满旭[1]2013年在《白念珠菌锌簇转录因子编码基因表达与氟康唑耐药的关系》文中研究表明目的了解白念珠菌对氟康唑的体外药物敏感性。收集白念珠菌氟康唑耐药株和敏感株,检测锌簇转录因子编码基因UPC2、TAC1、MPR1和相关耐药基因CDR1、CDR2、MDR1、FLU1、ERG11的表达情况。进一步探讨白念珠菌锌簇转录因子与氟康唑耐药之间的关系。方法收集临床标本,通过芽管形成试验、显色培养基和厚膜孢子试验鉴定白念珠菌。采用M27-A2方案,进行白念珠菌对氟康唑的体外药物敏感性试验。抽提白念珠菌氟康唑耐药株组和敏感株组的总RNA,逆转录合成cDNA,采用实时定量PCR技术观察相关耐药基因在转录水平上的表达情况。结果共收集白念珠菌临床株379株。白念珠菌对氟康唑的敏感率为98.68%(374/379),剂量依赖敏感率为0.00%(0/379),耐药率为1.32%(5/379)。白念珠菌耐药株组UPC2、CDR2基因的表达量明显高于敏感株组(P<0.05),TAC1、MRR1基因的表达量两组之间无统计学差异。其中,耐药株组UPC2基因的表达量是敏感株组的7.22倍,CDR2基因的表达量是敏感株组的2.45倍。结论白念珠菌对氟康唑大多数菌株敏感而耐药株少,仍然可以用于临床上白念珠菌感染的治疗。UPC2、CDR2基因的高表达与氟康唑耐药有关,锌簇转录因子在耐药中的作用有待于进一步研究。耐药基因的高表达可能导致白念珠菌耐药性的形成,但并不是所有的白念珠菌耐药株都会同时出现上述基因的高表达。白念珠菌对唑类药物耐药是多种分子机制共同作用的结果,因此今后应进一步探索和完善耐药产生的机制,为临床提供参考和理论依据。
贺志彬[2]2003年在《白念珠菌耐药基因CDR1基因表达调控机制的初步研究》文中提出【背景】 白念珠菌作为常见的条件致病真菌，可以导致口腔、阴道及系统性念珠菌感染，尤其是在免疫功能下降患者中出现，主要有包括艾滋病、器官移植和使用免疫抑制剂的患者。常用于这种感染治疗的抗真菌药物有多烯类的两性霉素B和唑类的氟康唑、伊曲康唑，和许多细菌感染相同的是，随之用药时间的延长，逐渐出现了耐药的白念珠菌菌株。在过去的90年代，许多接受了长期小剂量的氟康唑治疗的HIV感染患者，出现了唑类耐药的白念珠菌。例如在一项研究中发现有33％的晚期艾滋病患者的口腔中分离到耐唑类药物的白念珠菌。最近，在包括器官移植等人群中也发现有唑类耐药的白念珠菌分离到。 从临床角度考虑这个问题，出现抗真菌药物治疗失败的真菌感染，其原因主要有：患者机体免疫状态的改变、不同的药物特性以及真菌对药物的敏感度。近几年来随着分子生物学技术的迅猛发展和抗真菌药敏试验方法的改进，白念珠菌出现唑类耐药现象的分子学机制目前比较明确的有，包括：1．包括氟康唑在内的唑类药物，其靶酶就是ERG11的基因产物：羊毛甾醇14α—去甲基酶，该酶参与了真菌麦角固醇的合成。唑类耐药就与ERG11基因发生点突变和过度表达密切相关；2．唑类药物外流也是导致唑类耐药的主要原因，而与之药物外流泵相关的基因有ATP结合盒转运子基因(ATP Binding Cassette Transporter)——CDR1、CDR2和主要易化子基因(Major Facilitator)——MDR1、FLU1，他们的过度表达可以导致唑类耐药的发生。 【方法】 本实验针对目前肾移植患者的免疫状态改变，通过检测从该人群分离到的白念珠菌对唑类药物的敏感度，观察筛选出的唑类耐药与敏感株在ATP结合盒转运子基因CDR1的mRNA表达差异情况，并试图通过检测CDR1上游调控序列是否存在的点突变来阐述该基因表达调控机制。 本课题共分为叁个部分：1．唑类药物对肾移植术后患者白念珠菌的药敏实验观察。收集我院近一年来肾移植术后患者临床分第二军医大学博士学位论文 月四门口离白念珠菌菌株，采用NCCLS推荐的M27．A检测方案对标准耐药／敏感自念珠菌和临床分离菌株进行吧类药物（氟康娃和伊曲康咬）的药敏实验观察，发现在肾移植术后患者中存在吐类耐药的白念珠菌。2．CDRI基因在白念珠菌哇类耐药／敏感菌株中的表达情况观察，对念珠菌的mRNA进行NORTHERN BLOT检查，发现哇类耐药株与敏感株在CDRI基因表达上存在显着差异。3．CDRI基因在氟康哩耐药／敏感白念珠菌菌株中调控序列的研究。通过PCR扩增该基因上游启动子调控序列，转化质粒扩增后测序未找到耐药／敏感菌株在调控序列上的任何点突变。【结果］1．观察到目前肾移植患者人群白念珠菌分离株可能存在吐类耐 药，并发现哇类耐药的发生与分离部位没有明显相关。2．观察到啥类耐药株与敏感株在 CDR基因表达上存在显着差 异。3．通过对 CDR基因的上游调控序列进行测序，发现耐药株和敏 感株之间未存在差异。 【结论］1．哇类耐药在肾移植患者人群中可能出现的严峻局面，小样本 的肾移植患者人群中分离到的白念珠菌把美耐药率为 36．8％ （氟康哩）～47．4％（伊曲康哇）；2．氟康吐及伊曲康哇之间存在交叉耐药；3．哇类耐药的发生与分离部位没有明显的相关；4．哇类耐药白念珠菌菌株比啥类敏感的CDRI基因表达要高：5．CDR基因在表达上存在差异与基因调控序列无关
王德俊[3]2006年在《白念珠菌锌簇转录因子FCR1的功能研究》文中研究说明FCR1基因是白念珠菌锌簇转录因子,它能够负向调控白念珠菌的多药耐药现象,但其调控的分子机制目前尚不清楚。本课题利用药物敏感性实验、罗丹明6G外排实验、薄层色谱分析、RT-PCR、Realtime-PCR等方法研究白念珠菌锌簇转录因子FCR1参与多药耐药的分子机制,证明FCR1基因在氟康唑诱导的条件下能够负向调控多药耐药基因CDR1、CDR2和MDR1的表达,增强白念珠菌的药物外排功能,从而使白念珠菌产生抗药性。另外,基因芯片杂交技术发现FCR1缺失以后不同功能分类的基因表达差异,说明FCR1基因可能参与白念珠菌多种生命活动。其中菌丝和毒力相关基因NAG2和CTA1表达上调,RPL6基因表达下调,通过菌丝诱导和毒力实验证明FCR1缺失能够负向调控白念珠菌菌丝的生长和毒力。
贺小圆[4]2017年在《克柔念珠菌临床分离株对伊曲康唑耐药的分子机制》文中进行了进一步梳理目的:本课题通过检测克柔念珠菌临床分离株不同组间的耐药基因表达差异,初步探讨其对伊曲康唑耐药的主要分子机制。方法:1.收集临床菌株:克柔念珠菌均来源于天津市第一中心医院从临床送检标本中分离的菌株,均经过科马嘉显色培养基、VITEK 2微生物鉴定系统和质谱仪鉴定标本。2.体外抗真菌药敏试验:按照ATB FUNGUS 3试条检测克柔念珠菌体外对伊曲康唑的敏感性,同时利用酵母样真菌微量稀释法药敏板对药敏结果进行验证,并根据MIC值将菌株分成3组:伊曲康唑敏感组(S)、剂量依赖性敏感组(SDD)、耐药组(R)。本实验质控菌株为近平滑念珠菌(ATCC 22019)和克柔念珠菌(ATCC 6258)。3.检测耐药相关基因的突变:提取克柔念珠菌基因组DNA,对靶酶基因ERG11进行扩增和测序,比较伊曲康唑敏感组、剂量依赖性敏感组和耐药组ERG11基因有无核苷酸突变差异。4.检测耐药相关基因的m RNA表达情况:提取克柔念珠菌总RNA,对其进行反转录,采用实时荧光定量RT-PCR,比较伊曲康唑敏感组、剂量依赖性敏感组和耐药组靶酶基因ERG11、外排泵编码基因ABC1和ABC2的m RNA表达差异。结果:1.本实验共收集16株克柔念珠菌临床菌株,其中伊曲康唑敏感组3株,剂量依赖性敏感组8株,耐药组5株;2.16株克柔念珠菌ERG11基因共存在7个突变位点,其中6个同义突变,1个错义突变(C44T),但叁组中均可出现该错义突变;3.克柔念珠菌临床分离株伊曲康唑耐药组ERG11基因m RNA表达量较剂量依赖性敏感组和敏感组高(分别P=0.015和P=0.002);耐药组ABC2基因m RNA表达量也较剂量依赖性敏感组和敏感组高(分别P=0.016和P<0.001),且剂量依赖性敏感组m RNA表达量高于敏感组(P=0.007);而耐药组ABC1基因m RNA量表达较低。1株同时耐伊曲康唑和伏立康唑的克柔念珠菌(CK10),其ERG11、ABC1和ABC2基因m RNA表达水平在所有耐药株中均为最高。结论:1.靶酶编码基因ERG11的基因序列存在单核苷酸多态性(SNP),未发现克柔念珠菌临床分离株存在与伊曲康唑耐药有关的突变位点。2.靶酶编码基因ERG11和外排泵编码基因ABC2的表达上调可能是克柔念珠菌临床分离株耐伊曲康唑的主要分子机制。
祝绍隆[5]2007年在《寡聚酰胺类化合物的合成及生物活性研究》文中认为含有吡咯和咪唑的寡聚酰胺是一类人工合成的小分子化合物,它能够高亲合力和特异性地在DNA的小沟中与DNA的特定序列进行识别并结合,从而起到调控基因表达的作用。白念珠菌耐药蛋白(Cdrp)是一种药物外转运蛋白,对多种抗真菌药物都具有外排功能,Cdrp表达量增加是其产生耐药性、特别是产生高度耐药性的主要机制之一。白念珠菌耐药基因激活因子(Tac1)是调控Cdrp表达的关键转录因子,其编码蛋白Tac1p通过与Cdrp基因CDR启动子序列上的药物效应单元(DRE)的CGG序列结合而发挥其上调作用。本课题以该DRE为靶标,以其结合位点CGG为核心,设计出新型的寡聚酰胺类DNA识别小分子,使之能够与CGG序列结合,以此阻断Tac1p与DRE的结合,干扰Tac1p对Cdrp表达的调控,从而影响白念珠菌的耐药蛋白基因表达。本研究以N-甲基吡咯和N-甲基咪唑为起始原料,通过硝化、硝基还原胺化、水解、缩合等反应成功的合成了单链型寡聚酰胺类短序列化合物NO_2PyImImCOOEt、NO_2ImImPyCOOMe和NO_2ImPyPyCOOMe,并对发卡型寡聚酰胺合成方法进行了研究,取得很大进展。化合物活性测试通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验,初步筛选出能与目的基因结合的化合物NO_2PyImImCOOEt、NO_2ImImPyCOOMe;并将NO_2PyImImCOOEt进行与FCZ对白念珠菌的体外联合诱导实验,成功获得联合诱导耐药性不产生的诱导菌株;最后通过荧光定量Real Time RT PCR技术监测到该菌株内CDR1和CDR2基因表达量并未升高,起到抗耐药作用。另外,化合物NO_2ImImPyCOOMe与目标基因也有很好的结合力,进一步研究正在进行中。本课题初步系统的建立了由计算机辅助设计、化合物合成、DNA结合试验、生物活性筛选和耐药机制研究组成的人工基因调控抗真菌耐药研究的技术平台,以此研究抗真菌耐药的药物。
武思彤[6]2018年在《黄连素增强氟康唑对耐药白色念珠菌的作用机制研究及其生物信息学分析》文中研究表明目的本研究旨在研究中药黄连素(berberine,BBR)增强氟康唑(fluconazole,FLC)对耐药白色念珠菌的增敏作用及可能的机制,并通过全基因组测序分析获得耐药相关的基因及毒力因子,并进一步探讨中药BBR与FLC联合用药作用下抑制相关耐药基因且分析可能参与的信号途径和代谢通路。方法收集2015年1月-2016年6月宁医大总院住院标本24株,利用微生物检测仪及科马嘉鉴定菌种,根据NCCLS M44-A纸片扩散法筛选出耐药菌株并测定其抑菌圈直径;通过结晶紫染色测定菌株的产膜能力;采用微量棋盘稀释法来检测FLC与BBR的抗菌活性的MIC值;时间-杀菌曲线法测定BBR与FLC随时间变迁的杀菌效果及动态杀菌作用;采用荧光FITC-ConA染色观察菌株生物膜在药物作用下的生长形态;利用qRT-PCR检测目的基因CDR1、MDR、ALS3、ERG11、TUP1、HWP1的mRNA的表达变化;利用全基因组测序结果,分析KEGG代谢通路中麦角固醇ERG基因的在不同药物处理下的表达量变化。结果从临床尿管插管患者标本中分离出一株中产膜型FLC耐药白色念珠菌;结晶紫染色后可以观察到弱产膜菌以酵母样形式存在伴随着少量菌丝生长,中产膜菌株可见中等量的菌丝和酵母样菌落形成,而强产膜菌株大部分以菌丝相生长和少量微菌落;棋盘法测定,显示单用FLC药物治疗时对中产膜型耐药菌株的抑制率很低,当浓度达64μg/ml时抑制率仍<40%,而单用FLC处理达到MIC60时用药为512μg/ml,BBR的加入使FLC药物浓度下降16个折点多,与单用FLC相比,差异有统计学意义(P<0.05);利用qRT-PCR检测目的基因CDR1、MDR、ALS3、ERG11、TUP1、HWP1的mRNA的表达变化,在FLC与BBR联合用药时与单用FLC时相比明显降低(P<0.05);根据水-烃两相分离的原理检测,显示,加入BBR后与单用FLC相比,细胞表面疏水性有所降低;针对测序结果,发现该基因组包含6276个基因,小卫星序列2384个,t RNA 144个,snRNA 32个,763个毒力相关的基因,通过系统发育树发现与菌株P3408的亲缘关系较近且核酸共线性较好;GO功能分类显示,该菌株的基因主要参与外排转运、细胞粘附、菌相转换、免疫应答等功能;KEGG统计图发现该菌株的代谢基因主要来自氨基酸与碳代谢,代谢通路图发现大量麦角固醇类ERG基因参与细胞膜固醇合成途径,可能与耐药有关,药物联用发现ERG1、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG24、ERG25和ERG9基因有不同程度的升高或降低,与单用FLC相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论(1)白色念珠菌经培养后形成生物膜,随着时间的延长其细胞及菌丝不断增多,生物膜形成明显(2)生物膜型白色念珠菌的不断成熟对FLC的耐药性增强,而加入BBR药物后可增强生物膜型耐药菌株对FLC的药物敏感性。(3)BBR增强FLC对产膜型耐药白色念珠菌的可能机制(1)降低外排泵基因CDR1、MDR1及粘附基因ALS3、HWP1的表达(2)增加进入胞内的药物浓度从而抑制了靶酶活性降低了ERG11基因的表达(3)菌丝阻遏物TUP1的过表达减少了生物膜的形成。(4)BBR可增强FLC降低白色念珠菌细胞膜固醇类蛋白基因的表达,提高菌株对药物的敏感性。
阎澜[7]2009年在《白念珠菌耐药性产生的“线粒体氧化呼吸抑制”机制》文中认为白念珠菌易于感染、难以防治的主要原因在于其具有“高适应性”的特点,主要表现为高致病性和高耐药性。近年来,白念珠菌适应氧化刺激的机制受到日益关注。本课题前期研究结果提示,白念珠菌线粒体氧化呼吸功能的改变在其适应性耐药性形成过程中可能也发挥着重要作用,即白念珠菌耐药子代的线粒体氧化呼吸功能减弱,代偿性加强细胞质内糖酵解、乙醛酸循环等代谢途径以供能,从而使氟康唑不能有效促进其内源性活性氧升高,使其对氟康唑的敏感性下降。因此,深入研究白念珠菌线粒体呼吸功能与其药物敏感性的关系对进一步阐明白念珠菌耐药机制具有重要意义。目的从多方面、多层次地阐明我们所提出的“线粒体氧化呼吸抑制”假说:一方面,使用线粒体呼吸链抑制剂阻断或抑制白念珠菌线粒体氧化呼吸,考察菌株对唑类药物的敏感性是否降低。另一方面,通过抑制糖酵解的酶活性,阻断糖酵解代谢通路,或者使用氧化磷酸化解偶联剂,进而增强线粒体氧化呼吸,考察白念珠菌对唑类药物的敏感性是否升高。同时,通过靶向敲除和原位高表达线粒体醛脱氢酶ALD5基因,考察该基因对于白念珠菌线粒体呼吸、对唑类药物敏感性的影响,从而间接证明线粒体呼吸功能在白念珠菌耐药性形成中的作用。此外,考察白念珠菌ERG3、ERG11、TAC1基因耐药相关特异性突变位点;考察白念珠菌新基因ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518的耐药相关功能。方法(一)通过点板实验和抑菌圈实验,分别考察氰化钾和水杨基氧肟酸作用下,白念珠菌对唑类药物敏感性的变化。通过抑菌圈实验,考察白念珠菌交替氧化酶AOX基因缺失菌分别在氰化钾和水杨基氧肟酸作用下,对唑类药物敏感性的变化。通过荧光染色,检测白念珠菌交替氧化酶AOX基因缺失菌在咪康唑或苯菌灵作用下的细胞内活性氧水平。通过棋盘式微量液基稀释法检测氟康唑与水杨基氧肟酸联合用药的抑菌效果。通过抑菌圈实验,分别考察氧化磷酸化解偶联剂、7%乙醇、6-磷酸海藻糖作用下,白念珠菌对唑类药物敏感性的变化。(二)采用Ura-blast策略,构建含有目的基因上、下游同源重组片段的URA3-HisG-URA3敲除盒,醋酸锂法转染白念珠菌,通过两次同源重组,使亲本菌的ALD5基因被敲除盒同源重组,从而构建ALD5基因缺失菌,并通过基因组DNA的套式PCR和southern杂交验证。构建ALD5基因高表达质粒,将ALD5基因完整开放阅读框置于pCaEXP高表达载体中MET3启动子的控制下;醋酸锂法转染白念珠菌ALD5基因缺失菌,PCR鉴定ALD5基因的原位整合,实时定量PCR筛选ALD5基因表达量明显升高的菌株。利用微量液基稀释法和点板法考察ALD5基因缺失菌在不同碳源培养基上对唑类药物的敏感性是否改变;通过流式细胞仪检测ALD5基因敲除菌的细胞周期;通过荧光显微镜检测ALD5基因敲除菌的细胞膜、细胞核形态;分别使用不同培养条件,考察ALD5基因敲除菌的菌丝形成能力和生物膜形成能力;与哺乳动物巨噬细胞共孵育,考察ALD5基因敲除菌对巨噬细胞的敏感性;通过荧光染料检测ALD5基因敲除菌的线粒体膜电位和内源性活性氧水平。(叁)以白念珠菌敏感亲本y0109S和耐药子代y0109R基因组DNA为模板,PCR扩增ERG3、ERG11、TAC1基因全长开放阅读框,并与白念珠菌基因组数据库比对,分析基因突变位点。(四)分别构建含有目的基因ORF19.1510上、下游同源重组片段的HIS1、LEU2敲除盒,醋酸锂法转染白念珠菌,通过两次同源重组,使亲本菌的ORF19.1510基因被敲除盒同源重组,从而构建ORF19.1510基因插入失活缺失菌,并通过基因组DNA套式PCR验证。按照同样方法,分别构建ORF19.3216、ORF19.5518基因插入失活缺失菌。通过荧光显微镜分别检测ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518基因敲除菌的细胞膜、细胞核形态;分别使用不同培养条件,考察ORF19.1510基因敲除菌的菌丝形成能力;利用微量液基稀释法和点板法分别考察ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518基因缺失菌对唑类药物、盐刺激、渗透刺激、过氧化氢刺激、DNA抑制剂的敏感性是否改变;通过流式细胞仪分别检测ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518基因敲除菌的细胞周期。结果(一)氰化钾作用下,含唑类药物培养基上存活菌落数量增加、含唑类药物纸片周围抑菌圈明显缩小,即菌株对唑类药物的敏感性降低。水杨基氧肟酸作用下,含唑类药物纸片周围抑菌圈明显扩大,即菌株对唑类药物的敏感性升高。白念珠菌交替氧化酶AOX1b基因缺失菌在氰化钾作用下,含唑类药物纸片周围抑菌圈缩小,但是缩小程度弱于亲本菌和AOX1a基因缺失菌。咪康唑或苯菌灵作用下,AOX基因缺失菌的细胞内活性氧升高程度明显高于亲本菌,而AOX基因高表达菌的细胞内活性氧升高程度明显低于亲本菌。水杨基氧肟酸与氟康唑体外联合使用,能明显降低氟康唑的最低抑菌浓度,对白念珠菌特别是耐药菌株,产生明显协同抑菌作用。氧化磷酸化解偶联剂作用下,含唑类药物纸片周围抑菌圈明显扩大,即菌株对唑类药物的敏感性升高。7%乙醇作用下,含唑类药物纸片周围抑菌圈明显扩大,即菌株对唑类药物的敏感性升高。6-磷酸海藻糖作用下,含唑类药物纸片周围抑菌圈无明显变化,即菌株对唑类药物的敏感性未改变。(二)分别通过PCR扩增、酶切、测序验证ALD5基因敲除盒构建正确;通过基因组DNA套式PCR和Southern杂交验证ALD5基因一条等位基因敲除菌、两条等位基因敲除菌构建正确。通过酶切和测序验证ALD5基因高表达质粒构建正确;通过PCR验证ALD5基因高表达菌株构建正确,并通过实时定量PCR筛选得到一株ALD5基因表达量相对较高的菌株。在非发酵碳源的培养基内,ALD5基因敲除菌的生长倍增时间延长;ALD5基因敲除菌呈椭圆球形,以一端或两端极化出芽生长;在液体和固体培养条件下,ALD5基因敲除菌的菌丝形成能力与亲本菌相当,生物膜形成能力略增强;ALD5基因敲除菌在巨噬细胞存在时的存活率与亲本菌相当;ALD5基因敲除菌的线粒体膜电位水平与亲本菌无明显差别;在含有过氧化氢、氯化钠、山梨醇的培养基上,ALD5基因敲除菌的存活菌落数量与亲本菌相当。随着孵育时间的延长,ALD5基因敲除菌对唑类药物的敏感性明显降低;在乙醇、乙酸等非发酵碳源培养基上,ALD5基因敲除菌对唑类药物的敏感性略降低;咪康唑作用下,ALD5基因敲除菌细胞内活性氧升高程度明显低于亲本菌。(叁)敏感亲本y0109S和耐药子代y0109R的ERG11基因均无点突变;耐药子代y0109R的ERG3基因存在D19E突变;耐药子代y0109R的TAC1基因存在L47K和N977K突变。(四)通过融合PCR扩增得到含有目的基因ORF19.1510上下游同源重组片段和标记HIS1、LEU2的敲除盒,通过基因组DNA套式PCR验证ORF19.1510基因一条等位基因敲除菌、两条等位基因敲除菌构建正确。按照同样方法和原理,成功构建ORF19.3216、ORF19.5518基因敲除菌。与亲本菌相比,ORF19.1510基因缺失菌在完全培养基和极限培养基中对数生长期的倍增时间无明显变化;ORF19.1510基因缺失菌单个细胞增大,可从细胞表面多个方位不规则出芽生长;ORF19.1510基因缺失菌在各种诱导条件下菌丝形成能力明显降低;ORF19.1510基因缺失菌对唑类药物、氯化钠的敏感性明显升高;ORF19.1510基因缺失菌对过氧化氢、山梨醇的敏感性无明显变化;ORF19.1510基因缺失菌对DNA单链抑制剂甲磺酸甲酯、羟基脲的敏感性明显降低,对DNA双链抑制剂腐草霉素的敏感性升高;ORF19.1510基因缺失菌的细胞周期在G2/S期转变发生阻滞。与亲本菌相比,ORF19.3216、ORF19.5518基因缺失菌形态、菌丝形成能力、细胞周期、对唑类药物、盐刺激、过氧化氢刺激、渗透刺激的敏感性等表型均无明显变化。结论(一)白念珠菌经典氧化呼吸通路(细胞色素途径)受到抑制或阻断,转而使用交替氧化为主要电子传递通路时,可明显降低菌株对唑类药物的敏感性;使用氧肟酸化合物抑制白念珠菌交替氧化呼吸通路,可明显升高菌株对唑类药物的敏感性。白念珠菌在唑类药物作用下,其交替氧化酶可被药物作用后升高的内源性活性氧所诱导高表达,从而发挥电子分流作用,在一定程度上减少真菌细胞内活性氧水平,削弱药物的抑菌作用,进而降低菌株对唑类药物的敏感性。这是白念珠菌耐药性产生的新机制之一。白念珠菌根据生存环境变化及时调节电子在细胞色素途径和交替呼吸途径的流量,并减少活性氧产生,是其高适应性的表现之一。(二)白念珠菌醛脱氢酶Ald5p主要参与细胞内乙醛代谢,不改变细胞周期进展,有助于维持真菌细胞在非发酵碳源环境中的生存。CaAld5p有助于维持白念珠菌细胞呈圆球形形态,略降低菌株的生物被膜形成能力;但是不改变细胞以一端或两端为主的极化出芽生长方式,不改变酵母态细胞向菌丝态细胞的转变,不改变菌株对哺乳动物巨噬细胞的敏感性,也不改变白念珠菌对外源性氧化刺激、盐刺激、渗透刺激的敏感性。白念珠菌Ald5p不影响其线粒体膜电位水平,但是,可以增加将线粒体内乙醛转变为乙酸时产生的还原态NADPH,从而增加细胞内活性氧水平,增加菌株对唑类药物的敏感性。(叁)白念珠菌TAC1基因可因N977K突变而使转录因子Tac1p活化,并调控其靶基因CDR1、CDR2、PDR17等高表达,进而表现出对唑类药物敏感性降低。白念珠菌ERG3基因可因D19E突变而使Erg3p功能受到抑制,并改变白念珠菌甾醇代谢通路,麦角甾醇含量减少,中间代谢产物和麦角甾醇替代物含量增加,进而表现出对唑类药物敏感性降低。(四)白念珠菌新基因ORF19.1510有助于维持菌株的细胞周期G2/S期转变,有助于白念珠菌由酵母态向菌丝态的转变;可明显降低菌株对唑类药物、盐刺激、DNA双链抑制剂的敏感性,明显升高菌株对DNA单链抑制剂的敏感性。白念珠菌新基因ORF19.1510、ORF19.3216、ORF19.5518的功能有待进一步研究。
马晓丽[8]2013年在《氟康唑和黄芩苷联合对耐氟康唑的白念珠菌ABC转运蛋白的影响》文中指出目的：1.研究氟康唑和黄芩苷单用以及联合应用对标准菌株、临床分离的对耐氟康敏感菌株和临床分离的对氟康唑耐药的白念珠菌菌株(即白假丝酵母菌)MIC的影响。2.氟康唑和黄芩苷单用与联合应用对白念珠菌耐药株细胞膜上主动外排基因CDR1、CDR2表达水平(mRNA)的影响以及对基因表达产物ABC转运蛋白的影响的研究。方法：1、采用(ATCC)标准白念珠菌菌株和临床分离的对氟康唑敏感和对氟康唑耐药的菌株：通过微量稀释法进行氟康唑、黄芩苷两种药物敏感性实验研究(根据美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)制定的M27-A方案)；2、采用棋盘式微量稀释法检测黄芩苷与氟康唑联合用药对白念珠菌的抑菌效果,以部分抑菌浓度指数来评价；3、用RT-PCR法检测临床分离敏感菌株、耐药株和标准株的主动外排基因CDR1、CDR2的表达水平(mRNA)。4.采用检测氟康唑和黄芩苷单用和联合应用后标准菌株和临床分离的敏感,耐药菌株的细胞外液中罗丹明6G的浓度,来间接检测ABC转运蛋白的外排情况,从而明确ABC转运的外排活性的高低,来进一步观察CDR1.CDR2基因表达产物ABC转运蛋白的表达水平。5.统计学方法采用单侧t检验。结果：1、氟康唑、黄芩苷对白念珠菌标准菌株,临床分离的对氟康唑敏感和耐药菌株的MIC分别为4mg/ml、4μg/ml,2mg/ml、1ug/ml,8mg/ml,64ug/ml；2、氟康唑、黄芩苷联合用药对标准、临床分离的对氟康唑敏感和耐药菌株的MIC分别为0.5mg/ml、1μg/ml, FICI=1/4+0.5/4=0.375<0.5,0.25mg/ml、0.125μg/ml, FICI=0.25/2+0.125/1=0.25<0.5;2mg/ml,16μg/ml, FICI=1/8+16/64=0.375<0.5表明黄芩苷与氟康唑合用具有较强协同抗菌作用；3、标准菌株在未用药时CDR1.CDR2均未见表达,在用氟康唑和黄芩苷前后均未出现CDR1, CDR2表达水平的明显差异(P>0.05),在氟康唑和黄芩苷联用后出现CDR1的表达,而CDR2未见表达；临床分离的敏感菌株在未用药时CDR1低表达,CDR2未见表达,应用氟康唑和黄芩苷单独和联合用药后CDRl表达水平均升高(P<0.05), CDR2表达水平无差异(P>0.05)；临床分离的耐氟康唑的菌株未用药时见CDR1.CDR2的表达,在应用氟康唑和黄芩苷单独处理和两种药物联合处理后均出现CDRl表达水平升高(P<0.05),并伴有CDR2的表达水平上调(P<0.05)。4.叁株菌株在未用药时细胞外液的罗丹明6G浓度在加入葡萄糖后升高,在加入氟康唑和黄芩苷单独用药时,均出现细胞外液罗丹明6G浓度升高水平降低(P<0.05),并且黄芩苷单独用药组升高水平较氟康唑单独用药组升高水平高(P<0.05),两种药物联合应用时细胞外液罗丹明6G浓度升高水平显着低于氟康唑和黄芩苷单独用药组(P<0.05)。结论：1、黄芩昔、氟康唑对白假丝酵母菌均有不同程度的抑制作用,各自的MIC有所差异,它们联合用药与各自单用药对白假丝酵母菌的MIC值相比较有所减低,且FICI<0.5,两药的相互作用为协同作用。2.黄芩苷和氟康唑均能上调耐氟康唑白念珠菌的CDRl的基因表达,并能抑制ABC转运蛋白的外排功能。3.CDR2基因的表达可能于CDRl基因的表达有关。
秦玉璘[9]2016年在《PHO4、HAP2基因参与白念珠菌唑类药物耐受的调控机制研究》文中指出研究目的:利用白念珠菌转录因子缺失菌库,筛选不同缺失菌对抗真菌药物敏感性差异,发现对药物敏感性产生显着影响的转录因子,进而考察该转录因子对白念珠菌药物敏感性的影响作用及调控机制。研究方法:通过微量液基稀释法、点板实验(Spot Assay)进行白念珠菌转录因子缺失菌的药物敏感性的筛选。采用实时定量PCR(Realtime-PCR)的方法检测白念珠菌转录因子缺失菌中与耐药性相关的外排泵等相关基因的转录水平,并通过罗丹明6G外排实验,进一步考察白念珠菌外排泵活性。通过测定胞内ATP水平和线粒体膜电位,考察药物外排泵活性改变是否与线粒体呼吸功能及能量代谢异常有关。利用铁离子螯合剂红菲绕啉(BPS)考察缺失菌株铁代谢情况。通过生长曲线法考察菌株对活性氧类物质H2O2的敏感性,并测定胞内活性氧水平。Realtime-PCR实验考察抗氧化相关基因的表达并检测菌株胞内还原酶活性。实验结果:通过药物敏感性筛选发现,与亲本菌SN250相比,pho4△/△和hap2△/△对唑类药物的敏感性显着增加。pho4△/△对唑类抗真菌药敏感,对罗丹明外排能力减弱,但耐药相关基因CDR1,MDR1以及ERG11的表达却有所增加。进一步考察发现,pho4△/△对H2O2的敏感性显着增加,菌株抵抗氧化应激的能力下降,胞内活性氧水平下降。考察突变株的线粒体功能,发现ATP含量下降,线粒体膜电位略升高。HAP2基因缺失导致白念珠菌对抗真菌药物的敏感性增高,药物外排泵编码基因CDR1,MDR1以及耐药相关基因ERG11转录水平下降,突变株对罗丹明6G外排能力降低,即药物外排泵活性下降。HAP2基因缺失导致菌株在缺铁环境中生长减慢,胞内铁离子含量降低。缺失了HAP2基因的菌株,线粒体呼吸链复合物Ⅱ主要成分琥珀酸脱氢酶编码基因SDH2表达下降,胞内ATP水平和线粒体膜电位均降低,菌株能量代谢异常,胞内ROS浓度与野生型没有差异,但与铁离子匮乏相一致的是,在咪康唑诱导下,其ROS产生的能力显着低于野生型,同时,抗氧化基因SOD4,GLR1,TRR1以及胞内GSH含量显着增高。结论:转录因子Pho4的缺失可能通过降低白念珠菌的抗氧化应激能力,减弱对药物的外排作用而导致对唑类药物敏感,但其具体的调控机制有待进一步研究。HAP2基因是铁代谢相关的重要转录因子,该基因缺失导致白念珠菌铁离子摄取降低,铁代谢异常。由于铁离子是众多酶促反应的辅助离子,在缺失HAP2基因的白念珠菌中,菌株能量代谢异常,ATP产生减少,进而减少了ABC转运蛋白、易化扩散超家族蛋白转运所需的能量,最终导致突变株对唑类药物的敏感性增加。与此同时,咪康唑诱导下的胞内活性氧形成能力降低与铁离子匮乏呈正相关,HAP2缺失菌中胞内活性氧没有差异,但在咪康唑诱导下,其活性氧形成能力降低,菌株胞内抗氧化还原基因转录水平升高,还原酶活性增高。
张新成[10]2006年在《白念珠菌耐药性与唑靶酶基因ERG11表达水平关系的研究》文中研究指明为了研究白念珠菌14α-去甲基化酶(14-DM,唑靶酶)的改变(蛋白表达水平和mRNA表达水平)与其产生耐药性的关系。本实验对标准菌株、临床分离的敏感株及其进行人工诱导的耐药株和临床分离的耐药菌株,从蛋白表达水平和mRNA表达水平进行了研究,通过实时荧光定量RT-PCR方法检测了14-DM的编码基因ERG11 mRNA的表达水平,并对其进行了原核表达、多克隆抗体制备和Western-blotting检测。结果表明,白念珠菌ERG11基因的mRNA和蛋白表达水平与其耐药水平具有一定的相关性。
参考文献：
[1]. 白念珠菌锌簇转录因子编码基因表达与氟康唑耐药的关系[D]. 满旭. 天津医科大学. 2013
[2]. 白念珠菌耐药基因CDR1基因表达调控机制的初步研究[D]. 贺志彬. 第二军医大学. 2003
[3]. 白念珠菌锌簇转录因子FCR1的功能研究[D]. 王德俊. 第二军医大学. 2006
[4]. 克柔念珠菌临床分离株对伊曲康唑耐药的分子机制[D]. 贺小圆. 天津医科大学. 2017
[5]. 寡聚酰胺类化合物的合成及生物活性研究[D]. 祝绍隆. 第二军医大学. 2007
[6]. 黄连素增强氟康唑对耐药白色念珠菌的作用机制研究及其生物信息学分析[D]. 武思彤. 宁夏医科大学. 2018
[7]. 白念珠菌耐药性产生的“线粒体氧化呼吸抑制”机制[D]. 阎澜. 第二军医大学. 2009
[8]. 氟康唑和黄芩苷联合对耐氟康唑的白念珠菌ABC转运蛋白的影响[D]. 马晓丽. 昆明医科大学. 2013
[9]. PHO4、HAP2基因参与白念珠菌唑类药物耐受的调控机制研究[D]. 秦玉璘. 第二军医大学. 2016
[10]. 白念珠菌耐药性与唑靶酶基因ERG11表达水平关系的研究[D]. 张新成. 吉林大学. 2006
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