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大黄鱼抗菌肽Pc-pis的抗癌作用以及融合蛋白表达

2020-12-02阅读(981)

大黄鱼抗菌肽Pc-pis的抗癌作用以及融合蛋白表达

论文摘要

Pc-pis克隆自大黄鱼（Pseuudosciaena croceaa）,是具有两亲性结构的海洋鱼类阳离子抗菌肽（Antimicrobial peptide,AMP）,Pc-pis是Piscidins家族的成员,能杀死多种细菌、真菌和寄生虫,有一定的溶血活性。为了研究Pc-pis的抗癌作用以及融合蛋白,我们进行了一系列的探索。我们发现Pc-pis对多种癌细胞（Hela、HCT116、DU145、MCF7）有杀伤活性。比较有趣的是,适当大小的渗透压保护剂如PEG4000可以防止Pc-pis诱导Hela细胞的死亡。因此,我们推测Pc-pis与HeLa细胞的细胞膜相互作用,在膜上形成孔洞,进而导致癌细胞死亡。融合蛋白GFP-Pc-pis能够在Hela细胞的核膜上聚集,增加Pc-pis净正电荷会加强这种作用,增加净负电荷则作用相反。此外5个Piscidin家族或相关家庭成员中,三种肽显示了核膜定位,并具有抗肿瘤活性。以上结果证明了净正电荷对AMP和膜相互作用以及生物学功能的重要性。我们发现缩短和屏蔽Pc-pis的C端会使GFP-Pc-pis在核膜上聚集的现象消失,我们认为抗菌肽的完整和自由的C末端结构对其生物活性非常重要。我们还研究了原核表达的Pc-pis融合蛋白,虽然Pc-pis的细胞毒性阻碍了表达,但Pc-pis的C端进一步融合钙调蛋白（calmodulin,CaM）后,屏蔽了Pc-pis的细胞毒性,促进了融合蛋白的表达,此外在Pc-pis N端加上GST标签后也可以促进表达。接下来我们将以此为基础,通过Msln/MUC16相互作用体系构建相应的Pc-pis融合蛋白,靶向传递Pc-pis杀死癌细胞。为开发Pc-pis可能的临床应用提供理论基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  •   1.1 抗菌肽概况
  •     1.1.1 先天免疫系统与抗菌肽
  •     1.1.2 抗菌肽的结构与分类
  •     1.1.3 抗菌肽的抗菌机理
  •   1.2 抗菌肽的抗肿瘤作用
  •     1.2.1 AMPs抗肿瘤作用的发现
  •     1.2.2 AMPs的抗肿瘤机理
  •     1.2.3 AMPs作为抗癌药物的应用前景
  •   1.3 抗菌肽的结构优化
  •   1.4 抗菌肽piscidins家族
  •     1.4.1 抗菌肽piscidins家族简介
  •     1.4.2 抗菌肽Pc-pis
  •   1.5 靶向治疗
  •     1.5.1 靶向融合蛋白
  •     1.5.2 Mlsn/MUC16相互作用体系在靶向融合蛋白中的应用
  •   1.6 研究目的和意义
  • 第二章 材料和方法
  •   2.1 实验相关药品和试剂
  •     2.1.1 哺乳动物细胞株
  •     2.1.2 大肠杆菌菌株
  •     2.1.3 质粒载体
  •     2.1.4 多肽合成与溶解
  •     2.1.5 酶及主要试剂
  •     2.1.6 试剂盒
  •   2.2 分子克隆相关实验和方法
  •     2.2.1 质粒载体
  •     2.2.2 聚合酶链式反应
  •     2.2.3 DNA的分离
  •     2.2.4 DNA的分析与回收
  •     2.2.5 质粒载体的克隆
  •     2.2.6 质粒载体的转化
  •   2.3 向培养的哺乳动物细胞中导入基因
  •     2.3.1 细胞的培养
  •     2.3.2 细胞的传代
  •     2.3.3 PEI介导的DNA转染
  •     2.3.4 MTT法测定细胞存活率
  •   2.4 克隆基因的表达以及目的蛋白的纯化与分析
  •     2.4.1 在大肠杆菌中利用可用IPTG诱导的启动子表达克隆化基因
  •     2.4.2 蛋白质的SDS-PAGE电泳
  •     2.4.3 用考马斯亮蓝R-250进行SDS-PAGE凝胶染色
  •   2.5 圆二色谱测多肽的二级结构
  • 第三章 结果与分析
  •   3.1 Pc-pis的圆二色谱
  •   3.2 肿瘤细胞对Pc-pis的敏感性
  •   3.3 渗透压保护剂影响Pc-pis杀死Hela细胞的能力
  •   3.4 Pc-pis的C末端结构影响膜结合能力
  •   3.5 Pc-pis的净电荷影响膜定位能力
  •   3.6 Piscidins家族或相关家族其他成员抗肿瘤活性与核膜定位
  •   3.7 渗透压保护剂影响piscidins家族成员杀死细胞的能力
  •   3.8 抗菌肽Pc-pis融合蛋白表达研究
  •     3.8.1 融合蛋白GFP-Pc-pis/Pc-pis（2RA）的原核表达
  •     3.8.2 融合蛋白GST-Pc-pis/（2RA）、Msln-Pc-pis/（2RA）的原核表达
  •     3.8.3 Pc-pis的C端融合GST/GFP/CALM2的原核表达
  • 第四章 总结与讨论
  • 附录 图表索引
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李大成

    导师: 周化民

    关键词: 抗菌肽,融合蛋白

    来源: 厦门大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,药学

    单位: 厦门大学

    分类号: Q78;R96

    总页数: 83

    文件大小: 4998K

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