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米象磷化氢抗性相关基因的表达分析

2020-12-08阅读(920)

米象磷化氢抗性相关基因的表达分析

论文摘要

米象是一种重要的贮藏害虫,对世界粮食产量产生威胁,由于熏蒸剂磷化铝的使用,米象产生了一定的PH3抗性。本文通过转录组技术,分析了米象几种代谢解毒相关基因谷胱甘肽硫转移酶,细胞色素P450和酯酶的表达;获得了米象基因遗传信息。目前,随着生物技术的进步,尤其是基因组学的广泛应用,可以在转录组水平研究米象基因的表达情况,进而从本质上全面揭示米象的磷化氢抗性。采用Illumina测序技术,米象敏感品系转录组测序共获得reads是22,128,957和6,562,957,738个核苷酸,PH3熏蒸品系转录组测序共获得reads是27,306,829和8,093,178,954个核苷酸。将转录组数据通过组装,将这些transcripts拼接成为42,173个unigenes。将得到Unigene提交蛋白质数据库（Nr）进行比对,共有16,610个返回有效结果。同时还将Unigene提交至其它数据库进行注释,共有17,335个Unigene得到成功注释。44.45%的Unigene与中欧山松大小蠹的相关基因同源性最高。26.96%的Unigene与赤拟谷盗的相关基因具有同源性。通过筛选,从米象转录组数据中共鉴定出323个与解毒代谢抗性相关的Unigene。主要编码包括谷胱甘肽硫转移酶28个、酯酶58个、细胞色素P450基因68个。克隆并测定了米象13个编码GSTs基因的cDNA全长序列,其中Epsilon家族6个、Sigma家族4个、Theta家族2个和Delta家族1个。米象GSTs基因中共鉴定出6个Epsilon家族的基因。获得米象P450基因11个。将其中的3个基因归类于CYP4家族,6个基因归类于CYP3家族,另归类于CYP mito家族2个。获得米象EST基因6个,分属3个不同的家族。米象敏感品系和磷化氢熏蒸后的品系差异表达基因中,米象磷化氢熏蒸后基因上调315个,下调535个。对识别到的差异表达基因进行功能注释。将得到的差异表达Unigene提交NCBI蛋白质数据库,共有687个返回有效结果。这些差异表达基因中的Unigene在GO分类中被划分到“biological process”、“cellular component”和“molecular function”的61个功能组中。COG分类注释了221个差异表达基因Unigene。同时对差异表达基因结果按照KEGG中通路类型进行分类。米象敏感品系经磷化氢不同浓度熏蒸和不同时间熏蒸处理。两个基因经LC30浓度的显著高于其它两个浓度;四个GSTs基因经LC50浓度的磷化氢熏蒸的相对表达量显著高于对照组和LC30、LC10处理组;三个基因相对表达量均显著低于对照组。7个GSTs基因随着熏蒸时间的增加,相对表达量逐渐升高。米象GSTs基因在不同发育阶段的相对表达模式中,SoGSTd1基因在四龄幼虫阶段的相对表达量最高;SoGSTe1基因在成虫阶段的相对表达量最高;SoGSTe2和SoGSTe5基因在四龄幼虫阶段的相对表达量最大,SoGSTe6基因的相对表达量在三龄幼虫阶段最大。米象13个GSTs基因在不同组织部位的相对表达模式中。米象13个GSTs基因中的11个在中肠、脂肪体或马氏管中的相对表达量均显著高于头部和表皮中的表达量。在EST基因中,随着磷化氢熏蒸浓度的增加,SoEST1基因的相对表达量也增加,SoEST2和SoEST5基因经磷化氢LC30熏蒸的相对表达量显著高于对照组。6个EST基因在不同发育阶段分析中。SoEST1在成虫和蛹期的相对表达量均显著较高;SoEST3基因在成虫阶段的相对表达量最高。在不同组织中,SoEST1基因在马氏管中的相对表达量最高;SoEST3基因在中肠中的相对表达量最高;SoEST5基因在脂肪体中的相对表达量最高;SoEST6基因在中肠中的相对表达量最高。在米象P450基因中,经LC30浓度的磷化氢熏蒸24h后,基因的相对表达量显著高于对照。米象7个P450基因的相对表达量随着磷化氢熏蒸时间的增加而逐渐增大。在不同发育阶段,5个P450基因在成虫和四龄幼虫阶段的相对表达量均显著偏高;4个基因在成虫阶段的最高。在不同组织部位中,4个P450基因在中肠的相对表达量最高,3个基因在马氏管中的最高。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • abstract
  • 1 前言
  •   1.1 米象抗药性研究现状
  •   1.2 昆虫代谢解毒酶的研究现状
  •     1.2.1 谷胱甘肽硫转移酶的研究进展
  •     1.2.2 细胞色素P450 家族的研究现状
  •     1.2.3 酯酶的研究进展
  •   1.3 昆虫转录组学的研究进展
  •     1.3.1 转录组测序发现功能基因
  •     1.3.2 转录组测序研究基因差异表达
  •     1.3.3 Gene ontology（基因本体论）
  •     1.3.4 COG分析
  •     1.3.5 KEGG数据库
  •     1.3.6 蛋白质家族数据库
  •   1.4 研究目的
  • 2 材料和方法
  •   2.1 材料与设备
  •     2.1.1 供试昆虫
  •     2.1.2 主要试剂
  •     2.1.3 主要仪器设备
  • 3 气体的制备'>    2.1.4 PH3气体的制备
  •     2.1.5 抗性测定
  •     2.1.6 受试米象逆境处理
  •     2.1.7 数据处理
  •   2.2 米象转录组分析
  •     2.2.1 转录组测序
  •     2.2.2 筛选代谢解毒基因
  •   2.3 cDNA全长扩增（RACE）
  •     2.3.1 引物设计
  •     2.3.2 米象RACE的cDNA合成模板
  •     2.3.3 米象代谢解毒基因5’RACE和3’RACE扩增
  •     2.3.4 cDNA全长序列的拼接及ORF扩增
  •     2.3.5 获得米象代谢解毒基因全长序列分析
  •     2.3.6 构建米象代谢解毒基因系统进化树
  •   2.4 定量PCR
  •     2.4.1 前处理
  •     2.4.2 RNA的提取
  •     2.4.3 用DNase Ⅰ处理RNA去除基因组DNA
  •     2.4.4 RNA浓度测定
  •     2.4.5 cDNA的第一条链合成
  •     2.4.6 引物设计并鉴定引物质量
  •     2.4.7 荧光定量PCR反应
  • 3 结果与分析
  • 3 熏蒸品系的转录组分析'>  3.1 米象敏感品系和PH3熏蒸品系的转录组分析
  • 3 熏蒸品系的转录组测序产量统计'>    3.1.1 米象敏感品系和PH3熏蒸品系的转录组测序产量统计
  •     3.1.2 数据组装质量
  •     3.1.3 Unigene在各数据库中的比对结果
  •     3.1.4 Unigene分布概况
  •     3.1.5 Unigene的 GO以及COG分类
  •     3.1.6 米象解毒代谢基因的筛选鉴定
  •   3.2 米象差异表达基因分析
  •     3.2.1 差异表达基因功能注释和富集分析
  •     3.2.2 差异表达基因的GO以及COG分类
  •     3.2.3 差异表达基因KEGG注释
  •   3.3 米象解毒代谢基因表达模式分析
  •     3.3.1 米象GSTs基因表达模式
  •     3.3.2 米象EST基因表达模式
  •     3.3.3 米象P450 基因表达模式
  •   3.4 结论
  • 4 展望
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 叶侃

    导师: 魏兆军

    关键词: 米象,磷化氢,谷胱甘肽硫转移酶,细胞色素,酯酶

    来源: 合肥工业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 合肥工业大学

    分类号: Q963

    总页数: 102

    文件大小: 7120K

    下载量: 41

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