鉴定

2.5 肥大细胞上清液对脾初始淋巴细胞增殖的影响

2.5.1 pMCs的收集

2.5.2 pMCs的处理

2.5.3 pMCs脱颗粒检测

2.5.4 小鼠脾淋巴细胞的收集

2.5.5 脾淋巴细胞增殖试验

2.6 巨噬细胞上清液对脾初始淋巴细胞增殖的影响

2.6.1 pMΦ收集

2.6.2 pMΦ处理

2.6.3 脾淋巴细胞增殖试验

2.7 染色质免疫共沉淀

2.7.1 pMΦ的处理

2.7.2 细胞交联

2.7.3 染色质酶切

2.7.4 超声波破细胞与DNA纯化

2.7.5 染色质免疫共沉淀

2.7.6 解交联

2.7.7 DNA纯化

2.7.8 PCR分析

2.7.9 荧光定量PCR分析分析染色质免疫共沉淀所捕获的TNF-α启动子

2.8 统计学处理

3 试验结果

3.1 FMDV重组蛋白表达、纯化和鉴定

3.2 pMCs对淋巴细胞增殖的调节作用

3.2.1 pMcs脱颗粒的形态学观察

3.2.2 pMCs上清液对脾初始淋巴细胞增殖的作用

3.3 pMΦ上清液对脾初始淋巴细胞增殖的作用

3.4 染色质免疫共沉淀

3.4.1 染色质酶切

3.4.2 普通PCR验证染色质免疫共沉淀捕获的DNA

3.4.3 荧光定量PCR分析染色质免疫共沉淀所捕获的DNA

3.4.4 各组巨噬细胞NF-κB结合TNF-α启动子水平

4 讨论

4.1 pMCs上清液对脾初始淋巴细胞的增殖作用

4.2 pMΦ上清液对脾初始淋巴细胞增殖的调节作用

4.3 各组巨噬细胞NF-κB结合TNF-α启动子水平

5 结论

参考文献

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作者简介

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 梁慧婷

导师: 王家鑫,李丽敏

关键词: 肥大细胞,巨噬细胞,口蹄疫病毒,病毒样颗粒

来源: 河北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河北农业大学

基金: 河北省高等学校科学技术研究重点项目的资助,项目名称:巨噬细胞清道夫受体介导对口蹄疫病毒样颗粒蛋白质组学的研究,项目编号:ZD2016063

分类号: S852.4

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