彭丽[1]2006年在《噬菌体D29在结核病诊断和治疗中的应用》文中认为目的有效控制结核病的传播需要快速诊断结核病,并根据药物敏感性试验结果制定合理有效的化疗方案。利用噬菌体D29建立噬菌体生物扩增法,用于检测标本中的结核分枝杆菌以及对RFP、INH的敏感性,与传统方法和分子生物学方法进行比较,评价其在我国的临床应用价值。面对耐药结核病的严峻疫情,噬菌体作为一种能专性寄生于分枝杆菌的病毒,具有潜在的药用价值。本研究旨在观察噬菌体D29在体外、体内环境下对结核分枝杆菌的作用,探讨其能否成为一种治疗结核病的新药。方法1.对噬菌体D29的大小、形态、增殖周期、保存条件等生物学特性进行系统研究,研制噬菌体生物学扩增法快速诊断结核病的试剂盒,并用模拟临床标本对其进行评价。2.应用噬菌体生物扩增法检测52株结核分枝杆菌临床株对RFP、INH的敏感性,与比例法和DNA序列分析法进行比较,以评价分析噬菌体生物扩增法在检测结核分枝杆菌药物敏感性方面的临床应用价值。3.已感染分枝杆菌的小鼠腹腔巨噬细胞随机分为生理盐水组、噬菌体高、中、低剂量组,分别加入生理盐水和不同剂量的噬菌体D29,在24h或48h后对巨噬细胞内的分枝杆菌活菌数量进行测定,并在电子显微镜下观察巨噬细胞内分枝杆菌在噬菌体感染前后的细胞改变。4.采用皮下攻击法分别建立结核分枝杆菌敏感株豚鼠结核病模型和耐药菌株豚鼠结核病模型,感染成功(PPD皮试转阳)后动物被随机分为对照组、RFP治疗组、噬菌体组和(或)联合化疗组,每组8～16只。分别给予不治疗、RFP 25mg/kg灌胃、噬菌体D29 108 PFU/0.5ml滴鼻、RFP 15 mg/kg +EMB 25 mg/kg + PZA 25 mg/kg +LVFX 6 mg/kg灌胃,每周3次,隔日给药。在治疗中观察动物的活动、体重变化;治疗4周和7周后,每组取3～11只豚鼠进行解剖,进行以下指标观察和检定:①动物一般情况;②脏器肉眼病变程度;③脏器重量指数;④脏器病理组织学检查;⑤肺脏和脾脏结核分枝杆菌的定量培养;⑥并在治疗前、治疗后的不同时间点采取血清,测定血清中噬菌体中和抗体的滴度;⑦ELISA法检测血清IL-2、IL-4、IFN-γ含量。结果1.噬菌体D29是一种裂解性分枝杆菌噬菌体,病毒颗粒呈类圆形,在75～150 nm之间。宿主菌包括耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌,在耻垢分枝杆菌中的增殖周期为90～180 min,在结核分枝杆菌中的增殖周期为3～6 h以上。2.噬菌体以液体形式4℃保存无论采用何种保护剂,28周后噬菌体效价下降低于101。-70℃液体保存和冷冻干燥法4℃、室温、37℃保存,依据不同保护剂保存效果相差较大。其中采用无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作为保护剂,冻干后室温或4℃保存时,28周内效价仅下降101,较为理想。3.噬菌体生物扩增法(PhaB法)能鉴别结核分枝杆菌与呼吸道常见的其它致病菌。与改良L-J培养法相比,PhaB法检测痰标本中结核分枝杆菌的敏感度、特异度和符合率分别为86.2%、66.7%、84.4%,在48～72h内出结果。PhaB法检测标本中结核分枝杆菌的最低检出菌量约100 CFU(相当于100条菌/ml),可检测标本中微量结核分枝杆菌。4.以传统改良L-J比例法药敏结果作为金标准,PhaB法检测结核分枝杆菌RFP耐药性的敏感度为94.1%,特异度为94.4%,符合率为94.2%;PhaB法检测INH耐药性的敏感度为92.1%,特异度为78.6%,符合率为88.5%。DNA序列分析法检测RFP耐药性的敏感度、特异度、符合率分别为82.4%、100%、88.5%; DNA序列分析法检测INH耐药性的敏感度、特异度、符合率分别为85.7%、100%、88.5%。5.已感染耻垢分枝杆菌的巨噬细胞在吞噬噬菌体D29 24 h后,噬菌体高、中剂量组的巨噬细胞内活菌数量显着低于生理盐水对照组(p<0.05),噬菌体低剂量组低于对照组(p >0.05)。电镜下可见噬菌体D29感染巨噬细胞内的耻垢分枝杆菌,并合成子代噬菌体,裂解耻垢分枝杆菌。噬菌体D29对巨噬细胞内的耻垢分枝杆菌有明显裂解作用。6.已感染结核分枝杆菌的巨噬细胞在吞噬噬菌体D29 24 h、48 h后,噬菌体高、中剂量组的巨噬细胞内活菌数量均显着低于生理盐水对照组(p<0.05),噬菌体低剂量组低于对照组(p>0.05),各组24 h活菌数量高于48 h活菌数量。表明噬菌体D29对巨噬细胞内结核分枝杆菌有较强的裂解抑制作用。7.采用噬菌体、RFP治疗4周后敏感菌株豚鼠结核病模型的脏器病变指数显着低于对照组(p<0.05),噬菌体组的肺脏荷菌量显着低于对照组(p<0.05),RFP组的肺脏荷菌量低于对照组(p>0.05)。7周后,噬菌体组的脾脏荷菌量显着低于对照组(p<0.05),RFP组与对照组没有统计学差异(p>0.05)。病理组织学结果显示:敏感菌株结核病模型噬菌体组豚鼠的肺脏以纤维化为主;脾脏很少有干酪样坏死,以增生结节为主。对照组肺脏见大量Langhans细胞,以增生结节为主;脾脏较多干酪样坏死。表明噬菌体D29对结核病模型有治疗作用。8.敏感菌株结核病模型采用RFP或噬菌体治疗4周后,血清中IL-2含量高于对照组,但没有显着性差异(p>0.05);耐药菌株结核病模型中RFP组、噬菌体组和联合化疗组的IL-2含量均高于对照组,其中噬菌体组含量最高,有统计学意义(p<0.05)。各组的IL-4、IFN-γ含量均无显著性差异。表明噬菌体D29可能有增强豚鼠的细胞免疫功能的作用。9.噬菌体治疗前豚鼠的血清中无噬菌体中和抗体,治疗18天后开始产生,滴度随着治疗时间的延长而增加。10. RFP组、联合化疗组豚鼠在开始治疗的前期(4周内),活动、进食量明显低于对照组和噬菌体组,其中耐药结核病的联合化疗组死亡2只,RFP组死亡1只。RFP组、联合化疗组在给药4周后的体重增长量显着低于对照组(p<0.05),噬菌体组与对照组没有差异(p>0.05)。RFP组和联合化疗组的病理组织学检查存在肝内胆红素沉积,噬菌体组不存在任何结核病以外的其他病变。表明噬菌体治疗不影响动物的生长发育,无毒副作用,较为安全。结论1.噬菌体生产、保存方便,PhaB法可在48 h内快速检测标本中的结核分枝杆菌活菌,并且具有以试剂盒形式进行商业化生产的可行性,价廉、操作方便,有助于临床结核病的快速诊断。2. PhaB法是一种操作简便、快速、敏感、与比例法符合率高的药敏试验方法,在48～72h内可获知结核分枝杆菌的药敏结果,费用明显低于同样具有快速、敏感性高特点的分子生物学方法,在我国较分子生物学方法更具有良好的广泛临床应用前景。3.噬菌体D29可以减少体外生长的巨噬细胞内的耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的活菌数量,证实具有杀灭巨噬细胞内宿主菌的能力,具有治疗结核病的可能。4.噬菌体D29可减轻结核病豚鼠的脏器病变程度和脏器荷菌量,具有与RFP接近,甚至更好的疗效,对豚鼠没有副作用,有希望作为新型抗结核药物的开发对象。5.噬菌体可刺激豚鼠产生噬菌体中和抗体,降低噬菌体D29杀灭结核分枝杆菌的作用。但也可上调机体的细胞免疫功能,增强其抗结核病的能力。6.综上所述,利用噬菌体D29建立的PhaB法可快速诊断结核病,并为临床提供可靠的药敏试验结果,以便及时制定合理、有效的化疗方案,减少耐药结核病的传播。噬菌体D29还具有成为一种新型抗结核药物的可能,本研究为进一步开发噬菌体提供了实验依据,但在给药系统方面还应进行改进,以便获得更佳的疗效。
韩喜琴[2]2004年在《噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌药物敏感性研究及评价》文中研究指明目的 利用表型鉴定法噬菌体生物扩增法(Phage Amplified Biologically Assay,PhaB Assay)检测结核分枝杆菌的耐药性，评价该方法用于检测结核分枝杆菌耐药性的应用价值。方法 (1)本研究应用PhaB法检测90株结核分枝杆菌异烟肼耐药株，62株异烟肼敏感株；91株结核分枝杆菌利福平耐药株，50株利福平敏感株；75株结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株，58株氧氟沙星敏感株的药物敏感性，每次试验都以H37Rv作为阴性对照。(2)对91株利福平耐药株(其中82株为MDR-TB)，42株利福平敏感株；75株氧氟沙星耐药株，40株氧氟沙星敏感株均进行DNA序列分析法、PCR-SSCP和PhaB药敏试验方法的分析，以资分析与评价PhaB法的临床应用价值。结果 (1)以绝对浓度法药敏试验结果为标准检测异烟肼药物敏感性PhaB法的符合率为93％(141／152)，敏感度为(即检测耐药性的能力)为92％(83／90)，特异度(即检测敏感性能力)为94％(58／62)；检测RFP的药物敏感性PhaB法的符合率为93％(131／141)，敏感度为92％(84／91)，特异度为94％(47／50)；检测OFLX的药物敏感性PhaB法的符合率为94％(125／133)，敏感度为95％(71／75)，特异度为93％(54／58)。(2)以绝对浓度法药敏试验结果为标准，检测133株结核分枝杆菌(其中91株为RFP耐药株，42株为敏感株)对RFP的药物敏感性，PhaB法的符合率为93％，敏感度为92％，特异度为95％；DNA序列分析法的符合率为93％，敏感度为87％，特异度为100％；PCR-SSCP的符合率为90％，敏感度为86％，特异度为100％。检测115株结核分枝杆菌(其中75株为OFLX耐药株，40株为敏感株)对OFLX的药物敏感性，PhaB法的符合率为95％，敏感度为95％，特异度为95％；DNA序列分析法的符合率为80％，敏感度为71％，特异度为98％；PCR-SSCP的符合率为75％，敏感度为63％，特异度为98％。结论PhaB法是一种操作简便，快速，敏感，与绝对浓度法符合率高的药敏试验方法，在48—96小时内可获得试验结果，具有良好的临床应用前景。
刘鹏[3]2008年在《噬菌体裂解法快速检测结核分枝杆菌应用的研究》文中研究表明目前,全球大约有1/3的人口感染结核分枝杆菌,平均每一秒钟就有一人受结核杆菌感染,每年约有300万人死于结核,是单一病菌致死最多的传染病。目前对其尚缺乏特异、敏感、快速的实验室诊断方法。以噬菌体为基础的结核分支杆菌裂解试验,可以利用噬菌体生长快、特异性高的特性,快速准确地检测结核分支杆菌,近年来在结核病诊断的研究中备受关注,尤其是对结核菌浓度相对较低的胸水中的结核菌检出率相对较高。本研究采用噬菌体裂解法对结核病患者的痰、胸水、腹水中的结核杆菌进行检测为其临床应用提供依据。本实验的目的是探讨噬菌体裂解法快速检测结核分枝杆菌的临床应用价值。分别应用噬菌体裂解法和涂片法、L-J培养法对58例临床确诊结核病患者的标本(包括:痰/肺泡灌洗液、胸水、腹水)进行结核杆菌的检测。结果显示噬菌体裂解法阳性率79.3%(46/58),与涂片法3.4%(2/58)相比有显着差异(P<0.05),与L-J培养法74.1%(43/58)相比无显着差异(P>0.05)。得出结论噬菌体裂解法检测结核分支杆菌具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、安全等优点,并且检测出的是活菌。
熊国亮[4]2006年在《噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌及耐药性的研究进展》文中研究指明噬菌体是微生物学的一个重要分支,是一种专性感染并寄生于相应活的细菌体内的非细胞原生物,称为细菌病毒[1]。从首次分离分枝杆菌噬菌体至今已有50多年历史[2],但在这期间的研究并不深入。自1997年Wilson等[3]建立噬菌体生物扩增法后,近几年,国内外
马晓薇[5]2005年在《噬菌体检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的技术研究及其应用》文中提出目的研究噬菌体生物扩增法(PhaB)在结核分枝杆菌(MTb)乙胺丁醇(EMB)耐药性测定中的最佳检测条件,并探讨其用于快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的临床应用价值。方法①实验技术研究方法:取不同浓度的EMB对已知药敏结果的结核分枝杆菌作用不同时间(24h、48h、72h),采用噬菌体生物扩增法进行检测,通过对所形成噬菌斑数目的比较,来选择噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌的EMB耐药性的最佳作用条件。②临床应用研究方法:本研究采用230株结核分枝杆菌临床分离株,应用噬菌体法测定其EMB耐药性,测定结果与常规绝对浓度法和BACTEC960法测定结果进行比较。同时,对噬菌体生物扩增法测定结果与绝对浓度法和BACTEC960法测定结果不相符合的菌株应用液体培养法测定其最低抑菌浓度(MIC)进行药物敏感性结果验证。结果①噬菌体生物扩增法测定结核分枝杆菌的EMB耐药性的最佳检测条件结果:选择噬菌体浓度为109PFU/ml、37℃感染1h、EMB终浓度为5μg /ml、与结核分枝杆菌在37℃时预作用48h为最佳工作条件,此时耐药株无药对照管和含药管均出现大量噬菌斑,而敏感株含药管则只有少量噬菌斑,敏感株与耐药株含药管噬菌斑减少的比率的比值最大。②临床应用结果:应用噬菌体生物扩增法测定230株结核分枝杆菌临床分离株的EMB耐药性,结果230株结核分枝杆菌临床分离株,绝对浓度法测定89株,噬菌体法测定结果与之符合率为85.4%;BACTEC-960法测定141株,噬菌体法测定结果与之符合率为95.0%。20株噬菌体法与BACTEC-960法和绝对浓度法结果不符合的菌株测定其MIC,19株MIC结果支持噬菌体法测定结果,噬菌体法与MIC检测结果的符合率为95.0%。结论实验结果表明,噬菌体生物扩增法测定EMB耐药性操作简便,具有较高的敏感性和特异性,实验室设备要求低,不需特殊仪器设备,安全可靠。检测时间3天,
张舒林[6]2006年在《结核分枝杆菌耐药分子机制及其快速检测方法的建立》文中研究指明结核病(TB)是当今全球范围对人类最具威胁性的感染性疾病之一，是单病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病，全球每年死于结核病的人数接近200万。中国是全球结核病的重灾区，结核病发病总人数居全球第二，每年死于结核病者约25万，结核病夺去的生命多于其它所有传染病所造成死亡例数的总和。耐药结核分枝杆菌的产生和传播及结核合并HIV感染是造成近年来结核病死灰复燃、卷土重来的主要原因。目前对结核病治疗主要使用化学药物，然而由于抗结核药物的不规范治疗，病人体内的结核菌对多种抗结核药物发生耐药，从而形成耐多药结核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)，这是结核病疫情重新上升的最主要的原因之一。中国结核病疫情的主要特点之一就是耐药率高，耐多药结核病人数居全球第一。因此深入开展结核分枝杆菌耐药机制研究及在此基础上建立适合临床应用的快速耐药检测方法，对于指导结核病临床治疗，控制耐多药结核病的传播，以及开发新型抗结核药物均具有重大的理论意义和实用价值。利福平(rifampin，RFP)和异烟肼(Isoniazid，INH)作为快速全效杀菌剂，是目前最重要的一线抗结核药物，是当今短程抗结核化疗的基础。在结核分枝杆菌耐药机制的研究中占据重要地位。乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)也是重要的一线抗结核药物，具有广谱抗分枝杆菌活性。然而分枝杆菌对EMB产生耐药的分子机制仍不十分清楚，各国学者的研究报道仍存在较多争议，亟待进一步研究。本文应用DNA测序技术分析87株来源于河南省结核病耐药监测项目收集的结核分枝杆菌分离株，其中对RFP、INH、链霉素(streptmycin，SM)和EMB均敏感的35株，具有不同耐药模式的耐药株52例，其中耐RFP 47例，耐INH 49例，耐EMB 28例。对所有菌株的耐药相关基因rpoB、katG、inhA调节区和embB的突变热点区同时进行基因型分析。结果显示47例耐RFP分离株中，43株(91．5％)在利福平耐药性决定区(RRDR，rifampin risistant determination region)出现基因突变。共检出15种错义突变类型，涉及15种氨基酸改变。最常见的突变类型发生在531密码子上，共占全部突变株的58．1％(25／43)。49例耐INH分离株中，36例(73．5％)检出基因突变，且发生在315密码子位点。序列分析覆盖了inhA调节区的DNA序列，共检出4例(8．2％，4／49)在-15碱基位点发生C→T的置换。其中，1例同时伴随katG点突变，另3例不伴随katG点突变。79．6％(39／49)的耐INH分离株至少在katG 315位点或inhA调节区发生一种突变。28例EMB耐药株中，16例(53．4％)在embB 306密码子发生基因突变，突变类型包括M306V(ATG→GTG)，M306L(ATG→CTG)，M306I(ATG→ATA)，M306I(ATG→ATT)和M306I(ATG→ATC)5种类型。其中M306I(ATG→ATC)突变类型为国内首次报道。在24例对EMB敏感而对RFP和INH耐药的菌株中，4例(16．7％)也在306密码子位点检出基因突变。而对RFP、INH、SM和EMB均敏感的35例结核分枝杆菌分离株中，它们的rpoB、katG、inhA调节区和embB基因均未检出相应的突变。对rpoB、katG与embB306位点的突变对比分析。研究结果表明结核分枝杆菌耐RFP主要由rpoB基因突变引起，最常见的突变类型发生在531密码子。耐INH与katG基因和inhA基因调节区突变有关，且katG 315密码子位点突变是主要因素。研究结果也初步揭示embB306位突变可能并不是结核分枝杆菌对EMB产生耐药的直接原因，而可能与耐多药产生相关。本文首次对耐药结核分枝杆菌embB306位点与rpoB基因和katG基因突变的相关性进行了初步分析，结果表明耐药结核分枝杆菌embB306位点突变同时伴随rpoB基因突变为100％(19／19)，高于同时伴随katG315位点突变(73．7％，14／19)。为进一步研究结核分枝杆菌耐多药与EMB耐受的分子机制提供了必要的信息。本研究结果为研制和开发耐药结核分枝杆菌快速检测方法奠定了基础。长期以来结核分枝杆菌药敏试验一直是结核病细菌学诊断中至关重要的技术。但传统的结核病药敏检测方法为表型耐药检测方法，其建立在结核分枝杆菌的培养基础之上，通常至少需要4到6周的时间，远不能满足临床治疗的需要。因此基于当前结核病分子生物学的研究进展，本文建立和评价了一种新型的快速进行利福平和异烟肼耐药检测的反向系列探针杂交方法。应用该方法设计了一个放置了18条探针的多重寡核苷酸探针阵列，可以同时检测与FRP和INH耐药相关的rpoB、katG、inhA基因调节区和ahpC基因内间隔区的碱基突变，并同时可对结核分枝杆菌复合群进行鉴别诊断。应用本研究建立的方法检测52株耐多药结核分枝杆菌，46株(88．5％)在rpoB突变热点区检出突变。与rpoB的PCR产物测序结果对比分析，探针阵列上野生型探针检测RFP耐药与测序的结果符合率是98．1％(51／52)，突变型探针检测结果的符合率是100％(52／52)。应用本研究建立的方法，86．5％(45／52)的耐INH分离株在katG315位点，或inhA调节区，或ahpC基因内间隔区检测到至少一种突变。选择10例INH耐药和10例INH敏感株，对katG、inhA基因调节区和ahpC基因内间隔区进行测序分析，探针阵列上野生型探针和突变型探针的检测结果均与测序结果一致。应用该方法检测35例敏感株的耐药相关基因，均未检出突变。总体上，与传统的表型耐药检测结果相比，反向系列探针杂交方法检测RFP耐药的敏感性是88．5％(46／52)，特异性是100％(35／35)；检测INH耐药的敏感性是86．5％(45／52)，特异性是100％(35／35)。反向系列探针杂交方法提供了一次杂交实验即可快速获得结核杆菌对多种药物的耐受信息，使得结核杆菌分离株耐药性检测从常规的4—6周的时间缩短到6—8h，充分显示了常规方法不可比拟的优越性。因此有可能发展成为应用于临床快速耐药检测的新方法，这种反向系列探针杂交方法也可以用于耐多药结核病的流行病学调查和研究，为耐药结核病的控制起到重要作用。目前分枝杆菌的发病率也呈上升趋势，由于非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)对大多数抗结核药物天然耐受，并且NTM的传播途径与结核病的人—人的传播途径不同，因此快速、准确对结核病和非结核分枝杆菌病进行鉴别诊断，并针对性的对患者采取有效的治疗和控制措施非常重要。传统的分枝杆菌菌株鉴定方法经常与药敏检测同步进行，也是建立在分枝杆菌的培养基础之上，费时、费力，且时常不能给出明确的结果，难以满足临床治疗的需要。因而建立结核分枝杆菌快速耐药检测方法的同时，不可回避地需要建立对分枝杆菌同步进行快速菌种鉴定的检测方法。基于反向系列探针杂交技术，本研究选择分枝杆菌16S—23S rRNA基因内转录间隔区(16S—23S rRNA gene internal transcripted spacer)为靶DNA序列，设计一个新型的多重寡核苷酸探针阵列，包括16个属、群和种特异性探针。应用该技术检测126例来自中国河南省结核病耐药监测项目的临床分枝杆菌分离株。其中结核分枝杆菌56株，牛型分枝杆菌8株，非结核分枝杆菌62株。结果显示多重探针阵列中分枝杆菌属特异探针和结核分枝杆菌复合群群特异探针具有100％的特异性和敏感性。80．4％(50／62)的非结核分枝杆菌分离株被直接鉴定到种的水平。通过BLAST和RIDOM对国际上现存的16S—23S rRNA基因内转录间隔区序列进行比对分析，并结合系统进化树分析，发现鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和偶然分枝杆菌的基因内转录间隔区存在多态性。本研究所发现的一些新的分枝杆菌基因内转录间隔区序列型(sequevar)已经在Genbank中登记。反向系列探针技术从分枝杆菌菌株处理到菌种鉴定结果判断仅需6—8个h，与传统所需4—6周的时间相比，显示了巨大优越性。并且通过大量的整合试验，本探针阵列从菌株DNA提取、PCR扩增、分子杂交和酶联显色全套过程可以与结核分枝杆菌耐药检测探针阵列同步进行，成为结核分枝杆菌耐药快速检测的配套技术。随着在Genbank中积累更多的分枝杆菌基因内转录间隔区的序列信息，对设计的探针进一步完善和优化，本研究建立的反向系列探针技术有可能成为临床快速、准确进行分枝杆菌菌种鉴定的新方法。本文在对结核分枝杆菌耐药分子机制进一步研究的基础上，依据本研究建立的寡核苷酸探针阵列核心技术平台，建立了一套可以同步进行结核分枝杆菌RFP、INH耐药基因快速检测和分枝杆菌快速菌种鉴定的反向系列探针杂交技术。本文研究结果这为进一步揭示结核分枝杆菌耐药机制和建立适宜临床应用的快速检测方法奠定了基础。
韩喜琴, 马玙, 高微微, 李传友, 陈效友[7]2004年在《噬菌体生物扩增法、DNA序列分析及单链构象多态性分析检测结核分枝杆菌耐药性》文中提出目的 探讨和评价噬菌体生物扩增技术 (phageamplifiedbiologicallyassay,PhaB)用于检测结核分枝杆菌耐药性的应用价值。方法 本研究共选取了 91株利福平 (RFP)耐药株 (其中 82株为耐多药结核分枝杆菌 )、4 2株RFP敏感株、75株氧氟沙星 (OFLX)耐药株、4 0株OFLX敏感株 ,应用PhaB、DNA序列分析法和聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (PCR SSCP) 3种检测方法 ,同时对同一菌株应用该 3种方法进行耐药性检测 ,以资分析与评价PhaB法的临床应用价值。结果 以绝对浓度法药敏试验结果为标准 ,检测RFP的药物敏感性 ,PhaB法的准确性为 93% ,敏感性为 92 % ,特异性为95 % ;DNA序列分析法的准确性为 93% ,敏感性为 90 % ,特异性为 10 0 % ;PCR SSCP法的准确性为90 % ,敏感性为 86 % ,特异性为 10 0 %。检测OFLX(OFLX)的药物敏感性 ,PhaB的准确性为 95 % ,敏感性为 95 % ,特异性为 95 % ;DNA序列分析法的准确性为 80 % ,敏感性为 71% ,特异性为 98% ;而PCR SSCP法的准确性为 75 % ,敏感性为 6 3% ,特异性为 98%。结论 PhaB法是一种操作简便、快速、敏感、与绝对浓度法符合率高的结核分枝杆菌耐药性检测方法 ,在 4 8～ 96h内可获得试验结果 ,具有良好的临床应用前景。
向伟能[8]2007年在《噬菌体生物扩增法快速检测脊柱结核脓液中结核分枝杆菌的实验研究》文中研究表明目的：探讨噬菌体生物扩增法(PhaB)在快速检测脊柱结核脓液中结核分枝杆菌的临床应用价值。方法：实验选取2006年8月至2007年3月期间，通过病史、临床表现及影像学检查初步诊断的56例脊柱结核患者，以无菌原则收集术中病灶中的脓液，应用直接涂片法，BACTEC MGIT-960法及噬菌体生物扩增法分别检测56份脓液标本，同时以PhaB法检测10株结核分枝杆菌标准株，15株非结核分枝杆菌及5株非分枝杆菌。结果：噬菌体生物扩增法检测10株结核分支杆菌标准株均为阳性，15株非结核分支杆菌和5株非分支杆菌均为阴性。46份BACTEC MGIT-960培养阳性和10份BACTEC MGIT-960培养阴性的标本中，噬菌体生物扩增法分别有42份(91.3％)、3份(30.0％)阳性，检出率分别为82.1％和80.4％(P＞0.05)。涂片检查阳性仅13份(23.2％)，阴性43份(76.8％)，而应用噬菌体生物扩增法可以检测出45份(80.4％)阳性，其中有33份为涂片阴性的标本(P＜0.05)。用噬菌体生物扩增法能在18-24小时内观察结果，较BACTEC MGIT-960法提前5-17天出报告。结论：噬菌体生物扩增法与直接涂片法、BACTEC MGIT-960法相比，可以简便、快速地检测结核分支杆菌，全程只需1d，并且具有较高的敏感性和特异性，在脊柱结核的诊断和治疗中具有很好的应用价值。
胡忠义[9]2007年在《噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌及其耐药性方法评价》文中研究指明1997年,Wilson 等建立了噬菌体生物扩增法(PhaB),并将其用于结核分枝杆菌(MTB)耐药性测定。随后,又有学者将其用于结核患者痰标本的快速检测。我们分析了该技术在 MTB 诊断和耐药性测定方面的相关报道,综述如下。一、PhaB 快速检测 MTB1.检测原理。分枝杆菌噬菌体能感染待检标本中活的 MTB,并在菌体内繁殖。未感染细菌的噬菌体则被随后加入的灭活剂所灭活,已进入细菌体内的噬菌体不受影响。
范怀玉[10]2008年在《噬菌体生物扩增法快速测定结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性》文中研究说明目的:探讨噬菌体生物扩增法(Phage Amplified Biologically Assay,PhaB)快速测定结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)对异烟肼(Isoniazid,INH)和利福平(Rifampin,RFP)的药物敏感性在基层实验室的临床应用价值。方法:选择未曾接受过抗结核药物治疗或虽然接受过抗结核药物治疗但不超过一个月的肺结核病人为初治病人(primary pulmonary tuberculosis cases),留痰后培养获得的结核分枝杆菌菌株69株;选择初治失败、规律用药满疗程后痰菌呈阳性或不规律抗结核治疗超过一个月以及慢性排菌的肺结核病人为复治病人(repeated pulmonary tuberculosis cases),留痰后培养获得的结核分枝杆菌菌株98株。上述总共167株均经改良罗氏培养基培养并进行菌型鉴定,证实为结核分枝杆菌(MTB)。分别采用PhaB法和改良罗氏比例法检测其对异烟肼(INH)和利福平(RFP)的耐药性,将两种方法的结果进行敏感度、特异度和符合率进行比较。结果: PhaB法检测初治病人69株中,10株对异烟肼(INH)耐药(10/69),59株对异烟肼(INH)敏感(59/69);改良罗氏比例法检测初治病人69株中,5株对异烟肼(INH)耐药(5/69),64株对异烟肼(INH)敏感(64/69)。与改良罗氏比例法相比,PhaB法检测异烟肼(INH)的敏感度、特异度和符合率分别为80%(4/5)、90.6%(58/64)和89.9%(62/69)。PhaB法检测初治病人69株中,6株对利福平(RFP)耐药(6/69),63株对利福平(RFP)敏感(63/69);改良罗氏比例法检测初治病人69株中,3株对利福平(RFP)耐药(3/69),66株对利福平(RFP)敏感(66/69)。与改良罗氏比例法相比,PhaB法检测利福平(RFP)的敏感度、特异度和符合率分别为100%(3/3)、95.5%(63/66)和95.7%(66/69)。PhaB法检测复治病人98株中,42株对异烟肼(INH)耐药(42/98),56株对异烟肼(INH)敏感(56/98);改良罗氏比例法检测复治病人98株中39株对异烟肼(INH)耐药(39/98),59株对异烟肼(INH)敏感(59/98)。与改良罗氏比例法相比,PhaB法检测异烟肼(INH)的敏感度、特异度和符合率分别为89.7%(35/39)、88.1%(52/59)和88.7%(87/98)。PhaB法检测复治病人98株中,38株对利福平(RFP)耐药(38/98),60株对利福平(RFP)敏感(60/98);改良罗氏比例法检测复治病人98株中,35株对利福平(RFP)耐药(35/98),63株对利福平(RFP)敏感(63/98)。与改良罗氏比例法相比,PhaB法检测利福平(RFP)的敏感度、特异度和符合率分别为97.1%(34/35)、93.7%(59/63)和94.9%(93/98)。结论:改良罗氏比例法需要4周后才能获得药敏结果,不能满足临床快速药敏试验的需要。噬菌体生物扩增法同改良罗氏比例法比较有较高的敏感度、特异度和符合率,经过37℃培养48～72小时(hour,h)就可获得药敏结果,可快速、准确地检测结核分枝杆菌对异烟肼(INH)和利福平(RFP)的耐药性,且操作简单,无需特殊仪器,成本低,在基层临床实验室具有良好的应用前景。
参考文献：
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[2]. 噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌药物敏感性研究及评价[D]. 韩喜琴. 北京市结核病胸部肿瘤研究所. 2004
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[4]. 噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌及耐药性的研究进展[J]. 熊国亮. 江西医学检验. 2006
[5]. 噬菌体检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的技术研究及其应用[D]. 马晓薇. 宁夏医学院. 2005
[6]. 结核分枝杆菌耐药分子机制及其快速检测方法的建立[D]. 张舒林. 四川大学. 2006
[7]. 噬菌体生物扩增法、DNA序列分析及单链构象多态性分析检测结核分枝杆菌耐药性[J]. 韩喜琴, 马玙, 高微微, 李传友, 陈效友. 中华结核和呼吸杂志. 2004
[8]. 噬菌体生物扩增法快速检测脊柱结核脓液中结核分枝杆菌的实验研究[D]. 向伟能. 中南大学. 2007
[9]. 噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌及其耐药性方法评价[J]. 胡忠义. 中华检验医学杂志. 2007
[10]. 噬菌体生物扩增法快速测定结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性[D]. 范怀玉. 苏州大学. 2008
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