汉坦病毒动态调控自噬流拮抗宿主固有免疫应答的分子机制及干预研究

论文摘要

汉坦病毒是世界上分布最广、传播途径最多、危害极其严重的出血热病毒,其属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)汉坦病毒科(Hantaviridae),为有包膜的单负链RNA病毒,其基因组由S、M、L三个片段组成,分别编码病毒核衣壳蛋白(NP)、糖蛋白前体(GPC)以及病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)。其中L片段最为保守,汉坦病毒主要由鼠等啮齿类动物传播。可通过多种途径传播,如带病毒鼠的排泄物等,感染人体可引起两种急性出血热性疾病,分别是汉坦病毒肺综合征(HPS)及肾综合征出血热(HFRS)。我国是世界上HFRS发病率最高的国家。自噬是真核细胞中在进化上高度保守的分解代谢途径,自噬与细胞分化与发育、营养剥夺、微生物感染等多种生理病理进程密切相关,在维持细胞内环境稳定及促进病原清除过程中发挥重要作用。I型干扰素(IFN)在机体抗病毒固有免疫应答过程中发挥重要作用,其经由多种病毒识别受体、接头分子、蛋白激酶和转录因子调控信号通路转录激活,可诱导多种抗病毒蛋白产生。有研究报道,病毒感染诱导的自噬在机体抵御病毒入侵中扮演重要角色,其可以通过选择性降解病毒组分影响病毒生活周期,又可以与模式识别受体(PRR)相互作用促进IFN产生,启动机体固有免疫应答。在本研究中,我们证明HTNV动态调节宿主自噬过程,在HTNV感染早期诱导完全自噬,但在感染晚期诱导不完全自噬。先前的研究已经确定HTNV Gn诱导的完全自噬有利于HTNV的复制,而详细的机制尚不清楚。在本研究中,我们研究发现HTNV Gn与Tu翻译延伸因子线粒体(TUFM)相互作用并募集LC3B,诱导线粒体自噬,在HTNV感染早期降解MAVS并阻止IFN的产生。此外,作为病毒粒子不可或缺的组成部分,Gn是如何逃脱自噬的清除。我们研究结果表明,在HTNV感染后期,NP与Gn竞争性结合LC3B,抑制Gn介导的自噬体形成,并与突触体相关蛋白29(SNAP29)相互作用,阻止SNARE蛋白介导的自噬体与溶酶体的融合。因此,NP阻断Gn的降解,促进子代病毒的包装和繁殖。此外,我们还证明,在感染早期抑制自噬过程可以增强宿主IFN应答并抑制体内和体外HTNV复制。

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摘要

ABSTRACT

缩略词表

第一章前言

1.1 汉坦病毒简介

1.2 自噬的分类及基本过程

1.3 固有免疫应答抵御病毒感染的过程中发挥重要作用

1.4 汉坦病毒拮抗IFN信号通路的分子机制

1.5 自噬对机体抗病毒固有免疫应答具有重要的调控作用

1.6 自噬调控Ⅰ型IFN应答

1.7 自噬直接清除病毒发挥固有免疫功能

1.8 病毒改变宿主自噬进程促进其感染及致病的分子机制

1.9 病毒阻断宿主自噬进程以促进其复制

1.10 病毒诱导并劫持宿主自噬进程以促进其复制或出胞

1.11 研究内容和意义

第二章实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 抗体

2.1.2 化学试剂

2.1.3 细胞

2.1.4 质粒

2.1.5 试剂盒

2.1.6 q-PCR引物序列

2.1.7 其它试剂

2.1.8 自配试剂

2.1.9 实验动物

2.1.10 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 细胞培养

2.2.2 siRNA和质粒的转染

2.2.3 感染病毒

2.2.4 Western Blot

2.2.5 免疫荧光

2.2.6 JC-1 染色及流式细胞技术

2.2.7 透射电镜实验

2.2.8 免疫共沉淀（CO-IP）

2.2.9 小鼠实验和HE染色

2.2.10 RNA提取、反转录和q-PCR

2.2.11 ELISA检测IFNβ

2.2.12 ICW

2.2.13 双荧光素酶检测IFNβ和ISRE启动子活性

2.2.14 统计分析

第三章实验结果

3.1 HTNV感染细胞诱导自噬发生

3.2 HTNV在感染早期诱导完全自噬而在感染后期诱导不完全自噬

3.3 HTNV Gn诱导完全自噬NP可以阻断Gn诱导的自噬

3.4 HTNV Gn引起线粒体损伤并募集LC3B诱导线粒体自噬

3.5 HTNV Gn定位于线粒体上并与TUFM相互作用诱导线粒体自噬

3.6 Gn抑制Ⅰ型干扰素应答

3.7 NP与 LC3B和 SNAP29 结合抑制Gn降解促进子代病毒的复制

3.8 抑制自噬的起始阶段能增强宿主固有免疫应答抑制子代病毒的复制

第四章结果和讨论

4.1 HTNV感染宿主细胞诱导自噬动态变化

4.2 HTNV感染早期诱导完全自噬的分子机制及生物学意义

4.3 HTNV感染后期诱导不完全自噬的分子机制及生物学意义

4.4 自噬进程对HTNV感染致病的影响

参考文献

攻读硕士学位期间取得的科研成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王克荣

导师: 沈立新

关键词: 汉坦病毒,细胞自噬,线粒体自噬,干扰素,固有免疫

来源: 西北大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 西北大学

分类号: R373

总页数: 81

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汉坦病毒动态调控自噬流拮抗宿主固有免疫应答的分子机制及干预研究

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