吴龙涛[1]2004年在《扇贝免疫相关因子基因的克隆与表达分析》文中指出贝类养殖是我国传统的海水养殖产业，在海水养殖中占有重要地位，是我国海水养殖和沿海地区经济发展的支柱性产业。但从1994年以来，养殖贝类陆续开始出现大规模死亡现象，死亡率高达80.0%，部分地区甚至绝产，经济损失十分惨重。养殖贝类的大规模流行性死亡是由多方面的因素造成的，是外界病原、环境因素和扇贝生物本身叁方面相互作用的结果。养殖贝类病害的不断爆发以及各种疾病病因的多样性迫切要求制定新的疾病防治措施，开发新型的抗菌物质或处理方法。目前围绕病原分离鉴定、改善养殖环境和优化养殖技术和优良养殖品种培育等方面已经开展了大量的研究工作，也提出了许多防病治病措施，收到了一定的成效。从扇贝本身的免疫防御因子入手，采用生化和分子生物学技术，筛选和克隆参与调控免疫防御的功能基因，一方面可以对这些基因实现体外大量表达，开发研制新型的具有抗微生物活性的多肽或蛋白，在扇贝养殖业上作为新型的病害预防治疗制剂，取代目前普遍使用的抗菌素和化学药物。另外可以根据抗病功能基因的结构以及这些基因在个体或群体感染后或环境胁迫条件下的表达情况，深入研究扇贝的防御抗病机制，探讨提高机体抗病力的方法和途径，并作为抗病良种选育的分子标记，指导扇贝的遗传改良和抗病品系的培育。这无疑是实现病害防治的新途径。本研究采取大规模的EST测序方法，结合cDNA末端快速扩增技术，直接从cDNA文库中分离、克隆获得了6个免疫防御相关因子基因的全长cDNA序列和6个免疫防御相关因子基因的部分序列，结果如下：获得了栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝热休克蛋白70基因的全长cDNA序列。这叁个HSP70的分子量在71.26~71.80之间，且均为酸性蛋白质。通过InterPro软件分析发现，在这叁个序列中均存在热休克蛋白家族的叁个签名序列，表明获得的是热休克蛋白70家族的成员。进一步的空间结构预测分析也表明，它们N端ATPase活性结构域、C端底物结合结构域与人HSP70的空间结构高度相似。
郭红军[2]2008年在《池蝶蚌与叁角帆蚌抗菌酶活性及免疫相关基因表达特性的研究》文中认为本研究对池蝶蚌酸性磷酸酶(ACP),碱性磷酸酶(ALP),过氧化氢酶(CAT),溶菌酶(LYZ)和酚氧化酶(PO)活力进行了研究,克隆了池蝶蚌和叁角帆蚌超氧化物歧化酶基因(SOD),过氧化氢酶基因(CAT),谷胱甘肽S转移酶基因(GST),肿瘤坏死因子基因(QM)和巨球蛋白基因(α_2-M),并对细菌感染后的表达和组织分布情况进行了研究。一.酶活力1.抗菌力结果表明,池蝶蚌对嗜水气单胞菌和枯草芽孢杆菌的抗菌力分别为0.83±0.01U和0.34±0.01U,叁角帆蚌对这两种细菌的抗菌力与之相比较弱,分别为0.57±0.03U和0.26±0.01U;两种蚌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均无抑制作用。2.池蝶蚌血清和血细胞中均能够检测到ACP和ALP活性,血清中的酶活性总体上高于血细胞(P＜0.05),不同年龄组血清或血细胞中酶活性均存在差异性(P＜0.05)。血清中的溶菌酶活性随着年龄的增长而显着增加,4龄组溶菌酶活力为0.93±0.05U,比1龄组约高一倍。血细胞中溶菌酶活性稳定在一定的水平内,均值为0.44U。血清中的CAT活性总体上强于血细胞,1龄池蝶蚌中血清的CAT活性约为血细胞中的2倍。血细胞的PO活性远远强于血清。二.基因克隆及表达特性研究1.本文分别克隆到了池蝶蚌和叁角帆蚌中GST部分cDNA序列,嗜水气单胞菌对池蝶蚌GST有诱导作用,而叁角帆蚌感染嗜水气单胞菌后基因表达量呈现先降低而后逐渐升高的趋势。GSTmRNA在蚌的肝组织中表达量较多。2.QM推导的氨基酸序列中含有一个蛋白酶C磷酸化位点(PKC)和一个核糖体蛋白L10的标签序列。1龄组QMmRNA表达量较少,2龄最高,3龄和4龄有所降低。细菌感染后,池蝶蚌中的QM mRNA表达先降低而后逐渐升高,而叁角帆蚌中表达量一直比较低,QMmRNA在唇瓣,斧足和肝脏中均有表达。3.不同年龄组CAT mRNA表达同CAT酶活力测定的结果相符。嗜水气单胞菌感染后的3小时,池蝶蚌CATmRNA表达量高于叁角帆蚌,蚌的11种组织中均检测到CAT mRNA,肾中表达较强。4.1龄和4龄样品中未检测到SOD mRNA,池蝶蚌感染后未检测到基因表达,叁角帆蚌中在感染后3小时和6小时检测到表达,SOD mRNA在这两种蚌的唇瓣和肾中均表达。5.不同年龄组池蝶蚌α_2-M mRNA随年龄逐渐下降,细菌感染后池蝶蚌α_2-M表达先降低后升高,而在叁角帆蚌始终维持很高的活性,只在部分池蝶蚌组织中检测到基因,而在叁角帆蚌的11种组织中均有表达,且血细胞中的表达量较高。
赵建民[3]2006年在《扇贝大防御素和G型溶菌酶的基因克隆与重组表达》文中进行了进一步梳理扇贝养殖是我国传统的海水养殖产业,但自1997年以来,养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,而且严重影响了该产业的健康发展。扇贝病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求制定新的疾病防治措施和开发新型的抗菌物质。从扇贝自身的免疫防御因子入手,筛选和克隆参与免疫防御的功能基因,一方面可以研究抗病功能基因在病原感染或环境胁迫条件下的表达规律,深入探讨扇贝的免疫防御机制,并可作为抗病良种选育的分子标记,指导扇贝的遗传改良和抗病品系的培育;另一方面,可对抗菌效应物实现重组表达,开发新型的病害预防治疗制剂,取代目前普遍使用的抗生素和化学药物。抗菌效应物是机体在免疫应答过程中产生的多肽类物质,对侵入生物体内的细菌、病毒具有很强的免疫杀灭作用,对抗菌效应物的研究有助于深入了解机体先天性免疫防御的机制。本研究采用大规模EST测序方法,结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从海湾扇贝血淋巴中克隆到了大防御素基因(big defensin, AiBD)的全长cDNA序列,该cDNA全长为531 bp,其中5'非编码区(UTR)为24 bp,开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)含有369 bp,编码122个氨基酸残基;随后为138-bp的3' UTR,包括一个多聚腺苷酸信号序列(AATAAA)和ploy A尾巴。分析表明,海湾扇贝大防御素是以前体的形式合成,前体分子包括信号肽、前域和成熟肽叁部分。采用Northern blot方法,以DIG标记的DNA探针检测了AiBD mRNA在不同组织中的表达。结果发现,AiBD基因的转录本主要在血淋巴中表达,在鳃中也有微量的表达,而在外套膜、闭壳肌、性腺及肝胰腺中检测不到杂交信号。采用QRT-PCR(quantitative real time PCR)对鳗弧菌感染后海湾扇贝血淋巴中AiBD mRNA的表达量进行了检测,结果发现在感染后8 h内, AiBD mRNA的相对表达量平缓升高;随着刺激时间的增长,AiBD基因的mRNA表达量急剧增加,在刺激后16 h和32 h分别达到了空白组的72.3倍和131.1倍。为了研究海湾扇贝大防御素的抗菌活性,将其成熟肽编码区克隆到毕赤酵母表达载体
宋小燕[4]2009年在《海湾扇贝凝集素基因和栉孔扇贝亲环素A基因的克隆与表达》文中指出扇贝养殖是我国传统的海水养殖产业,但自1997年以来,养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,而且严重影响了该产业的健康发展。然而,到目前为止,对病害发生的机制和病害控制的措施均未找到,为进一步深入研究扇贝免疫应答的分子机制,本研究通过采用大规模EST测序方法,结合cDNA末端快速扩增,实时荧光定量PCR及原核重组表达蛋白等技术,对海湾扇贝半乳凝素基因Gal1(galectin 1)、Gal2(galectin 2),C-型凝集素基因CTL3(C-type lectin 3),及栉孔扇贝亲环素A基因CypA(Cyclophilin A)进行了相关研究,为了解扇贝的免疫防御机制奠定了理论基础,主要研究结果如下:1.海湾扇贝Gal1、Gal2基因Gal1、Gal2基因的cDNA全长分别为2235、2137 bp,编码549、555个氨基酸,都含有4个半乳凝素的糖识别结构域。空间结构预测、多序列比对及进化分析表明它们是半乳凝素家族的新成员,属于多结构域的一类。在健康的海湾扇贝中,它们在所检测的组织中均表达,尤其在肝胰腺中表达最高。对200只海湾扇贝分别受到鳗弧菌、藤黄微球菌和毕赤酵母感染后,分析其时序表达情况,发现鳗弧菌和藤黄微球菌感染能诱导Gal1、Gal2在血淋巴中表达。同时,发现原核重组Gal2蛋白对大肠杆菌TOP10F’、鳗弧菌、河流弧菌、迟钝爱德华氏菌和藤黄微球菌具有凝集活性,而其凝菌活性可被含β-半乳糖苷的糖类所抑制。重组Gal2蛋白具有结合脂多糖的活性,在体外能促进海湾扇贝血细胞的包掩作用。2.海湾扇贝CTL3基因CTL3基因的cDNA全长为575 bp,编码157个氨基酸,N末端含有一段信号肽序列,并含有C-型凝集素的糖识别结构域。空间结构预测、多序列比对及进化分析发现该多肽具有标准长型C-型凝集素所必须的6个保守半胱氨酸和糖识别位点,是C-型凝集素家族的成员之一。在健康的海湾扇贝中,CTL3在所检测的组织中均表达,在肝胰腺中表达最高。对150只海湾扇贝分别受到鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后,分析了CTL3在血淋巴中的时序表达情况,发现这两种菌刺激海湾扇贝后能诱导CTL3的表达。3.栉孔扇贝CypA基因CypA基因的cDNA全长为1248 bp,编码164个氨基酸,含有肽基脯氨酰顺反异构酶结构域。通过多序列比对及进化分析发现栉孔扇贝CypA含有亲环素A家族蛋白的保守位点,与无脊椎动物的亲环素A最为接近,是亲环素A家族的一个新成员。在健康的栉孔扇贝中,CypA所检测的组织中均表达,尤其在性腺中表达最高。对150只栉孔扇贝受到鳗弧菌刺激后,分析了CypA在性腺和血淋巴中时序表达情况,发现CypA在性腺中能被鳗弧菌诱导表达。研究结果表明,海湾扇贝Gal1、Gal2和CTL3作为扇贝固有免疫中重要的模式识别受体参与了扇贝对外源微生物刺激的响应,栉孔扇贝CypA在其局部免疫系统中发挥着重要作用。研究结果丰富和发展了海水无脊椎动物免疫学的内容,对进一步了解扇贝固有免疫的机制,实现养殖扇贝疾病防治具有重要参考价值。
朱玲[5]2005年在《扇贝丝氨酸蛋白酶及其抑制剂基因的克隆与表达》文中指出扇贝是我国海水养殖的重要品种,但自1994年以来,养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,而且直接威胁到现有产业的生存和发展。引起扇贝大规模死亡原因是多方面的,其主要原因是养殖环境恶化、扇贝种质衰退和抗病力下降。因此,在积极调整产业结构、加强环境治理、开展扇贝病原及流行病学研究的同时,深入研究扇贝免疫防御机制,探讨提高机体抗病力的有效途径和方法,改良种质和培育抗病品系,无疑是解决目前困扰扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。丝氨酸蛋白酶及其抑制因子在无脊椎动物的免疫应答中起着核心作用,它们的协同作用不但直接导致免疫信号转导和级联放大,还可激活特异性防御体系,如黑化反应、血液凝结和抗菌肽的合成等。本研究采用大规模EST测序方法,结合cDNA末端快速扩增技术,直接从cDNA文库中分离、克隆了9个扇贝免疫相关的丝氨酸蛋白酶及其抑制剂基因的全长cDNA序列,应用Northern blotting和RT-PCR方法检测了这些基因的组织定位及在损伤和不同类型微生物感染下的表达规律。栉孔扇贝丝氨酸蛋白酶基因CFPS1和CFPS2的cDNA全长分别为1211-bp和1152-bp,分别编码354和336个氨基酸,均为具有信号肽执行胞外功能的分泌蛋白。两个基因结构相似,在成熟肽中,氨基端的clip结构域(clip domain)都由37个氨基酸残基组成,六个形成二硫键的保守半胱氨酸的排列顺序与大环卫素的半胱氨酸排列顺序相似。羧基端是典型起催化作用的丝氨酸蛋白酶结构域(Tryp_SPc domain),活性部位催化叁联体(H、D、S)和六个形成二硫键的半胱氨酸非常保守。两个结构域之间通过连接区域相连。CFPS1和CFPS2都以酶原形式存在,以类似于胰蛋白酶原激活方式被特异性的蛋白水解酶切。应用Northern blotting方法检测CFPS1和CFPS2基因在不同组织或器官中的表达发现,两个基因都主要在血细胞中表达。用RT-PCR检测CFPS1和CFPS2基因在损伤、不同类型微生物感染后的表达显示,损伤和鳗弧菌感染可以诱导CFPS1基因的表达,在两种刺激后16小时,CFPS1基因表达明显升高; 同样鳗弧菌感染也可以诱导CFPS2基因的表达,感染16小时后,CFPS2基因的表达也明显升高,但溶壁微球菌和巴氏毕赤酵母感染对CFPS2基因的表达差异不显着。
余允东[6]2007年在《栉孔扇贝CfLITAF基因的克隆与表达分析》文中进行了进一步梳理关于无脊椎动物中是否存在细胞因子一直都存在着异议。从细胞因子本身入手,运用细胞生物学和免疫学手段,已经在软体动物、节肢动物和棘皮动物等无脊椎动物中证实了高等动物细胞因子样活性物质的存在,然而利用分子生物学手段至今没有得到任何核苷酸或蛋白序列信息,而从与细胞因子相关的分子如调控其表达的转录因子入手来研究无脊椎动物中的细胞因子样物质的存在,或许会得到意想不到的惊喜。最近从人的单核细胞系THP-1中分离纯化出一种新型的转录因子,它可以被LPS诱导表达,产生的蛋白在TNF-α的表达过程中起着非常重要的作用,因而命名为LPS-induced TNF-αfactor(LITAF)。随后该基因在小鼠和鸡中也被克隆分离出来,其编码的蛋白已经证实在TNF-α的表达过程中起着不可或缺的作用。迄今为止,在无脊椎动物中还没有相关同源基因的报道。本研究采用大规模EST测序方法,结合锚定PCR技术从栉孔扇贝体内克隆到了高等动物LITAF基因的同源基因CfLITAF的全长cDNA序列。该cDNA全长为1240bp,其中5'非编码区(UTR)为112 bp;开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)包括450 bp,编码149个氨基酸残基,该多肽的理论分子量为16.08 kDa,等电点为6.77;3' UTR为678bp,包含一个poly A尾巴。SMART结构域预测发现CfLITAF蛋白含有一个保守的LITAF结构域。实时定量PCR检测CfLITAF基因在栉孔扇贝主要免疫器官中的表达分布情况,发现在所检测的六种组织血细胞、外套膜、肌肉、心、腮、性腺中均能检测到CfLITAF基因转录本的不同丰度的表达。血淋巴和肌肉中的表达量相差不大,而在心、外套膜、腮和性腺中的表达量要高于血淋巴和肌肉中的表达量,分别是血中表达量的2.45、2.82、9.23和24.93倍。为了验证其表达量是否会受到LPS的诱导,利用QRT-PCR(quantitative real time PCR)检测了CfLITAF基因在受到LPS和PGN刺激后在血细胞中的表达规律。结果如下:在LPS刺激后3h,CfLITAF的表达量显着上调,达到了原初水平的1.5倍,随着时间的延长,其表达量逐渐恢复到刺激前水平;在用PGN刺激血细胞后的9个小时内均没有检测到CfLITAF基因mRNA表达量的显着变化。实验中所用血细胞为同一批原代培养的栉孔扇贝血淋巴细胞,细胞活力通过台盼蓝拒染实验测定。CfLITAF基因的克隆与表达分析,不仅为进一步认识栉孔扇贝的免疫防御机制提供了实验参考,更重要的是为无脊椎动物中细胞因子样物质的研究提供了一个分子水平上的线索,为无脊椎动物中细胞因子样物质的研究奠定了理论基础。
岳峰[7]2013年在《栉孔扇贝免疫系统发生及母源免疫的初步研究》文中研究表明栉孔扇贝是我国重要的海水养殖优势品种之一。然而近年来养殖病害频发，特别是扇贝育苗期间苗种的病害问题，严重制约着扇贝养殖业健康持续的发展。从个体发育早期免疫系统入手，深入研究扇贝免疫系统发生与发育的调控过程及母源免疫的作用机制，探讨提高扇贝苗种免疫力的有效方法和途径，创新苗种养殖方式，是保障扇贝养殖业健康持续发展的重要途径。本论文以栉孔扇贝为研究对象，采用分子生物学和免疫学技术，分析了扇贝造血相关转录因子的结构和功能及其与免疫分子在扇贝早期发育中的时空表达模式，初步探讨了扇贝免疫系统发生过程；并研究了母源免疫分子的传递及传代免疫效应，揭示了母源免疫及其传代效应在扇贝发育早期免疫防御中的重要作用。1.栉孔扇贝造血相关转录因子结构和功能的鉴定与分析克隆获得栉孔扇贝造血相关转录因子CfRunt、CfCBFβ和CfGATA基因的cDNA序列。它们分别含有保守的runt同源结构域、CBF_beta结构域和两个ZnF_GATA锌指结构域，分别属于runx、CBFβ和GATA123家族成员。体外重组蛋白CfRunt和CfGATA均能与特异DNA基序相结合，而CfCBFβ能够显著促进CfRunt的DNA结合活性。鳗弧菌刺激后，栉孔扇贝循环血细胞数量在6h时显着下降至最低值，48h时与对照组差异不显着；而CfRunt和CfCBFβmRNA的表达分别于6-48h和6-96h显着上调，CfGATA mRNA表达于6-12h时显着下调。CfRunt和CfGATA基因干扰能够引起栉孔扇贝血细胞新生率和循环血细胞数量的显着下降。在CfRunt基因干扰后，LPS刺激能够显着诱导CfRunt mRNA表达，并且血细胞新生率及循环血细胞数量均显着升高；而CfGATA基因干扰后，LPS刺激未能引起CfGATA mRNA表达、血细胞新生率及循环血细胞数量的显着变化。以上研究结果表明造血相关转录因子CfRunt、CfCBFβ和CfGATA在扇贝血细胞生成中发挥重要作用。2.造血相关转录因子在个体早期发育中的时空表达及对菌刺激的响应模式在栉孔扇贝早期个体发育过程中，CfRunt和CfCBFβ mRNA的表达分别在32细胞期、D形幼虫期或面盘幼虫后期显着升高，而CfGATA mRNA表达在原肠期时达到最大值。整体免疫荧光定位研究发现CfRunt蛋白最早表达于32细胞期的整个胚胎中，随后其分布逐渐特化，分别位于桑葚胚的植物极细胞、原肠胚的中胚层和早期担轮幼虫的腹侧原担轮中。在担轮幼虫早期，CfRunt、CfCBFβ和CfGATA均出现于幼虫原担轮基部两侧对称细胞中。在D形幼虫期CfRunt和CfGATA主要分布于面盘基部两侧细胞，CfCBFβ在面盘基部的表达消失，而在幼虫背侧后部出现一个有造血相关转录因子较强表达的囊状区域。在面盘幼虫中期造血相关转录因子在面盘基部的表达均消失，主要表达于幼虫背侧后部的囊状区域中。鳗弧菌刺激后，担轮、D形和面盘后期幼虫中CfRunt和CfGATA mRNA的表达分别于6、12或24h时显着上调；而CfCBFβ在D形和面盘后期幼虫中的表达分别于12h时显着下调和上调。以上研究结果表明在早期个体发育过程中，扇贝可能经历了两次造血过程，分别发生在早期担轮幼虫原担轮基部的两侧对称细胞中和D形幼虫背侧后部的囊状区域。3.免疫分子在个体早期发育中的时空表达及对菌刺激的响应模式研究发现PRR分子（CfPGRP-S1、CfLGBP、CfLec-1和CfLec-3）和免疫效应分子（CfLYZ和CfLBP/BPI）mRNA分别于担轮幼虫期和D形幼虫期开始大量表达，在随后发育过程中均保持较高表达水平，而CfCu/Zn-SOD和CfCATmRNA表达水平均在面盘幼虫早期时显着升高。整体免疫荧光定位显示PRR和免疫效应分子的表达均最早出现于担轮幼虫原担轮基部的两侧对称细胞或D形幼虫面盘基部两侧细胞中。在面盘幼虫期各分子分布出现差异，PRR分子和CfLBP/BPI主要位于幼虫的面盘、口、食道或胃部，而CfLYZ、CfCAT和CfCu/Zn-SOD主要位于消化腺、胃或面盘中。鳗弧菌刺激后，担轮幼虫后期中免疫效应分子在6或12h时显着上调，在D形幼虫后期，除CfCAT外，其它免疫分子mRNA表达均显着上调或下调；在面盘幼虫后期，除CfLGBP显着下调外，其它免疫分子mRNA表达均在6或12h显着上调。说明在个体发育过程中，扇贝免疫系统最早形成于担轮幼虫原担轮基部的两侧对称细胞中，在D形幼虫时期逐渐发育，到面盘幼虫早期时其发育较为成熟，免疫分子功能性的分布在各个组织中，并具有较完善的免疫应答能力。4.母源免疫分子传递及传代免疫效应研究发现栉孔扇贝卵细胞中CfCu/Zn-SOD mRNA的表达水平最高，其它免疫分子（CfLBP/BPI、CfLGBP、CfLec-3和CfLYZ）mRNA水平相对较低。相比之下，除CfLec-3外，卵细胞中其它免疫分子的蛋白均有较高表达，其中CfCu/Zn-SOD蛋白含量最高。扇贝卵细胞蛋白提取液对大肠杆菌、鳗弧菌和酵母菌具有较明显的凝集和损伤作用，而对金黄色葡萄球菌无凝集和损伤作用。用灭活的鳗弧菌对亲贝进行免疫刺激后，除CfLGBP外，其它免疫分子的蛋白表达在扇贝子代卵细胞、胚胎或幼虫中均明显升高，且在卵细胞、4细胞和担轮幼虫期，母源免疫刺激组的抗菌活力和Cu/Zn-SOD活力显着高于相应对照组。鳗弧菌感染试验发现在担轮幼虫和D形幼虫期，母源免疫刺激组扇贝子代的死亡率均显着低于对照组。以上结果表明栉孔扇贝中存在母源免疫分子的传递及传代免疫效应，且它们在扇贝发育早期对病原入侵的免疫防御中发挥重要作用。综上所述，在个体发生过程中，栉孔扇贝经历两次造血过程，免疫系统在担轮幼虫期开始出现，至面盘幼虫早期发育较为成熟。在免疫系统发育成熟前，母源免疫在免疫防御中发挥重要作用。该研究结果为进一步阐明贝类免疫系统发生的调控机制提供线索，同时也为创新贝类苗种养殖方式提供了理论依据。
倪多娇[8]2007年在《栉孔扇贝抗氧化酶基因的克隆与表达分析》文中提出扇贝是我国海水养殖的重要品种,但自1994年以来,养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,而且直接威胁到现有产业的生存和发展。扇贝病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求制定新的疾病防治措施和开发新型的抗菌物质。因此,深入研究扇贝免疫防御机制,探讨提高机体抗病力的有效途径和方法,改良种质和培育抗病品系,无疑是解决目前困扰扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。抗氧化酶可以清除活性氧,是维持机体内氧环境平衡,抵抗外界环境影响的重要免疫因子。本研究采用大规模EST测序方法和同源克隆的方法,结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从栉孔扇贝中克隆到了超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPX)等抗氧化酶基因的全长cDNA序列,并对其基因结构进行了分析。同时,用实时定量PCR方法对这叁个基因在健康扇贝血淋巴细胞、肾、鳃、肌肉、性腺等组织和在分别用鳗弧菌,溶壁微球菌和假丝酵母处理扇贝后不同时间段的表达差异情况进行了研究。超氧化物歧化酶基因CfSOD的cDNA全长为1022 bp,其中开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)含有459 bp,编码153个氨基酸残基,无信号肽,为胞内蛋白。经BLASTP分析发现,CfSOD与其它动物具有较高的同源性。CfSOD中存在两个Cu/Zn-SOD的签名序列;另外Cu结合必须氨基酸(His-45,-47,-62和-119)和Zn结合必须氨基酸(His-62,-70,-79和Asp-82)在CfSOD中保守。实时定量PCR检测发现,CfSOD在鳃、血细胞和肾中有较高的表达。在鳗弧菌和溶壁微球菌刺激后,CfSOD的相对表达量逐渐下降,然后分别在32小时和16小时的时候恢复到刺激前的表达水平。在假丝酵母刺激后,CfSOD的mRNA表达没有显着差异。栉孔扇贝过氧化氢酶基因CfCAT的cDNA全长为3146 bp,其中开放阅读框含有1521bp,编码507个氨基酸残基,无信号肽,为胞内蛋白。经BLASTP分析发现,CfCAT与其它动物具有较高的同源性。CfCAT中存在过氧化氢酶近端活性位点和过氧化氢酶近端血红素配体签名序列,另外存在两个糖基化位点NFS和NFT,同时在CfCAT的C末端存在过氧化物酶体定位信号AQL,为典型过氧化氢酶。实时定量PCR检测发现,健康的扇贝中CfCAT在鳃和性腺中有较高的表达。CfCAT基因在鳗弧菌刺后表达升高,在4小时达到最高,约是刺激前表达量的6.8倍(P<0.05),后随着时间的变化而逐渐下降。在8小时表达量达到为刺激前表达量的1.3倍(P<0.05),在16和32小时略高于刺激前的水平。在溶壁微球菌刺激后CfCAT基因表达量也呈上升趋势,在刺激后4小时达到刺激前表达量的约2倍,然后有所下降,在16小时又上升到刺激前表达量的2.9倍。CfCAT基因在假丝酵母刺激后的表达略有升高,4小时约是刺激前的1.2倍(P<0.05),在其他时间段变化不明显。栉孔扇贝谷胱甘肽过氧化物酶基因CfGPX的cDNA全长为1290 bp,其中开放阅读框含有705bp,编码235个氨基酸残基,有一个24核苷酸的信号肽序列。经BLASTP分析发现,CfSOD与其它动物具有较高的同源性。CfGPX中发现谷胱甘肽过氧化物酶活性位点的签名序列,另外发现硒半胱氨酸和硒半胱氨酸插入序列,为含硒型谷胱甘肽过氧化物酶。实时定量PCR检测发现,未经处理的扇贝中CfGPX在性腺、肌肉、血和肾中有较高的表达。CfGPX基因在鳗弧菌刺后表达量快速上升,在6小时的时候表达量达到最高,为刺激前的4.0倍(P>0.05),后随着时间的变化而逐渐下降。在溶壁微球菌刺激后CfGPX在前6小时表达略有降低,在6小时的时候表达量为刺激前的0.5倍(P<0.05),后随着时间的变化而逐渐升高。在16小时的时候表达量为刺激前的2.1倍(P<0.05)。在假丝酵母刺激后, CfGPX的表达量略有下降在8小时的时候表达量为刺激前的0.8倍(P<0.05)。实验证明栉孔扇贝的超氧化物歧化酶基因CfSOD,过氧化氢酶基因CfCAT,谷胱甘肽过氧化物酶基因CfGPX基因在机体抵抗外界微生物刺激中起到了重要的作用。
冯冰冰[9]2011年在《缢蛏肝胰脏cDNA文库构建和免疫相关基因的克隆与表达研究》文中认为缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)是我国重要的滩涂经济贝类,与牡蛎、蛤仔、泥蚶一起号称我国“四大养殖贝类”。但是近年来,缢蛏病害经常出现,大批死亡现象时有发生,提高缢蛏抗病能力是减少缢蛏病害发生的重要途径。本研究构建和分析了缢蛏肝胰脏cDNA文库,筛选了免疫相关基因,应用RACE技术以及长PCR技术获得了免疫相关基因cDNA和DNA全长,利用实时荧光定量PCR技术分析了基因的组织表达以及细菌诱导后的时间表达,以期获得缢蛏的免疫候选基因,为缢蛏抗病新药开发、抗病新品种选育等工作奠定基础。1.采用DNS酶均一化处理技术,构建缢蛏肝胰脏cDNA文库,共获得5296个ESTs序列,经拼接后获得了4013个单一基因(Unigene),其中包括540个重迭群(Contig)和3473个单一序列(Singleton)。通过BLAST分析,79.3%序列为未知基因,20.7%序列为已知功能基因,其中43条序列是免疫相关基因。根据其功能,这些免疫相关基因可被分为5类,即20个蛋白酶和蛋白酶调节子基因、6个粘着蛋白基因、3个压力蛋白基因、3个抗菌肽基因、6个溶酶体酶基因和5个信号转导基因。2.从文库中筛选出2条β-actin同源序列,分别命名为β-ACTIN 1和β-ACTIN 2,cDNA全长分别为1552 bp和1454 bp,均含有1131 bp的开放阅读框,同时通过同源克隆技术获得缢蛏18S rRNA基因。比较分析了18S rRNA,β-ACTIN 1和β-ACTIN 2基因的组织表达(水管、鳃、斧足、外套膜、肝胰脏和性腺)稳定性,发现18S rRNA基因最稳定,适合作为内参基因。以18S rRNA基因为内参基因,组织表达及鳗弧菌诱导后的时间表达分析结果显示,2个β-actin基因的表达出现了显着变化,表明2个β-actin基因不适合作为内参基因。3.从文库中获得2条与C型凝集素同源序列,cDNA全长分别为644 bp和1659 bp,分别命名为ScCTL-1和ScCTL-2。ScCTL-1为标准长型C型凝集素,ScCTL-2为紧凑型C型凝集素,二者均具有1个糖识别结构域(CRD)。荧光定量PCR检测结果显示,经鳗弧菌和副溶血弧菌诱导后,缢蛏ScCTL-1和ScCTL-2 mRNA在不同组织中的时间表达谱变化趋势不同,表明2个C型凝集素具有不同的功能。4.从文库中筛选出一条与半乳糖凝集素(Galectins)同源序列,cDNA全长为1278 bp,具有识别半乳糖凝集素的特异性序列(H-NRP, WG-EE),命名为Sc-Galectin。预测蛋白包含2个串联的CRDs蛋白结构域,是一个串联重复型半乳糖凝集素。组织表达结果表明,Sc-Galectin mRNA在肝胰脏的表达量显着高于其他组织。经鳗弧菌处理8 h和48 h后,在6个组织中,缢蛏Sc-Galectin mRNA的表达均显着上调,经副溶血弧菌和鳗弧菌分别处理72 h和20 h后,在6个组织中,缢蛏Sc-Galectin mRNA的表达均显着下调并达到最大值。5.从文库中筛选出一条补体(Clq)同源序列,cDNA全长为712 bp,命名为ScC1q。预测蛋白包含一个18个氨基酸的信号肽和一个136个氨基酸的C1q结构域。组织表达结果表明,ScC1q mRNA在肝胰脏的表达量显着高于其他组织。经鳗弧菌和副溶血弧菌诱导后,缢蛏ScC1q mRNA在6个组织中的表达水平均出现显着上调和下调,其中在水管、鳃、斧足、外套膜和性腺中的表达变化的趋势比较明显。6.从文库中筛选出一条铁蛋白(ferritin)同源序列,cDNA全长为1106 bp,命名为ScFERs。预测蛋白包含一个高度保守的铁氧化活性中心结构域,该结构域由7个与脊椎动物H型铁蛋白完全一致的氨基酸残基组成,但是在5′非编码区缺失铁调节区域(IRE)。组织表达结果表明,ScFERs mRNA在肝胰脏的表达量显着高于其他组织。经鳗弧菌和副溶血弧菌诱导后,ScFERs mRNA在6个组织中的表达水平均出现显着上调和下调,其中在外套膜、斧足和性腺中的表达变化的趋势比较明显。7.从文库中筛选出一条热休克蛋白70(HSP70)同源序列,cDNA全长为2335 bp,是细胞质中的结构型HSC70亚家族基因成员,被命名为Sc-Hsc70。组织表达分析结果显示,ScHsc70 mRNA在外套膜中的表达量最低,而在水管中的表达量最高。经鳗弧菌和副溶血弧菌诱导后,ScHsc70 mRNA在缢蛏肝胰脏组织的表达水平呈上调趋势,且分别在20 h和30 h后达到最大。结果表明缢蛏ScHsc70基因可能在介导细菌诱导引起的免疫应答中起到重要作用。8.从文库中筛选出一条小热休克蛋白(sHSP)同源序列,cDNA全长为1220 bp,该基因的氨基酸序列具有典型的小热休克蛋白家族的特征结构:α-晶体蛋白(α-crystallin)结构域,被命名为Sc-sHSP。组织表达结果表明,Sc-sHSP mRNA在肝胰脏的表达量显着高于其他组织。经鳗弧菌和副溶血弧菌诱导后,Sc-sHSP mRNA在肝胰脏组织的表达水平呈上调趋势,且均在20 h后达到最大,结果表明Sc-sHSP基因可能在介导细菌诱导引起的免疫应答中起到重要作用。
高强[10]2007年在《栉孔扇贝与海湾扇贝免疫学比较研究》文中研究指明扇贝是我国重要的海水养殖品种,但自1997年以来,养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡,不但造成了巨大的经济损失,而且直接威胁到现有产业的生存和发展。引起扇贝大规模死亡原因是多方面的,其主要原因是病原滋生、养殖环境恶化和种质衰退。因此,深入研究扇贝免疫防御机制,探讨提高机体抗病力的有效途径和方法,改良种质和培育抗病品系,促进我国扇贝养殖业的健康、可持续发展。本文通过比较栉孔扇贝和海湾扇贝正常状态和重金属污染胁迫下相关免疫指标的变化及HSP70和HSP90在重金属胁迫后表达规律,以期更好的了解贝类的防御机制,为扇贝病害防治提供资料。本研究采用流式细胞仪技术对栉孔扇贝和海湾扇贝血细胞死亡率、细胞吞噬率和呼吸爆发进行了测定,发现正常状态下两种扇贝的细胞死亡率相差不大,呼吸爆发的基础值相差也不大,而海湾扇贝细胞吞噬率显着高于栉孔扇贝。在血淋巴和肝胰腺中,海湾扇贝SOD、ACP酶活性均显着高于栉孔扇贝;海湾扇贝的MDA含量也高于栉孔扇贝,但差异不显着。鳗弧菌感染实验发现,海湾扇贝累积死亡率远低于栉孔扇贝。上述结果表明,海湾扇贝对细菌等异物的吞噬和杀灭能力以及机体自身的抗氧化能力高于栉孔扇贝,这为海湾扇贝比栉孔扇贝具有更高的抗逆性提供了证据。不同浓度Pb2+刺激后,海湾扇贝血细胞的死亡率明显低于栉孔扇贝。海湾扇贝细胞吞噬率和呼吸爆发均高于栉孔扇贝。对两种扇贝体液免疫指标的测定发现,海湾扇贝的SOD、ACP活性和MDA含量均高于栉孔扇贝。结果表明,在Pb2+刺激下两种扇贝都处于重金属氧化胁迫下,其免疫系统均受到了影响,但相同剂量的Pb2+对两种扇贝的毒害程度不同,海湾扇贝受到的影响要低于栉孔扇贝。采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从海湾扇贝血淋巴中克隆到了热休克蛋白90(AiHSP90)基因。AiHSP90的cDNA序列全长为2669bp,其中5'非编码区(UTR)为90bp,3' UTR为44bp,开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)包括2175bp,2524-2528位AATAA为推测的AiHSP90基因的mRNA多聚腺苷酸加尾信号(Polyadenylation Signal)。开放阅读框编码724个氨基酸残基,推测的理论分子量为83.08 kDa,等电点为4.81。利用荧光实时定量PCR技术检测了AiHSP90基因在革兰氏阴性菌鳗弧菌和革兰氏阳性菌藤黄微球菌感染后不同时间点相对于β-actin基因的表达。在鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后,除72h外AiHSP90均上调表达,在9h其mRNA表达达到最大值,分别约为空白组的6.8倍和3倍;随后随着时间的推移,其表达下降,在48h恢复到接近空白组的水平;到72h时降到最低点。鳗弧菌对AiHSP90的诱导比藤黄微球菌要高,这也反映出鳗弧菌对海湾扇贝有更强的毒力,诱导的HSP90表达也更强。本研究首次揭示出在软体动物中HSP90在细菌感染条件下的表达情况,结果表明海湾扇贝AiHSP90参与了机体对细菌感染的应答。采用荧光实时定量PCR技术,对栉孔扇贝和海湾扇贝在不同浓度、不同种类重金属胁迫后HSP70和HSP90基因表达规律进行了比较。结果显示,镉和铅对栉孔扇贝处理10天后即诱导HSP70以较高水平表达,20天后镉处理组HSP70恢复到与对照接近的水平,而在铅处理组也呈现出下降的趋势。而海湾扇贝HSP70基因表达与栉孔扇贝恰好相反,处理20天后其HSP70表达才出现较高水平。铜离子处理对诱导两种扇贝HSP70的影响相似,对栉孔扇贝HSP70的诱导强度更大。对于同一种重金属,不同的浓度诱导的HSP70表达也各不相同。而对于HSP90,海湾扇贝在受到叁种重金属刺激后HSP90的表达量均高于栉孔扇贝,而且长时间的刺激(20天)诱导了更高的HSP90基因表达。不同的浓度的同一种重金属离子诱导的HSP90表达也各不相同。这些结果表明,在重金属胁迫下HSP70以及HSP90在栉孔扇贝和海湾扇贝中均表现出不同的应答方式。结合前面海湾扇贝抗逆性较强的综合结果,两种扇贝热休克蛋白基因表达的比较提示我们栉孔扇贝HSP70的激烈反应预示着抗逆能力的不足,而海湾扇贝HSP90的高表达却预示着更强的抗逆能力,有待于更多应激实验如热刺激、病原刺激等的进一步验证。
参考文献：
[1]. 扇贝免疫相关因子基因的克隆与表达分析[D]. 吴龙涛. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2004
[2]. 池蝶蚌与叁角帆蚌抗菌酶活性及免疫相关基因表达特性的研究[D]. 郭红军. 南昌大学. 2008
[3]. 扇贝大防御素和G型溶菌酶的基因克隆与重组表达[D]. 赵建民. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2006
[4]. 海湾扇贝凝集素基因和栉孔扇贝亲环素A基因的克隆与表达[D]. 宋小燕. 西北农林科技大学. 2009
[5]. 扇贝丝氨酸蛋白酶及其抑制剂基因的克隆与表达[D]. 朱玲. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2005
[6]. 栉孔扇贝CfLITAF基因的克隆与表达分析[D]. 余允东. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2007
[7]. 栉孔扇贝免疫系统发生及母源免疫的初步研究[D]. 岳峰. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2013
[8]. 栉孔扇贝抗氧化酶基因的克隆与表达分析[D]. 倪多娇. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2007
[9]. 缢蛏肝胰脏cDNA文库构建和免疫相关基因的克隆与表达研究[D]. 冯冰冰. 上海海洋大学. 2011
[10]. 栉孔扇贝与海湾扇贝免疫学比较研究[D]. 高强. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2007