论文摘要
大肠杆菌 Nissle1917（E.coliNissle 1917,EcN 1917）是食品与药物应用中常见的一种肠道益生菌。与常规大肠杆菌相比,在治疗胃肠道疾病方面有重要活性或应用。本文以EcN 1917为对象,通过基因组毒素-抗毒素系统（Toxin-antitoxin system,TA）预测、序列比较以及基因结构生物信息学分析毒素-抗毒素基因的结构功能。通过毒素-抗毒素基因在E.coliBL21中的异源表达以及在EcN 1917中的原位敲低（knockdown）,阐释了毒素-抗毒素基因和hipA对EcN 1917生物膜以及持留细胞形成的影响。生物信息学分析表明,EcN 1917基因组含有10对毒素-抗毒素系统,多数为Type 11。软件预测基因序列（52351-52901bP,命名为PP00551）这段序列为假定mazEF序列且得分最高。经进一步基因克隆及测序,EcN 1917中PP00551序列大小为551bp,PP00240（mazE）序列在PP0024（mazF）相邻的上游,中间仅隔CG两个碱基,共用一个启动子,为典型的双顺反子结构基因结构;且PP00551基因序列与其它非益生性大肠杆菌的mazEF的基因序列结构完全一致。目标在大肠杆菌BL21克隆表达试验结果（生长曲线和平板点样生长）也表明,其基因产物活性完全符合Type Ⅱ TA系统特片。因此,我们确定PP00551序列为mazEF毒素-抗毒素系统,并将其命名为mazEF-EcN。通过其读码框上下游基因比较分析,发现mazEFEcN与其他的大肠杆菌mazEF的侧翼基因结构完全相同,可推断mazEF在大肠杆菌种水平的高保守性及水平遗传进化属性。为进一步探索TA系统对于EcN 1917益生特性的调控机制,在此我们采用CRISPRi技术进行了原位敲低试验。依据mazEF,hipA基因序列,采用CRISPRdirect设计并合成gRNA片段,与载体连接后构建了转化质粒;再分别引入mazEF-gsRNA/dCas9和hipA-gsRNA/dCas9质粒。EcN 1917转化子EcN-AmazE与EcN-△hipA经诱导后,RT-PCR检测及PAGE试验结果表明mazEF及hipA的表达都分别被抑制。与之同时,EcN 1917持留和生物膜形成都显著降下。当除去诱导剂后,mazEF及hipA的表达恢复正常。相比常规基因敲除与回补试验过程,CRISPRi技术大大简化了操作过程,可快速实现基因表达与原位敲低比较,为研究EcN 1917的TA生理功能提供了一种十分有价值的工作思路;此外,mazEF及hipA对EcN 1917持留和生物膜的调控为此后开发EcN 1917的益生特征,尤其是提高其在肠道中的存活和粘附能力,具有重要的指导意义。
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摘要Abstract第一章 前言 1.1 大肠杆菌Nissle 1917（Escherichia coli Nissle 1917）研究简述 1.1.1 益生EcN 1917的发现及分类学特征 1.1.2 EcN 1917的益生机制 1.1.3 EcN 1917的应用 1.1.4 EcN 1917在肠道中的定殖 1.2 大肠杆菌的毒素-抗毒素系统 1.2.1 大肠杆菌毒素-抗毒素系统的分类功能 1.2.2 大肠杆菌毒素-抗毒素系统影响生物膜形成 1.2.3 大肠杆菌TA系统影响持留形成 1.3 关于mazEF和hipAB的研究 1.3.1 mazEF基因结构与功能 1.3.2 hipA基因结构与功能 1.4 CRISPRi技术 1.4.1 CRISPR/Cas技术的研究 1.4.2 CRISPRi（CRISPR/dCas9）技术 1.5 本文主要研究问题、技术路线及意义 1.5.1 问题的提出及研究价值 1.5.2 选择技术路线第二章 大肠杆菌Nissle 1917 mazEF基因结构与活性研究 2.1 引言 2.2 实验材料与方法 2.2.1 实验材料 2.2.1.1 菌种与培养基 2.2.1.2 药品与耗材 2.2.1.3 仪器与设备 2.2.1.4 引物与质粒 2.2.2 实验方法 2.2.2.1 EcN 1917的活化培养 2.2.2.2 EcN 1917中TA系统预测 2.2.2.3 Escherichia coli Nissle 1917中mazEF基因生物信息学分析 2.2.2.4 mazEF基因克隆 2.2.2.5 mazEF基因与质粒的双酶切 2.2.2.6 mazE基因和质粒pETDuet-1的双酶切 2.2.2.7 mazEF基因与质粒的连接 2.2.2.8. mazE基因片段以及重组质粒pEmT的双酶切 2.2.2.9 重组质粒pEmTA的构建 2.2.2.10 pEmT、pEmA、pEmTA质粒的转化验证 （1） 感受态细胞的制作:使用（Competent cell Preparation Kit,takara）试剂盒根据它的使用方法制作大肠杆菌DH5α以及BL21的感受态细胞。 （2） 质粒的转化 2.2.2.11 重组质粒的验证 2.2.2.12 重组质粒的表达 2.2.2.13 重组质粒pEmT、pEmA、pEmTA生长曲线测定 2.2.2.14 重组质粒pEmT、pEmA、pEmTA平板点样 2.3 结果与讨论 2.3.1 EcN 1917中TA系统分布 2.3.2 mazEF基因序列比对以及结构分析 2.3.3 重组质粒pEmT、pEmA、pEmTA构建及筛选 2.3.4 重组质粒pEmT、pEmA、pEmTA在E.coli BL21中表达 2.4 本章小结第三章 E.coli Nissle 1917 mazEF与hipA基因原位敲低 3.1 引言 3.2 实验材料与方法 3.2.1 实验材料 3.2.1.1 出发质粒 3.2.1.2 试剂与器材 3.2.1.3 引物与菌株 3.2.2 实验方法 3.2.2.1 技术路线 3.2.2.2 sgRNA序列设计 3.2.2.3 sgRNA质粒构建 3.2.2.4 质粒转化 3.2.2.5 重组质粒在E.coli Nissle 1917中诱导表达 3.2.2.6 提取总RNA 3.2.2.7 RT-PCR 3.3 结果与讨论 3.3.1 sgRNA-mazE,sgRNA-hipA序列设计克隆与构建 3.3.2 ppgRmA与ppgRmh质粒构建与筛选 3.3.3 RT-PCR检测mazEF和hipA原位敲低 3.4 本章小结第四章 原位敲低mazEF和hipA基因探索其对持留以及生物膜的影响 4.1 引言 4.2 实验材料与方法 4.2.1 实验材料 4.2.2 实验方法 4.2.2.1 生物膜形成测定 4.2.2.2 持留细胞生长测定 4.3 结果与讨论 4.3.1 mazEF与hipA沉默表达后菌株生长情况 4.3.2 mazEF与hipA沉默表达后对生物膜生长的影响 4.3.3 mazEF与hipA原位敲低后对持留菌形成的影响 4.3.3.1 酶法探究mazEF与hipA原位敲低后对持留细胞形成的影响 4.3.3.2 抗生素法探究mazEF原位敲低后对持留菌形成的影响 4.4 本章小结结论与展望 结论 展望参考文献附录一 pEmT基因测序附录二 pEmA测序附录三 pEmTA测序致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 李品毅
导师: 梁新乐
关键词: 大肠杆菌,毒素抗毒素系统
来源: 浙江工商大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,轻工业手工业
单位: 浙江工商大学
分类号: TS201.3
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标签：大肠杆菌论文; 毒素抗毒素系统论文;
采用CRISPRi原位探索大肠杆菌Nissle 1917毒素-抗毒素功能研究
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