林伟锋[1]2003年在《可控酶解从海洋鱼蛋白中制备生物活性肽的研究》文中研究说明本文主要以沙丁鱼蛋白为原料，利用可控酶解技术、超滤和离子交换法分离手段，研究制备生物活性肽的方法，并进行抗疲劳活性研究。 在可控酶解工艺优化的研究中，主要研究了pH值、水解时间、蛋白酶的种类和用量、底物的初始浓度和种类、水解温度以及搅拌方式对水解效果和酶解物的分子量分布的影响，实验结果如下： 基于水解体系的pH值变化对其酶解物的分子量分布和肽提取率的高低影响很小，确定水解过程中不必加碱保持体系pH值的恒定。水解过程可分为叁个阶段，分别是快速上升阶段、缓慢增长阶段和平衡阶段，可作用底物浓度下降是导致水解过程产生这叁个阶段的主要原因；随着水解时间的延长，酶解物的平均肽链长度下降，表明了大分子量肽组分含量降低，低分子量肽含量升高。四种蛋白酶中以胰蛋白酶的水解效果最好，其次是碱性蛋白酶和复合蛋白酶，中性蛋白酶的水解效果最差；四种蛋白酶使用量均以2000U／g～3000U／g的范围比较合适。底物初始浓度过高，将降低水解反应速度，胰蛋白酶水解沙丁鱼蛋白的底物初始浓度以7.5％比较合适；沙丁鱼蛋白的水解效果优于红叁鱼蛋白。胰蛋白酶和碱性蛋白酶的最佳水解温度应是55℃左右，而复合蛋白酶、中性蛋白酶的最佳水解温度则为50℃左右，而鱼自溶酶最佳水解温度则为45℃。连续搅拌的水解效果更佳。起始底物浓度、酶的种类和底物的种类等因素明显影响氮提取率和肽提取率与水解度之间关系。 通过数学推导及实验分析，得出可控酶解动力学模型及其相关参数，分别为：DH=9.8041n[1+(1.701E_0／S_0-0.00367)t]和R=(16.678E_0-0.036S_0)exp[-0.102(DH)]，动力学常数k_2=16.678min~(-1)和k_d=1.7015min~(-1)，最低临界初始蛋白酶浓度E_0=c_0S_0，最大临界底物初始浓度S_0=E_0／c_0，c_0=2.159×10~(-3)。 超滤分离方法的研究表明，酶解液的PCL和平均分子量减小，将提高平均透过速率、膜效能和组分的透过率，降低组分的截留率；证实了分离膜对水解液中不同分子量组分具有分离的作用，通过二级超滤处理，酶解液可被具有不同截留分子量的分离膜分离成叁部分。 离子交换法的研究表明，较低离子强度的初始缓冲液、合适的上样量及恰当离子强度的洗脱剂有利于提高交换容量和分离效果；两浓度两步洗脱法有利于提高分离效果，减少洗脱剂的用量；在中性条件下，中性蛋白酶酶解液中的中性肽和带正电荷的肽的含量最高，而胰蛋白酶则最低。实验结果表明，离子交换法能有效地实现酶解液中肽组分的分离。 动物实验证明，活性肽能显着延长小白鼠的游泳时间，活性肽的剂量与小白
刘丹[2]2015年在《秋刀鱼蛋白抗氧化肽的分离纯化及其抗疲劳功效研究》文中提出本论文以蛋白含量丰富的秋刀鱼为原料,通过可控酶解技术制备抗氧化肽,利用体外化学模型和体内动物模型综合评价了秋刀鱼多肽的抗氧化活性,在此基础上利用动物模型评价其抗疲劳功效。然后采用多种分离技术对秋刀鱼多肽进行分离纯化,并采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)联用电喷雾质谱(ESI-MS/MS)对目标肽段进行一级氨基酸序列的鉴定,最后研究了秋刀鱼多肽的在加工储藏过程中的抗氧化活性,并研究了抗疲劳肽功能性饮料的配方。秋刀鱼的蛋白含量为18.18%,鱼肉的氨基酸含量丰富,组成合理,富含必需氨基酸、呈味氨基酸、抗氧化活性氨基酸以及支链氨基酸等多种具有营养价值的氨基酸可用于蛋白酶解生产活性多肽。采用食品级风味蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase、胰酶和木瓜蛋白酶水解秋刀鱼蛋白,以还原力为指标,确定了胰酶为秋刀鱼蛋白制备抗氧化肽的最适酶。在此基础上,分析了加酶量、水料比和酶解时间对胰酶酶解秋刀鱼的影响,并利用响应面对酶解条件进行优化,结果表明,蛋白回收率和氧化自由基吸收能力(ORAC值)达到最优的酶解条件为加酶量1085 U/g蛋白,水料比3:1,酶解时间8h,p H 8,酶解温度50°C,此时蛋白质利用率77.16%,ORAC值为877.92μmol Trolox/g。采用3种体外化学模型和小鼠实验综合评价秋刀鱼多肽的抗氧化活性。体外抗氧化活性结果表明秋刀鱼多肽的DPPH?清除能力是相同蛋白浓度的GSH的0.5倍;当PSPHs的蛋白浓度分别是GSH蛋白浓度的15倍、6倍时,两者O2-?清除能力和还原力相等。体内抗氧化活性结果表明PSPHs能使小鼠体内的抗氧化酶系超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活力比空白组分别提高4.97%-15.11%和20.89%-34.74%,而谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)相对空白组却并无显着提高。综上可表明秋刀鱼多肽具有一定的体外和体内抗氧化活性。.与空白组相比,秋刀鱼多肽可延长小鼠的死亡游泳时间达8.67%-34.69%;能延缓或减少小鼠运动时机体中肝糖原的消耗,多肽组的小鼠肝糖原含量比空白组高1.09-1.17倍;秋刀鱼多肽能清除小鼠血液中乳酸和血清尿素氮的积累,多肽组的小鼠血液中乳酸和血清尿素氮的含量分别比空白组减少了8.60%-14.33%和6.79%-22.95%。秋刀鱼多肽能够显着降低大鼠血清肌酸激酶及乳酸脱氢酶活性,使小鼠血清中的肌酸激酶的活力比空白组降低了29.96%-36.24%,因此秋刀鱼多肽具有较好的抗疲劳功效。采用大孔吸附树脂、凝胶层析分离、RP-HPLC等系列技术对秋刀鱼多肽进行了分离纯化,所得两个目标肽段ORAC值比分离前提高了9.9倍和4.18倍,也比相同蛋白浓度的谷胱甘肽(GSH)活性强4.47和1.17倍,说明分离纯化可显着地富集抗氧化肽。最后用RP-HPLC联用ESI-MS/MS对功能肽段的氨基酸序列组成进行了鉴定,得到两个目标肽段的氨基酸序列为Ser-Gly-Ala-Ala-Met和His-Gly-Glu-Glu,分子量分别为435Da和470Da。秋刀鱼抗氧化肽的稳定性研究表明秋刀鱼多肽的耐热性和耐酸性较好;耐碱性较差;Cu2+和Zn2+浓度的增加能显着降低其抗氧化活性(P<0.05),而Mg2+、Ca2+和K+则对其影响不显着(P>0.05);冷冻和喷干燥方式对秋刀鱼多肽抗氧化活性的影响不存在显着差异(P>0.05);灭菌方式对秋刀鱼蛋白多肽的抗氧化稳定性的影响由大到小依次为:高压蒸气灭菌、沸水灭菌和巴氏灭菌;液态冷冻和固态真空包装方式保存蛋白多肽均可保持90%以上的抗氧化活性,其中固态真空包装比液态冷冻更有利于保持蛋白肽抗氧化活性。另外,研究出秋刀鱼蛋白肽功能性饮料的配方为:秋刀鱼蛋白肽稀释液、枸杞和蜜枣浸提液的用量均为40%(v/v),蓝莓香精液用量为0.2%(v/v),叁氯蔗糖+蜂蜜混合液为0.7%(v/v),氯化钠约0.7%(g/v),以乳酸调节饮料p H至5.5,最后补水至所需体积。
王雪芹[3]2014年在《鲐鱼多肽的抗氧化活性与抗疲劳作用研究》文中指出海洋低值鱼类产量高，蛋白质含量丰富，利用低值鱼制备特定的生物活性肽具有重要意义。本文以蛋白质含量丰富的鲐鱼为原料，利用酶解技术、超滤分级技术优化制备抗氧化活性肽，研究其抗氧化活性的稳定性，并采用离子交换层析和凝胶过滤层析技术对目标多肽进行分离纯化，采用体外化学模型和动物模型相结合的方法评价目标肽段的抗氧化活性和抗疲劳功效，初步探讨其抗氧化活性与抗疲劳作用的关系。主要研究结果如下：1．确定了鲐鱼多肽的最佳酶解工艺：鲐鱼是一种高蛋白（粗蛋白含量为16.40%）、低脂肪的原料，其氨基酸种类丰富，尤其是与抗氧化活性有关的氨基酸，如谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸含量较高，是一种制备抗氧化肽的优质原料。采用胰蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶水解鲐鱼鱼肉，综合比较了各水解产物的水解度、氮素回收率、DPPH自由基清除能力以及相对分子质量分布，最终确认中性蛋白酶为最佳用酶。在单因素实验基础上进行响应面优化实验，得到最佳条件为：加酶量1726.85U/g，pH值7.0，酶解温度39.55℃，酶解时间5.5h，液固比25:1。在最优条件下验证其DPPH自由基清除率为78.43%0.32，接近预测值79.19%。2．鲐鱼多肽的分离纯化技术研究：采用超滤法对鲐鱼多肽(MPH)进行分级得到5个组分，抗氧化活性表明，分子量小于2.5kDa的叁个组分(MPH-III，MPH-IV和MPH-V)抗氧化活性较高。离子交换色谱能够依据电荷数量的差异、凝胶色谱根据分子量大小的差异可对不同多肽进行有效的分离。本文采用SPSephadex C-25阳离子交换色谱和Sephadex G-25凝胶色谱依据电荷和分子量对MPHs (<2.5kDa)进行分离纯化研究，通过高效液相色谱分析，发现分子量为1664Da的多肽对DPPH自由基和羟自由基清除能力最强。3．鲐鱼多肽的稳定性研究：研究发现，鲐鱼低分子量的多肽热稳定性非常好，即使在100℃高温处理后也不会降低其抗氧化活性；冻融次数和紫外线照射对MPHs的DPPH自由基和羟自由基清除能力无显着性影响(P<0.05)；pH值对MPHs抗氧化活性影响较大，随着pH值增大，其DPPH自由基和羟自由基清除能力降低，当pH值为9.2时，MPHs的DPPH自由基清除率减少89%；MPHs对金属离子敏感，特别是Fe2+、Fe3+、Zn2+和Cu2+能显着降低MPHs的抗氧化活性，尤其是Fe2+和Fe3+浓度达到5mM时，其DPPH自由基清除率仅为1.1%和0.6%，Cu2+浓度达到5mM时则完全抑制了MPHs的DPPH自由基清除能力，而K+、Mg2+对MPHs抗氧化活性影响不显着(P<0.05)。4．鲐鱼多肽的抗疲劳功效评价：对分级得到的鲐鱼多肽MPHs进行了体内抗疲劳功效评价，结果表明：MPHs对小鼠体重和生长无影响，可提高小鼠肝脏系数、脾脏系数和胸腺系数，具有一定的免疫能力；MPHs能显着延长小鼠力竭游泳时间，MPHs低、中、高剂量组分别为对照组的2.8、3.0和4.8倍，其浓度与小鼠游泳时间呈正相关性；与对照组相比，MPHs各剂量组分别增加肝糖原含量33%50%，降低小鼠体内的乳酸、血尿素氮和丙二醛含量14%19%、16%17%和16%31%；，抗氧化物酶体系SOD和GSH-Px的活力分别提高11%15%和9%13%，表明MPHs具有一定的体内抗氧化活性。MPHs各剂量组中GSH-Px的活力与小鼠力竭游泳时间之间的相关系数达到0.912，说明MPHs在具有体内抗氧化活性的同时，还具有抗疲劳作用，两者之间具有很好的相关性。
杜帅, 宋茹, 郑斌, 杨会成, 罗红宇[4]2013年在《风味蛋白酶水解金枪鱼(Eleotridae)碎肉蛋白的动力学模型研究》文中研究说明本文对风味蛋白酶水解金枪鱼碎肉蛋白的特性进行了研究,采用测定不同底物浓度下的瞬时速率的方法来测定米氏常数Km值,探讨了水解时间、底物浓度与水解速率及水解度的关系,并拟合出水解时间与水解度之间关系的数学模型。结果表明:该酶解反应的米氏常数Km=0.0098,酶解过程的动力学方程为DH=8.621 ln(1+0.053t 0.0003[S]t)。通过动力学方程求得当酶浓度为200U/g时,最大临界初始底物浓度[S]为176.81g/L。验证实验表明此模型的可信度高(R2=0.99),实际值与拟合值基本吻合,可以用于模拟风味蛋白酶水解金枪鱼碎肉蛋白制备活性肽的反应过程和酶解条件的工艺优化。
崔帅[5]2018年在《酶解鲻鱼蛋白制备抗氧化肽的研究》文中研究表明鲻鱼(Mugil cephalus),我国重要的上层优质经济鱼类之一,广泛分布于我国东南沿海,尤其以浙江及广东省为甚。由于鲻鱼中蛋白质含量丰富,利用鲻鱼制备罐头制品或开发为功能活性产品对提高鲻鱼附加值具有重要意义。本文以鲻鱼蛋白为实验原料,运用可控酶解技术制备鲻鱼抗氧化肽,并对酶解条件进行充分优化,采用体外评价法来测定鲻鱼多肽的抗氧化活性及功能活性,通过凝胶层析及反相高效液相色谱等分离手段对鲻鱼多肽进行分离,旨在为鲻鱼的深加工以及提高其附加值提供理论依据与参考。主要工作及结果如下:1.营养成分研究结果表明鲻鱼肉湿基中蛋白质含量为18.12%,脂肪9.14%,内脏湿基中脂肪含量为24.78%。此外,鲻鱼蛋白中氨基酸构成比例均衡,必需氨基酸占比高,与抗氧化活性相关的氨基酸含量较高,如疏水性氨基酸,是一种制备抗氧化肽的优质原料。鲻鱼肉中含丰富的不饱和脂肪酸,其中具有生理活性功能的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量为34.3%。采用乙酸乙酯对鲻鱼肉进行脱脂,脱脂率可达84.83%,蛋白损失率为14.95%,脱脂提升了鱼肉的品质,降低了保存过程中油脂的氧化酸败程度(TBA值),有效提高了酶解产物的抗氧化活性。2.在最佳水解蛋白酶的筛选实验中,中性蛋白酶的酶解产物DP PH自由基清除率和可溶性蛋白含量最高,分子量主要在14.0kDa以下,被确定为最佳水解酶。在单因素实验的基础上,以DPPH自由基清除率为响应值,对中性蛋白酶水解鲻鱼蛋白制备抗氧化肽的条件进行优化,优化得到的水解条件为:酶解温度51℃,酶解pH7.3,酶解时间3.5h,加酶量5.8U/mg鱼蛋白。叁组验证性平行试验的平均DPP H自由基清除率为60.19%±0.57,接近模型的预测值59.16%,说明鲻鱼蛋白酶解物有着良好的抗氧化活性,为后续研究奠定了理论基础。3.采用多种体外抗氧化模型综合评价最优酶解条件下制备的鲻鱼多肽HGM-2,并对其功能性质做了初步研究。结果表明HGM-2拥有显着的抗氧化活性(DPPH自由基清除活性:IC50 0.786mg/mL;超氧阴离子清除活性:IC50 1.294mg/mL;铁还原能力:吸光度1.462,2.5mg/mL),较好的亚铁离子整合能力(71.7%,2.5mg/mL),较好的羟自由基清除能力(IC50,4.69mg/mL)以及抗脂质过氧化能力。此外,鲻鱼蛋白酶解后,溶解度、起泡性及乳化性均得到了不同程度的提升,乳化稳定性降低。4.对HGM-2进行分离纯化研究,结果表明HGM-2中的多肽分子量主要在1OkDa以下,且小于3kDa的组分占到了 50%以上,采用Sephadex-G25凝胶层析对鲻鱼粗多肽进行初步分离,得到4个组分F 1-F4,其中组分F4的抗氧化活性最好。F4经半制备型RP-HPLC分离后,得到B1-B6共6个组分,其中组分B4的DPPH清除活性最高,底物浓度为0.5mg/mL时的DPPH自由基清除率为80.42%±2.26,经分析型RP-HPLC分析知B4主要由两个多肽分子B4-1与B4-2构成,质谱分析结果表明B4-1与B4-2的主要成分分别为分子量452.3434 Da 和 339.2600 Da 的多肽。
游丽君[6]2010年在《泥鳅蛋白抗氧化肽的分离纯化及抗疲劳、抗癌功效研究》文中指出本文以泥鳅蛋白为原料,通过可控酶解技术制备抗氧化肽,利用体外化学模型和体内动物模型综合评价了泥鳅多肽的抗氧化活性。在此基础上利用动物模型评价其抗疲劳功效,利用细胞模型评价其抗癌功效。然后采用多种分离技术手段对泥鳅多肽进行分离纯化,并采用反相高效液相色谱联用电喷雾质谱对目标肽段进行一级氨基酸序列的鉴定,最后研究了泥鳅多肽在加工储藏过程中,以及在体外模拟胃肠道消化过程中的抗氧化活性稳定性。泥鳅是一种高蛋白(粗蛋白含量高达17.4%)、低脂肪的食品原料,适合于蛋白酶解生产活性多肽。泥鳅蛋白水解产物的抗氧化活性与酶的种类和水解度密切相关。当水解度增加至23%时,用Papain酶解的产物显示出很强的抗氧化性,其清除?OH、DPPH?、ABTS?+自由基和还原力分别为56.08%、95.48%、2.8033 mM Trolox和1.458。采用Alcalase2.4L、Protamex、Papain、PTN6.0S、Flavorzyme500MG五种酶来水解泥鳅蛋白,发现对泥鳅蛋白进行适度酶解能提高其营养价值(除了Flavorzyme500MG酶解产物外,各产物的氨基酸分均高于泥鳅蛋白),综合比较产物的蛋白质利用率、肽得率和水解度、DPPH?、?OH和O2-?叁种自由基清除能力的差异,最终选择Papain为泥鳅蛋白酶解的最佳用酶。采用响应面法优化泥鳅蛋白酶解工艺条件,得出最佳条件为:加酶量3‰(Papain活力为6×105 U/g)、酶解温度为55℃、酶解时间为4.5h,测得清除?OH的EC50值为17.00±0.54 mg/mL,与模型预测值16.76mg/mL无显着性差异(P>0.05)。采用6种体外化学模型综合评价泥鳅多肽的抗氧化活性,结果表明泥鳅多肽具有较强的体外抗氧化活性,其清除?OH、DPPH?能力、螯合铜离子能力、抑制脂质过氧化能力分别比相同摩尔浓度的谷胱甘肽高0.4、0.46、0.78和3.11倍(泥鳅多肽的平均分子量约为谷胱甘肽的5倍)。当泥鳅多肽质量浓度为谷胱甘肽浓度的3.5倍左右时,两者还原力相当。体内抗氧化活性结果表明泥鳅多肽能使小鼠体内的抗氧化酶系——超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力分别比空白组提高了1.7%-8.5%、36%-49%和13%-27%,表明泥鳅多肽具有较强的体内抗氧化活性。与空白对照组相比,泥鳅多肽可显着延长小鼠的力竭游泳时间达20%-28%;能延缓或减少小鼠运动时机体中葡萄糖和肝糖原的消耗,加速清除小鼠血液中乳酸和血清尿素氮的积累,还能提高小鼠体内抗氧化酶系的活力,证明泥鳅多肽可以提高小鼠游泳的耐力,具有抗疲劳功效。通过分析泥鳅多肽体内抗氧化活性与其抗疲劳功效之间的相关性,发现两者是显着相关的。细胞实验结果表明,泥鳅多肽对肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞Caco2和乳腺癌细胞MCF-7均有显着的抑制增殖作用。随着多肽浓度的增加,抑制作用增强,其EC50值分别为16.69 mg/mL、9.92 mg/mL和15.91mg/mL。采用超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、半制备型和分析型RP-HPLC等系列技术对泥鳅多肽进行了分离纯化,所得目标肽段清除?OH能力比分离前提高了9.14倍,也比相同摩尔浓度的GSH活性强11.6倍,说明分离纯化可显着地富集抗氧化肽。最后用RP-HPLC-ESI-MS-MS对功能肽段的氨基酸序列组成进行了鉴定,得到目标肽段的氨基酸序列为Pro-Ser-Tyr-Val,分子量464.2 Da。经肽谱库和美国化学文摘检索,该肽段为首次发现的具有显着抗氧化活性的四肽(清除?OH的EC50值为1.86±0.19mg/mL)。泥鳅抗氧化肽的稳定性研究表明泥鳅多肽的耐热性较好;耐光性较差,宜避光保存;在酸性和中性条件下其抗氧化活性变化不显着,在碱性条件下很快失活;Cu2+和Zn2+浓度的增加能显着降低其抗氧化活性(P<0.05),而Mg2+、Ca2+和K+则对其影响不显着;糖类对其抗氧化活性的影响大小先后顺序依次为:葡萄糖>蔗糖>海藻糖;冷冻和喷雾干燥方式对泥鳅肽抗氧化活性的影响不存在显着差异(P>0.05)。在模拟胃肠道消化过程中,胃蛋白酶主要将泥鳅多肽水解成小片段,而胰酶能将泥鳅多肽水解得更加彻底(分子量小于250Da的肽段增加了110%),释放出更多的游离氨基酸。模拟消化结束后,泥鳅肽组成中有38.1%是游离氨基酸,而肽的主要组分为分子量小于500Da的肽段,验证了多肽经胃肠道消化后主要以二肽、叁肽和四肽的形式被吸收,而非全部是氨基酸。与消化前的泥鳅肽相比,消化后的产物不仅抗氧化活性没有损失,而且生成了一些抗氧化活性更强的肽段,其清除?OH、ABTS?+自由基、还原力和螯合铜离子能力分别比消化前提高了12%、5%、77%和12%,说明泥鳅抗氧化肽具有较好的耐受胃肠道酶系消化的能力。
王伟[7]2008年在《可控酶解蚕蛹蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽及其构效关系的研究》文中进行了进一步梳理高血压是最常见的心血管疾病之一,它能造成大脑、心血管、肾脏的损害,是导致脑卒中、心力衰竭和冠心病等疾病的重要因素。天然食品中的降血压功能因子由于无副作用,已成为非药物控制高血压进程的理想选择。利用生物酶水解食物蛋白所生成的肽类能够表现出不同的生物活性,这些生物活性肽在消化降解和食物加工制作过程中可从其前体蛋白中释放出来。蚕蛹蛋白是一种高营养蛋白,我国每年的蚕蛹产量非常高,但是至今蚕蛹蛋白的综合利用途径还不完善,形成的产品附加值也不高。本研究通过可控酶解的办法,对利用蚕蛹蛋白制备具有降血压效果的血管紧张素转换酶抑制肽进行了系统研究。本文首先建立起了一种快速方便检测血管紧张素转换酶抑制肽活性的RP-HPLC方法,并优化了底物HHL与ACE酶作用转化为马尿酸(HA)的最佳反应当量,得出了HHL和ACE之间最优的定量关系是:HHL为5mM浓度时体积为6μL,ACE为0.1U/ml浓度下10μL。通过对蚕蛹蛋白酶解产物活性的测定,证明该方法具有快速、方便、准确的特点。通过利用不同蛋白酶对蚕蛹蛋白进行水解,得出酸性蛋白酶(Aspergillus usamii NO.537)水解的产物具有ACE抑制活性高、苦味低、色泽好、溶液稳定性好的特点,确定利用酸性蛋白酶作为水解蚕蛹蛋白的首选酶。通过单因子实验、部分因子优化和中心点组合设计实验,得出了酸性蛋白酶水解蚕蛹蛋白的最优的水解条件为水解温度35℃,水解时间4.92 h,酶比底物(w/w)为1%(相当于500U/g底物),底物浓度(水/蚕蛹蛋白)为14.94(w/v),pH为2.18,使水解产物的ACE抑制活性IC_(50)从单因子实验结果的2.5mg/mL增强到1.38mg/mL。利用传统的Osborne蛋白提取方法,根据每种蛋白组分的溶解特性的区别,提取到了四种蛋白组分,在蚕蛹蛋白中,蛋白组分的含量特点为清蛋白＞谷蛋白＞醇溶蛋白＞球蛋白。清蛋白组分为蚕蛹粉中的优势蛋白组分。对四种蛋白组分的氨基酸组成分析表明,清蛋白的必需氨基酸占总氨基酸的44.58%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为80.43%,比WHO/FAO提出的必需氨基酸占总氨基酸的40%,和必需氨基酸与非必需氨基酸之比为60%的参考蛋白模式要高。通过中心点实验优化方法得出了清蛋白的最佳提取条件为:水/蛋白原料在6.8,提取时间5h,使清蛋白的纯蛋白得率从17.39g/100g蛋白原料上升到26.41g/100g蛋白原料,提高了34%。总蛋白得率达到61.83%。了解潜在的具有抗高血压活性蛋白原料的具体组成成分,以及明确哪种蛋白组分对ACE抑制活性起主要贡献作用,对更好的开发该蛋白原料具有重要意义。通过对蚕蛹蛋白组分的分子量分布特点和其水解产物的分子量分布情况与其ACE抑制活性之间的关系进行研究,得出蚕蛹蛋白组分中,清蛋白组分的ACE抑制率最高,水解度也最高,表明清蛋白易于被酸性蛋白酶水解,所得小肽分子生物活性强。对清蛋白组分经酸性蛋白酶酶解后的产物,经过超滤、凝胶过滤、多维液相系统和离子阱质谱的逐步分离和检测,得出一个新的ACE抑制肽,其结构为“SEPTVF”,通过化学固相合成法合成六肽SEPTVF,检测ACE抑制活性,得出此活性肽ACE抑制活性的IC_(50)值为324μM。以20个已经公布了结构和活性数据的ACE抑制肽作为训练集,生成了ACE抑制肽的药效团模型(Hypo 1)。将从蚕蛹蛋白中得到的血管紧张素转化酶抑制肽(ser-glu-pro-thr-val-phe)与该选择的药效团模型Hypo 1进行迭合比较,识别其对ACE抑制活性起关键作用的结构部分,证明此活性肽的thr-val-phe部分对其ACE的抑制活性起主要作用。通过研究自发性高血压大鼠血压(spontaneously hypertensive rat,SHR)摄入清蛋白酶解产物前后动脉收缩压的变化,得出清蛋白酶解产物对自发性高血压大鼠具有短期和长期降低动脉收缩压的效果。本论文的研究结果为综合利用蚕蛹蛋白,利用蚕蛹蛋白制备具有高经济附加值的降血压活性肽制品提供了基础研究数据。
周雪松[8]2006年在《鸡肉蛋白酶解及其产物抗氧化活性研究》文中研究指明中国鸡肉产量居世界第二,但加工业的落后严重制约着鸡肉产业的可持续发展。本文旨在鸡肉蛋白资源的深加工利用,研究各种蛋白酶水解鸡肉蛋白的优化作用条件及内在规律,并对鸡肉蛋白酶解产物的营养、风味、外观和抗氧化活性进行研究,以期为鸡肉选择性酶解开发营养基料、调味基料和功能性基料提供理论基础和技术支撑。鸡肉成分分析表明鸡肉为高蛋白、低脂肪原料,氨基酸组成比例均衡,必需氨基酸、鲜味氨基酸、支链氨基酸、抗氧化性氨基酸含量高,但这些氨基酸在鸡肉蛋白组分(肌浆蛋白、肌原纤维蛋白和基质蛋白)中含量存在较大的差异;鸡肉蛋白及其各组分蛋白疏水性值较低。可见鸡肉是制备营养、调味和功能性基料的优质蛋白原料。采用差示扫描量热法分析鸡肉蛋白的热性质,研究鸡肉蛋白中SH、S-S含量随热处理温度的变化趋势,并通过考察产物成分变化分析酶解前热变性鸡肉蛋白的酶解过程影响。热变性不利于游离氨基酸、小分子量肽的释放和可溶性氮的回收,但有利于大分子量肽的生成。适度的热处理可提高鸡肉蛋白酶解产物中肽含量,因此可通过热处理调节鸡肉蛋白酶解产物的肽分子量分布和功能特性。选用Alcalase、Protamex、Neutrase、Papain、PTN 6.0S酶解鸡肉蛋白,优化各酶作用条件。各酶水解鸡肉蛋白产物中可溶性氮、氨基氮、肽基氮含量比较表明,Alcalase最适合鸡肉蛋白深度酶解,Papain、PTN 6.0S酶解产物肽含量较高;产物肽谱比较表明,各酶水解产物差异主要体现在10000Da以下肽段的分布,可通过选择合适的酶来控制酶解产物的肽分子量分布和功能特性。内切酶(Alcalase、Papain)和外切酶Flavourzyme复合酶解鸡肉蛋白不能提高产物的可溶性氮、小分子量肽含量,但能显着提高游离氨基酸含量。酶解过程中产物的鲜味、苦味、褐变程度分析表明鸡肉蛋白酶解产物是良好的风味基料,酶解前加入褐变抑制剂可有效减淡产物颜色。酶解24hr后各酶水解产物的必需氨基酸指数低于原料鸡肉蛋白,但均高于FAO/WHO(1973)推荐的成人理想氨基酸模式;各酶水解产物的氨基酸分除Neutrase酶解产物外,均高于原料鸡肉蛋白,可见对鸡肉蛋白选择性酶解能提高其产物营养价值。比较Alcalase酶解鸡肉蛋白不同组分与鸡肉蛋白规律表明,叁种蛋白组分都易被Alcalase作用降解成可溶性蛋白质,鸡肉蛋白酶解产物中的游离氨基酸主要来源于肌浆蛋白的降解,鸡肉蛋白酶解产物中4500Da以下肽段主要来源于肌浆蛋白的降解,4500～10000Da间肽段主要来源于基质蛋白的降解,肌原纤维蛋白对鸡肉蛋白产物组成的贡献相对较小。酶解后期反应变缓主要是因为体系中可被酶作用的底物减少,Alcalase酶解过程中其产物的必需氨基酸指数、氨基酸分并不是呈线性增加趋势,因此控制酶解鸡肉蛋白可提高其产物营养价值。抗氧化活性研究表明鸡肉水溶性抽提物、鸡肉蛋白酶解产物均具有较高的DPPH自由基清除活性和还原力,抗氧化指标还原力与DPPH自由基清除活性间没有直接的联系,水解度与抗氧化指标间也没有直接的相关性;凝胶色谱分离鸡肉水溶性抽提物、Papain酶解鸡肉蛋白4hr后产物肽段,均发现2200Da以下肽段的抗氧化活性最强,可能与其中含有肌肽、鹅肌肽有关;鸡肉蛋白酶解产物的抗氧化活性具有良好的热稳定性和贮藏稳定性。
饶国华[9]2006年在《利用低次烟叶蛋白制备生物活性肽及烟用香精的研究》文中研究说明本文利用碱溶酸沉法从低次烟叶中提取出可溶性蛋白质,研究了低次烟叶蛋白酶解物抗氧化和抑菌活性的变化规律,并通过超滤膜分离,确定了活性最强的肽段,同时以低次烟叶蛋白酶解物为原料,通过Maillard反应制备高质量的烟用香精。研究得到如下结论:烟叶蛋白提取过程中磨浆工艺的最佳水平组合为固液比1:17,提取液温度60℃,提取液pH8.0,磨浆两次;碱溶最佳工艺:温度60℃,pH8.0,时间60min,搅拌条件下提取叁次;酸沉过程中,pH3.0,4℃静置8hr效果最佳。蛋白酸沉提取率最高为86.71%,产品中蛋白质含量为70.66%。B1K级烟叶蛋白中必需氨基酸含量最高(41.80%)。低次烟叶蛋白利用不同蛋白酶(Papain、ProtamexTM和Alcalase2.4L)进行酶解,以水解度和肽提取率为指标,以Papain酶解效果最好,通过单因素和正交试验表明:Papain酶解低次烟叶蛋白最优条件:酶用量1.25%、pH6.5、60℃、底物浓度8.00%、搅拌下酶解6hr,肽提取率相对最高为37.42%。游离氨基酸含量随酶解时间的延长而增加,酶解24hr后水解产物中游离氨基酸总量为未酶解样品中的15倍左右。建立了木瓜蛋白酶酶解低次烟叶蛋白的动力学模型:酶失活动力学常数k d=0.0077 min-1;对酶解动力学模型验证表明,该酶解动力学模型在0-300min范围内与实际结果基本相吻合。酶解液体外抗氧化活性以5kDa组分最高。Papain酶解液对超氧阴离子自由基的抑制率最高(28.41%),接近VE(28.56%),ProtamexTM酶解液的抑制率次之(25.48%),Alcalase2.4L酶解液抑制率最低(24.55%)。清除DPPH自由基的能力以Papain酶解液最高为83.82%,ProtamexTM酶解液的清除率次之为80.08%,Alcalase2.4L酶解液清除率最低为71.93%,但均比VE差(93.24%)。叁种酶解液清除羟自由基清除的能力依次为:Alcalase2.4L酶解液(67.18%)>ProtamexTM酶解液(65.42%)>Papain酶解液(64.17%)。酶解液抗氧化活性组分分子量集中在3-5kDa。酶解液(酶解6hr)中,色氨酸、组氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量,在经Papain酶解后的原液和经5kDa超滤膜处理的透过液中均最高,分别为45.87mg/mL酶解液和81.44mg/mL酶解液,而经Alcalase2.4L酶解后,四种氨基酸的总含量均最低,分别为42.89mg/mL酶解液和79.18mg/mL酶解液。酶解液和经5kDa超滤膜处理的透过液的氨基酸组成有明显差异。低次烟叶蛋白经Papain酶解后的酶解液具有抑菌活性,且只抑制大肠杆菌的生长,酶解6hr的酶解液抑菌效果最好,其中以5kDa酶解液抑制效果最佳,对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.40g/L,高于尼泊金丙酯对大肠杆菌的最低抑菌浓度(0.35g/L)。pH值对5kDa酶解液抑制大肠杆菌活性的影响不明显,pH3.0-10.0时,5kDa的酶解液能高效抑制大肠杆菌的生长繁殖;高温处理对5kDa酶解液的抑菌能力影响不明显,5kDa酶解液具有良好的耐热性。液质联用分析结果表明:膜超滤方法能高效实现对低次烟叶蛋白酶解液的初级分离。复合酶解技术深度酶解低次烟叶,氨基酸转化率最高达36.94%,明显优于单酶酶解效果。利用低次烟叶深度酶解液,通过Maillard反应制得的烟用香精,给烟草制品增香调味效果明显,评吸评分最高为96分。通过气质联用色谱分析表明:Maillard反应产物的醚溶性成分中酸、醇、酯成分含量较高,特别是具有明显烤烟香味和甜味的成分含量比较高。
丁青芝[10]2008年在《脉冲超声辅助酶解法制备玉米黄粉ACEI活性肽的研究》文中研究指明高血压病是最常见的心血管疾病，常引起心、脑、肾等脏器的并发症，严重危害着人类的健康，因此关于高血压药物的研究越来越多。卡托普利等化学合成的血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类降血压药能够快速降低血压，但是存在咳嗽、首剂低血压效应、皮疹等副作用，所以人们把眼光更多地转向了安全性更高的食源性ACEI活性肽。为开发具有降血压功能的ACEI活性肽，本研究以玉米黄粉(CGM)为原料，通过超声辅助蛋白酶水解的方法制备出天然的ACEI活性肽，然后用超滤的方法对酶解液进行分离纯化，并通过动物试验考察了体内降血压效果。本课题开展了以下研究：以FAPGG(N-[3一(2-furyl)acryloyl]-L-phenylalanylglycyl-glycine)作为底物，以酶标板替代比色皿，以酶标仪替代分光光度计，建立了一种体外快速检测血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)活性的方法--微量法(MA)。经验证，该方法的准确性及精密度良好，检测快速、操作简便、灵敏度高。既适合大规模的活性筛选工作，也能应用于实际生产中的质量控制。用超临界CO_2脱除玉米黄粉中的油脂，脱除率接近90％，且脱脂后，酶解效果较处理前有所提高。测定了脱脂玉米黄粉的主要成分，其蛋白质、脂肪、水分、纤维、淀粉和灰分的含量分别为60．45％、0．43％、8．96％、1．62％、14．23％和0．21％。为了得到高活性、低苦味、低盐的降血压肽，分备用7种商业蛋白酶水解玉米黄粉。以酶解液的IC_50值为指标，选定两种效果较优的蛋白酶(蛋白酶D和E)进一步优化酶解条件。分别对这两种蛋白酶进行单因素(酶解时间、底物浓度、加酶量、pH和反应温度)及响应面优化试验，确定了酶解效果最好的蛋白酶E。优化得到蛋白酶E酶解玉米黄粉的最优条件为：酶解时间40 min，温度50℃，pH 7．0，底物浓度1．75％，加酶量3％，该条件下酶解产物的IC_(50)为0．259mg／mL，产品得率为28．75％。研究了蛋白质酶促水解制备活性多肽的反应机理，通过试验方法结合理论推导，建立了恒定温度下玉米黄粉可控水解动力学模型：V=as_0exp(-bh)==(?)和DH=(?)。求得该体系的热力学和动力学常数为：k_2=9．2732／min，k_d=3．8758／min，K_m=2．7222 g／L，K_s=72．7234 g／L，E_a=17．7936 kJ／mol，E_d=17．9691kJ／mol。动力学常数与温度的关系能较好地符合阿累尼乌斯关系式。验证试验表明，根据动力学模型得到的水解度的理论值与实际试验值基本吻合。因此，所建立的动力学模型可用于蛋白质酶解反应过程的模拟、热动力学常数的计算和生物反应器的设计。分别考察了脉冲超声预处理蛋白酶耦合酶解(PUPPE)、脉冲超声预处理玉米黄粉原料耦合酶解(PUPCE)和酶解过程中施加脉冲超声(PUAE)等叁种超声处理方式对玉米黄粉酶解制备ACEI活性肽效果的影响。结果表明，叁种方式都能有效地促进玉米黄粉的酶解，提高产物的ACE抑制活性，其中UPCE方式效果最好。该方式的最佳参数为：料液体积200mL，超声时间15 min，超声功率1000 W，超声料液初始温度50℃，脉冲超声工作间歇时间比2 s／1 s。与未超声的对照组相比，超声预处理原料后酶解产物的抑制活性提高了74．08％，生产效率提高了55．11％，蛋白转化率提高了55．06％，米氏常数K_m降低了33．30％。这表明脉冲超声辅助酶解法是一种高效制各玉米黄粉ACEI肽的方法。对超声波强化玉米蛋白酶解反应的机理进行了初步的探讨。研究了不同参数超声波对蛋白酶活性以及玉米蛋白可降解性的作用效果。以荧光和紫外光谱为监测手段，研究玉米黄粉蛋白和中性蛋白酶经超声处理后的分子构象变化情况。结果表明，随着超声功率增高，荧光发射强度逐渐发生变化，但发射峰未发生明显变化；紫外吸收强度发生变化，但吸收峰也未发生明显变化。这说明酶和蛋白分子中的整体构象未发生明显变化，但生色基团残基的微环境发生了一定的变化。此时，蛋白酶活力和玉米蛋白的可降解性均发生了明显变化，这表明超声微扰了蛋白和酶的活性部位，活力的变化快于分子整体构象的变化，这是因为酶或蛋白的活性部位位于柔性较大的区域。超声处理没有破坏玉米蛋白和蛋白酶的分子结构和整体空间构象，可能通过改变分子活性部位的局部空间构象，提高了玉米蛋白的可降解性和蛋白酶的催化活性。酶解液依次通过截留分子量10kDa、8kDa、5kDa、3kDa和1kDa的超滤膜进行分离纯化。以IC_(50)和产品得率为指标，选择3kDa的超滤膜。选择喷雾干燥方式对玉米黄粉降血压肽进行干燥，主要工艺参数为进风温度170℃、出风温度75℃。对相对分子量<3 kDa的玉米黄粉水解物进行热稳定性、耐酸碱稳定性和抗肠道酶解能力等性能研究。结果表明，玉米黄粉水解物在不同温度、pH值条件下保存以及与肠道酶在体外作用后仍然保持较高活性。用相对分子量<3 kDa的玉米黄粉水解物分别以75、150和300 mg／kg·bw的剂量对原发性高血压大鼠(SHR)灌胃，SHR的血压明显下降。用玉米黄粉水解物对SHR大鼠进行21天连续灌胃，发现降血压效果稳定。灌胃试验结果证实，玉米黄粉水解物对高血压大鼠具有明显的降血压作用，对血压正常大鼠无降血压作用。
参考文献：
[1]. 可控酶解从海洋鱼蛋白中制备生物活性肽的研究[D]. 林伟锋. 华南理工大学. 2003
[2]. 秋刀鱼蛋白抗氧化肽的分离纯化及其抗疲劳功效研究[D]. 刘丹. 华南理工大学. 2015
[3]. 鲐鱼多肽的抗氧化活性与抗疲劳作用研究[D]. 王雪芹. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2014
[4]. 风味蛋白酶水解金枪鱼(Eleotridae)碎肉蛋白的动力学模型研究[J]. 杜帅, 宋茹, 郑斌, 杨会成, 罗红宇. 海洋与湖沼. 2013
[5]. 酶解鲻鱼蛋白制备抗氧化肽的研究[D]. 崔帅. 浙江工商大学. 2018
[6]. 泥鳅蛋白抗氧化肽的分离纯化及抗疲劳、抗癌功效研究[D]. 游丽君. 华南理工大学. 2010
[7]. 可控酶解蚕蛹蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽及其构效关系的研究[D]. 王伟. 浙江大学. 2008
[8]. 鸡肉蛋白酶解及其产物抗氧化活性研究[D]. 周雪松. 华南理工大学. 2006
[9]. 利用低次烟叶蛋白制备生物活性肽及烟用香精的研究[D]. 饶国华. 华南理工大学. 2006
[10]. 脉冲超声辅助酶解法制备玉米黄粉ACEI活性肽的研究[D]. 丁青芝. 江苏大学. 2008
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