论文摘要
昆虫的生长与发育主要受保幼激素（Juvenile hormone,JH）与活性蜕皮激素即20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone,20E）的协同调控,而这种调控作用是基于二者的滴度在生长发育过程中的周期性变化来实现。JH滴度高峰出现在幼虫每个龄期的初期,负责维持幼虫生长。幼虫每个龄期末出现高浓度20E,并引起幼虫蜕皮的发生;在幼虫末龄后期至羽化成蛾前没有JH合成,预蛹期和蛹发育中期出现的高浓度20E分别引起化蛹和化蛾变态蜕皮。JH和20E滴度在昆虫生长发育过程中的此消彼长的变化及功能上的拮抗,暗示了JH对20E的合成可能具有抑制作用。探究JH及其信号通路关键分子Krüppel-homolog 1（Kr-h1）对20E合成的调节机制将有助于完善昆虫内分泌激素的相互调控网络。在昆虫幼虫向蛹的转变过程中,20E作用于靶组织器官并引发细胞凋亡或组织重建,从而完成幼虫到蛹的转变。脂肪体是20E的靶组织之一,也是物质代谢和能量代谢和营养贮存的主要场所,并进行着活跃的蛋白合成。目前,关于昆虫20E对脂肪体中蛋白合成的调控仍不清晰。探究20E对昆虫变态发育期脂肪体中蛋白合成的影响,有助于揭示20E的新功能。本研究旨在以果蝇和家蚕为研究对象,综合利用遗传学、分子生物学、生物化学和生物信息学分析等多种实验方法,在细胞、组织和个体水平探究JH能否直接作用于前胸腺（Prothoracic gland,PG）,并如何通过其信号途径关键分子Kr-h1来抑制20E合成,以及20E对脂肪体中蛋白合成的影响及作用机制。获得的主要研究结果如下:1.JH及其信号通路关键分子Kr-h1对20E合成抑制作用1)JH类似物处理延迟果蝇和家蚕化蛹并抑制20E合成和20E合成酶基因转录我们用JH类似物（JHM）对果蝇和家蚕进行处理,导致幼虫延迟化蛹并降低20E滴度。用JHM处理离体培养的果蝇和家蚕的20E合成器官PG,则能显著抑制20E合成酶基因的转录,表明JH能直接作用于PG来抑制20E合成酶基因转录。2)JH信号通路关键分子Kr-h1在果蝇和家蚕20E合成器官PG中表达我们进一步发现家蚕和果蝇PG中的JH信号转导通路基因BmKr-h1的表达在幼虫龄期前期表达量高而末期降低,这与20E合成途径的限速酶DmSpok基因的表达模式完全相反。Kr-h1的表达模式与JH滴度的变化模式吻合但与20E的滴度变化模式相反,暗示了Kr-h1是介导JH抑制20E合成的关键分子。3)果蝇PG中DmKr-h1表达的改变影响化蛹、20E的合成及20E合成酶表达为探究PG中的Kr-h1对20E合成的影响,我们在果蝇PG特异的Phm-Gal4对PG中特异性干涉DmKr-h1,结果导致果蝇化蛹提前,20E的滴度增加,脂肪体中20E应答基因DmE75B的表达水平上调,PG中20E合成酶基因的表达升高。此外,DmKr-h1杂合突变降低果蝇PG中的DmKr-h1水平导致了同样的结果。然而,在PG中特异性过表达DmKr-h1则导致果蝇幼虫发育阻滞在二龄时期,不能蜕皮也不能再继续向前发育;不仅如此,20E合成被显著抑制,导致脂肪体中DmE75B和PG中20E合成酶基因的表达水平也下降;添食20E或20E前体的Ecdysone,则可以挽救50%DmKr-h1过表达所导致的发育缺陷。4)果蝇PG中的Kr-h1表达改变不影响细胞核内复制我们还发现在果蝇PG中特异性干涉或过表达DmKr-h1及DmKr-h1突变并不影响PG细胞中的DNA复制过程。但在产卵96h时,DmKr-h1过表达导致PG变小;添食20E则能恢复了PG器官的大小,表明PG中过表达DmKr-h1所导致的器官变小是由于缺乏20E合成所引起的全身性生长受阻引起的。综合分析上述结果表明,JH可以直接作用于20E合成器官PG并通过其信号转导关键分子Kr-h1来抑制20E合成酶基因转录,进而抑制20E的合成。2.Kr-h1抑制20E合成酶基因转录的分子调控机制1)Kr-h1抑制果蝇和家蚕20E合成酶基因启动子的活性为探究了锌指转录因子Kr-h1抑制20E合成酶基因转录的分子机制,我们克隆了果蝇和家蚕20E合成酶基因的启动子区,并发现20E合成酶基因启动子序列中内包含潜在KBS的核心基序GACCTNNNAA。启动子荧光素酶报告基因分析实验显示,JHM的诱导处理或者Kr-h1过表达均降低了20E合成酶基因启动子的活性。2)Kr-h1通过KBS抑制DmSpok/BmSpo启动子活性进一步分析发现,当KBS存在时,果蝇DmKr-h1过表达能显著抑制DmSpok启动子片段的活性;当近端KBS被截掉后,DmKr-h1过表达对DmSpok启动子活性的抑制作用消失;突变或删除果蝇DmSpok启动子近端的KBS后,DmKr-h1对DmSpok启动子的抑制作用也消失。同样,将家蚕BmSpo启动子近端的KBS进行突变和删除,BmSpo启动子的活性不再受BmKr-h1的抑制。这说明DmSpok/BmSpo启动子区的KBS是Kr-h1发挥抑制作用的关键基序。3)Kr-h1与KBS直接结合染色质免疫共沉淀PCR（ChIP-PCR）实验表明DmKr-h1能够与DmSpok启动子上包含KBS元件的DNA片段结合;且BmKr-h1能够与BmSpo启动子上包含KBS元件的DNA片段结合。同时我们分别原核表达并纯化了重组DmKr-h1和BmKr-h1具有活性的上清蛋白,并针对KBS的DNA序列设计生物素标记探针开展了凝胶阻滞实验（EMSA）,结果表明纯化的重组DmKr-h1蛋白能够与DmSpok启动子区近端的KBS直接结合。同样地,EMSA实验也证明家蚕BmKr-h1也能直接结合到BmSpo启动子区近端的KBS。4)Kr-h1诱导DmSpok/BmSpo启动子区发生DNA甲基化我们通过重亚硫酸盐测序实验发现,果蝇S2细胞中过表达DmKr-h1导致DmSpok启动上KBS附近的胞嘧啶发生甲基化,但用DNA甲基化抑制剂Aza处理则恢复了非甲基化水平;被DmKr-h1/BmKr-h1抑制的DmSpok/BmSpo启动子的活性也得到了一定程度的恢复。以上结果表明,Kr-h1通过直接结合20E合成酶基因启动子区的KBS并诱导启动子区DNA发生甲基化来抑制20E合成酶基因的转录。3.20E对昆虫脂肪体中蛋白合成的抑制作用1)20E抑制昆虫脂肪体中的蛋白合成水平昆虫脂肪体是蛋白合成和能量代谢的关键场所。我们建立了基于嘌呤霉素法分析果蝇和家蚕脂肪体及细胞中蛋白合成水平的方法体系。进一步的Western Blot和免疫荧光实验结果表明,果蝇和家蚕幼虫向蛹转变的变态发育过程中,脂肪体中蛋白合成水平逐渐降低。此外,20E能在细胞与组织水平抑制蛋白质合成的水平;在果蝇脂肪体中对20E受体EcR基因进行显性负调控则增加蛋白合成水平。2)20E抑制昆虫脂肪体中的核糖体水平核糖体的数量是蛋白合成水平强度的标识,且核糖体RNA（rRNA）的量占总RNA量的三分之一以上。检测核糖体的重要组成成分18S rRNA的表达水平发现,果蝇和家蚕脂肪体中18S rRNA的数量在预蛹期显著降低;派诺宁染色结果表明总RNA的信号在三龄初期最高,且核仁中rRNA的信号最强,但随后下降,预蛹期降至最低。同样,20E在细胞与组织水平降低了18S rRNA的表达。反之,在果蝇脂肪体中显性负调控EcR的表达,则明显增加18S rRNA表达和总RNA的量。3)20E处理使昆虫脂肪体细胞的核仁变小核仁是核糖体生成的关键场所,核仁大小与rRNA的生成以及蛋白合成紧密相关。我们观察到果蝇脂肪体细胞核中20E受体EcR的表达随幼虫向预蛹的变态发育逐渐增加,而核仁的大小在预蛹期显著减小。此外,20E处理使脂肪体细胞中核仁的变小;但在果蝇脂肪体中对EcR基因的表达进行显性负调控,则增加脂肪体细胞的核仁大小。以上结果初步表明,20E可通过影响脂肪体中的细胞核仁的大小和核糖体的生成水平来抑制蛋白合成。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 张天镭
导师: 程道军
关键词: 合成,转录调控,蛋白合成,抑制
来源: 西南大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 西南大学
分类号: Q963
总页数: 116
文件大小: 11627K
下载量: 207
相关论文文献
- [1].叶酸在蛋白质合成过程中的作用[J]. 新课程(中) 2016(11)
- [2].口服NCG提高仔猪骨骼肌的蛋白合成[J]. 今日养猪业 2012(04)
- [3].分泌蛋白合成与运输模型的制作与应用[J]. 中学生物教学 2018(04)
- [4].不同氨基酸模式对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的影响[J]. 动物营养学报 2013(08)
- [5].腐胺在动物营养学中的研究进展[J]. 中国饲料 2013(07)
- [6].重水标记法测定大鼠骨骼肌蛋白合成动力学相关参数[J]. 生理学报 2017(03)
- [7].野菊花不同萃取部位对肝损伤小鼠肝细胞蛋白合成及小鼠免疫功能的影响[J]. 郑州大学学报(医学版) 2013(06)
- [8].Akt与ERK1/2在人骨关节炎软骨细胞中的表达[J]. 中国病理生理杂志 2012(05)
- [9].急性运动或AICAR注射对骨骼肌mTOR信号通路的影响[J]. 北京体育大学学报 2009(05)
- [10].“人造肉”能走多远？[J]. 作文通讯 2019(23)
- [11].微囊化HepG2细胞脂代谢与线粒体功能和蛋白的合成[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2010(38)