陈灵芝[1]2004年在《镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶基因的克隆及免疫效果研究》文中研究说明蜱是家畜家禽的一类体表寄生虫，分布广泛，可传播由细菌、病毒、立克次体、螺旋体和血液原虫等引起的多种疾病，不仅给畜牧业造成很大的经济损失，同时还影响人类健康。我国目前发现的蜱种有100多种，其中，镰形扇头蜱是我国南方的优势蜱种，主要传播牛巴贝斯虫病、马巴贝斯虫病和吉氏巴贝斯虫病。目前对蜱的控制主要使用化学杀虫剂。然而，随着蜱抗药性以及畜产品的药物残留等问题的出现，寻找新的抗蜱方法就显得尤为重要。相对于化学杀虫剂来说，免疫预防被认为是一种最有前途的控制蜱的方法。据报道，半胱氨酸蛋白酶在寄生虫的发育、营养等生命活动中有不可缺少的生物学功能，被认为是一类抗虫疫苗和药物研究的重要分子。本研究以镰形扇头蜱为研究对象，通过从镰形扇头蜱体内克隆半胱氨酸蛋白酶基因，并在体外表达，分析其功能，为蜱及蜱传疾病的防制作一些探索性工作。首先，根据半胱氨酸蛋白酶的保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子特性设计基因特异性引物GSP=5’-ACCAGGGCCAGTGCGGCTCCTGCTG-3’，用于3’-RACE扩增，PCR产物经纯化、连接入pGEM-T质粒载体、转化大肠杆菌DH5α和测序。根据测序结果，设计基因特异性引物用于5’-RACE扩增，cysA：GSP1=5’ -AGTGTCCAGCGTCAATGGCTA-3’，GSP2=5’-GATGTCTACAAAGCCGGTGTCGGTTG-3’，nested GSP=5’-ACCAGGGCCAGTGCGGCTCCTGCTG-3’； cysB：GSP1=5’-TAGACACCTTCCGAGTAGAAC-3’ ，GSP2=5’-CGTGGCTGGCGTCGATGGCAACTGAGAC-3’，nested GSP=5’ACCAGGGCCAGTGCGGCTCCTGCTG-3’。5’-RACE的PCR产物经纯化、连接、转化和测序。根据测序结果，设计基因特异性引物用于扩增全长基因，cysA：GSP3=5’-GAGCTCTCCACCAGGTGCACC-3’， cysB：GSP3=5’-AGGTCACTTGGGGTCTC CGGC-3’ ，PCR产物经纯化、连接、转化和测序分析，结果得到两个全长基因序列，分别命名为cysA和cysB。cysA全长1168bp，编码332个氨基酸，预测分子量为36kDa；cysB全长1153bp，编码335个氨基酸，预测分子量为37kDa。经网上blast分析，这两个基因均与其它蜱种和物种的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶有高度同源性，两者均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点处的保守性氨基酸序列，因此确定cysA和cysB均为镰形扇头蜱两个组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶基因。其次，运用RT-PCR方法分析cysA、cysB在镰形扇头蜱中的分布情况，分别提取镰形扇头蜱的各发育阶段包括卵、幼蜱、若蜱、未吸血成蜱、半饱血成蜱和不同部位包括壳、唾液腺、肠的总RNA，取相同的量的总RNA进行RT-PCR分析，结果cysA和cysB在壳和唾液腺中均有表达，在各发育阶段也都有不同程度的表达，其中，cysA在卵中表达丰度极低，cysB在未吸血成蜱中表达丰度极低。
徐林海[2]2012年在《温度变化对叁种硬蜱半胱氨酸蛋白酶活性的影响》文中进行了进一步梳理硬蜱是一类可寄生于多种温血动物(包括人)的体外寄生虫。宿主的血液是硬蜱唯一的营养来源。由于硬蜱具有叮咬时间较长,吸血量较多以及可多次反复叮咬等特点,因此被硬蜱叮咬过的家畜可表现为被毛散落,叮咬处皮肤出现溃、坏死、情绪躁动、食欲不振等症状；除了以上直接危害之外,硬蜱还可传播多种病原如细菌、病毒、原虫、立克次氏体等从而造成人和动物患病。硬蜱生活史较为复杂,所以国内外学者多致力于硬蜱生物学特性的研究。目前全球气候变暖给硬蜱以及蜱传病造成了巨大的影响。气温升高不仅扩大了硬蜱的分布范围而且促进了蜱传疾病的流行。尽管国内外许多学者对蜱的分类、生物学特性等进行了大量的研究,但有关温度对硬蜱生物学特性影响的分子机制研究很少。半胱氨酸蛋白酶是国内外公认的一种新型抗蜱候选分子,同时也是重要的代谢酶,因此本研究对叁种硬蜱体内半胱氨酸蛋白酶的活性和温度之间的关系做了详细的探讨。研究首先对叁种硬蜱体内半胱氨酸蛋白酶保守型片段进行克隆及同源性分析,之后对微小扇头蜱体内半胱氨酸蛋白酶进行原核表达并分析其体外活性；在确定了实验室条件下硬蜱适宜的饲养温度后,分析温度变化对叁种硬蜱体内半胱氨酸蛋白酶活性的影响。1)叁种硬蜱半胱氨酸蛋白酶保守序列的获取以微小扇头蜱、亚东璃眼蜱、镰形扇头蜱cDNA序列为模板,利用半胱氨酸蛋白酶核苷酸序列保守性引物进行PCR扩增和克隆。测序结果表明叁种硬蜱所得基因片段均含保守区域并且与NCBI数据库中扇头蜱属,革蜱属的半胱氨酸蛋白酶基因序列的同源性高于80%；与血蜱属的半胱氨酸蛋白酶基因序列的同源性高于70%。2)微小扇头蜱半胱氨酸蛋白酶全长序列的克隆、表达以及活性检测设计微小扇头蜱半胱氨酸蛋白酶全长引物,克隆其ORF,构建原核表达载体pET-28a-cys后在大肠杆菌BL21中进行原核表达,对自我激活后的重组蛋白进行活性检测。结果显示微小扇头蜱半胱氨酸蛋白酶基因全长1041bp,编码332个氨基酸,和已报道的微小扇头蜱半胱氨酸蛋白酶基因序列有98%的同源性。只有在酸性条件下自我激活的重组蛋白才可发挥其水解底物的活性。3)硬蜱适宜生长温度的确定在实验室条件下设定22℃、28℃、37℃叁个温度级,分别饲养镰形扇头蜱和亚东璃眼蜱,观察不同温度下各硬蜱各发育阶段的生物学特性差异。结果显示两种硬蜱幼蜱、若蜱蜕皮率以及卵的孵化率均在28℃时表现为最佳。4)温度差异对于叁种硬蜱半胱氨酸蛋白酶活性的影响选择24℃、28℃、32℃叁个温度级,分别饲养叁种硬蜱,提取叁组硬蜱各发育阶段饲养1d、3d、5d的体内半胱氨酸蛋白酶,分别比较各组蛋白酶水解特异性底物的活性。结果显示温度和半胱氨酸蛋白酶活性有关,在2℃-32℃范围内,随着温度的升高,同一天内幼蜱和若蜱体内的半胱氨酸蛋白酶的活性逐渐降低,因此温度上升提高了其在硬蜱一定发育阶段体内的代谢速度,即加速其在硬蜱体内的利用。本研究所获得的结果,在全球气候变暖趋势下给蜱以及蜱传病的防控提供了重要的理论基础,半胱氨酸蛋白酶有可能成为一种防控蜱传病的新型药物靶标。
于新茂[3]2016年在《镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶的鉴定及其在唾液腺细胞凋亡中的作用研究》文中研究说明半胱氨酸蛋白酶是一类古老而又保守的蛋白酶,其分布广泛,涵盖范围从病毒、细菌到哺乳动物的各个组织器官,参与胚胎发育,抗原呈递,细胞凋亡和稳态维持等多种重要的生理活动。作为专性体表寄生虫,蜱以吸血宿主血液为生,在其吸血过程中可传播细菌、真菌、病毒、支原体、原虫等多种病原体,是重要的人畜共患病传播媒介。唾液腺是宿主血液进入蜱体内最先接触的组织器官,也是蜱体内病原体传播到宿主体内的通道,因此蜱唾液腺重要分子的研究对于蜱及蜱传病控制十分重要;随着吸血过程的完成,蜱的唾液腺逐渐萎缩,这一现象是由细胞凋亡引起的,但分子机制不清。本研究以蜱的唾液腺中半胱氨酸蛋白酶分子群的鉴定为切入点,探索了半胱氨酸蛋白酶在唾液腺发育与凋亡中的作用机制。以镰形扇头蜱为研究对象,对吸血前、后唾液腺转录组进行测序及差异分析,分别测得上调基因1179个,下调基因574个,其中总转录库中预测的半胱氨酸蛋白酶表达序列标签(EST)有25个(13个上调基因EST,1个下调基因EST);经过基因克隆,共获得6个半胱氨酸蛋白酶全长序列,根据基因结构和生物信息学分析,分别命名为组织蛋白酶B(CATB)、组织蛋白酶L(CATL)、半胱天冬氨酸蛋白酶-1(CASP1)、半胱天冬氨酸蛋白酶-8(CASP8)、自噬相关蛋白酶4B(ATG4B)和自噬相关蛋白酶4D(ATG4D)。通过Real-time PCR方法检测了6种半胱氨酸蛋白酶在蜱不同发育阶段和不同吸血状态的转录水平,结果显示幼蜱和若蜱吸血后所有蛋白酶的转录量均显着性下调,而在成蜱则全部显着性上调;6种蛋白酶在成蜱唾液腺中吸血后转录量上调,尤其是CATB和CATL,上调差异非常显着,而在其他组织器官中转录水平各有不同。对5种半胱氨酸蛋白酶进行了体外重组蛋白表达和纯化(CASP8未表达),并分别制备小鼠特异抗血清。重组蛋白的酶活实验显示,各蛋白在适度浓度和PH范围内均表现一定的活性:CASP1的最适PH为5.5,可达阳性对照酶活性的60%;组织蛋白酶B和L随着浓度的增加,其活性受到抑制,其中组织蛋白酶L包含一个60个氨基酸的抑制结构域,将其切除后可明显提高组织蛋白酶L的活性,推测抑制结构域是限制组织蛋白酶L活性的重要因素,而组织蛋白酶B的高浓度抑制效应可能来自酶与底物的竞争;ATG4B和ATG4D对CASP1特异性底物具有一定活性,可达阳性对照的40%,ATG4D对组织蛋白酶特异性底物具有良好活性,高浓度下也出现抑制效应。5种重组蛋白的特异性抗血清,可分别识别成蜱体内天然蛋白酶,其中两种组织蛋白酶CATB和CATL在35~40 kDa之间均有2条带,可能为酶原和激活态,而自噬相关蛋白酶天然蛋白大小分别为~36 kDa(ATG4B)和~40 kDa(ATG4D),CASP1天然蛋白大小约为37 kDa,在70 kDa左右有类似二聚体结构,可能是其真正的活性态。利用免疫组化技术,观察5种半胱氨酸蛋白酶在唾液腺和肠腔中的定位,结果显示在唾液腺中5种蛋白酶分布广泛,而在中肠只可见ATG4D的少量分布。利用RNA干扰技术,通过电转化将合成的特异性双链RNA导入镰形扇头蜱若蜱体内,对6种半胱氨酸蛋白酶分别进行单一干扰实验,检测6种半胱氨酸蛋白酶之间是否存在相互作用关系,结果显示任一蛋白酶受到抑制均可引起其他5种蛋白酶转录水平发生变化,特别是当CATB和CATL转录受抑制可引起ATG4B和CASP1转录水平显着性上调,而CASP8和ATG4D转录受抑制时也引起CASP1转录水平显着上调;当CASP1受到抑制后,CATB的转录水平下调显着,ATG4D、ATG4B和CASP8的转录水平也受到明显抑制,但CATL的转录水平未受到影响,推测CASP1对于CASP8,CATB,ATG4B和ATG4D可能具有上游调节作用,为后续研究提供了切入点。通过解剖观察、Tunnel染色和AnnexinⅤ细胞凋亡流式检测确定了成蜱吸血过程中细胞凋亡参与唾液腺的变化过程;为了探究半胱氨酸蛋白酶在过程中的作用机制,利用显微注射技术将体外合成的干扰用CASP1双链RNA注射入镰形扇头蜱成蜱体内,24小时后接种新西兰大白兔,分别对上体后1到7天的对照组与实验组成蜱唾液腺进行分离观察,在mRNA和蛋白水平上检测7天吸血过程中半胱氨酸蛋白酶的动态变化,利用Tunnel细胞凋亡染色和AnnexinⅤ流式细胞凋亡检测技术对吸血过程中唾液腺的变化进行监测,结果表明进入快速吸血期前(上体3~4天)是唾液腺细胞诱导细胞凋亡发生的主要时相,随后随着吸血过程快速完成,唾液腺细胞逐渐坏死,CASP1作为效应性半胱天冬氨酸蛋白酶,在上体后5到7天表达量逐渐增加;CASP1的干扰可明显延长唾液腺细胞的凋亡,影响吸血过程中唾液腺细胞的坏死,并且诱导ATG4D的表达量逐渐增加,表明ATG4D与CASP1之间关系密切,暗示了自噬蛋白酶与半胱天冬氨酸蛋白酶之间可能存在互补的代偿关系,共同参与唾液腺细胞的凋亡坏死过程。综合上述结果,本研究鉴定了镰形扇头蜱6个半胱氨酸蛋白酶分子,发现它们在蜱吸血后唾液腺中上调表达,相互之间存在一定互作调节关系,其中自噬相关的半胱氨酸蛋白酶与凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶共同参与了蜱唾液腺的凋亡过程。
陈灵芝, 周金林, 周勇志, 龚海燕, 李培英[4]2003年在《镰形扇头蜱二个半胱氨酸蛋白酶新基因的克隆与序列分析》文中指出目的:蜱是人和家畜的体表寄生虫,更是人和家畜的多种虫媒病的传播者,可传播的病原体有病毒、立克次体、螺旋体、血液原虫等等。蜱作为寄生虫和传播媒介直接和间接引起的经济损失很大,给世界畜牧业造成很大的威胁。目前,蜱的控制主要是靠化学杀虫剂。但是由于蜱抗药性的出现、化学药品对食物链和环境的污染以及化学药品对人和家畜健康的危害,因此有必要研究新的控制蜱的方法。自从Willadsen第一次将微小牛蜱中肠抗原Bm86免疫牛获得成功以后,免疫预防就成为最有前途的控制蜱的方法,而筛选有潜力的抗原基因是前提条件。近来许多研究表明,半胱氨酸蛋白酶在寄生虫体内有着许多必不
陈灵芝, 周金林, 周勇志, 龚海燕, 李培英[5]2004年在《镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的克隆、表达和抗蜱免疫保护作用》文中提出根据半胱氨酸蛋白酶的活性位点保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子使用偏好设计引物,PCR 扩增、测序并分析得到两个镰形扇头蜱的半胱氨酸蛋白酶基因片断,再通过5’RACE 的方法得到全长基因序列。RhcA 全长1168bp,开放阅读框从第58个碱基到第1053个碱基,编码332个氨基酸序列,预测分子量为36KDa。RhcB 全长1153bp,开放阅读框从第43个碱基到第1047个碱基,编码335个氨基酸,预测分子量约为37KDa。同源性分析表明,这两个序列均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点C~(25)、HI~(150) 和N~(175) 处的保守性氨基酸序列,且与其它物种的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶有很高的同源性,其中,RhcA 与其他蜱种或物种的半胱氨酸蛋白酶在氨基酸水平上的同源性为58.5%～79.8%;RhcB 与其他蜱种或物种的半胱氨酸蛋白酶在氨基酸水平上的同源性为56.7‰89.8%。因此,将RhcA 和RhcB 命名为镰形扇头蜱两个新的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶基因。RT-PCR 分析表明,RhcA 和RhcB 在镰形扇头蜱的不同发育阶段表达情况不一。将RhcA 和RhcB 基因亚克隆到表达质粒pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a/RhcA和pET32a/RhcB,转化到BL21(DE3)表达菌后,经IPTG 诱导表达。SDS-PAGE表明,重组质粒pET32a/RhcA 和pET32a/RhcB 均得到高效表达。Westem Blot 显示二个重组蛋白均可被蜱抗唾液抗体识别。二个重组蛋白纯化后,按常规免疫程序免疫实验兔,并进行成蜱感染实验。结果表明,与对照组相比,免疫组兔子对镰形扇头蜱侵袭和吸血显示出明显的保护作用。对照Trx 免疫组,接种蜱48小时后,吸附率为68%,而RhcA 和RhcB 免疫组仅为17%和16%。对照组蜱的饱血率为54%,而RhcA 和RhcB 免疫组仅为42%和22%。本文报道的镰形扇头蜱两个组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶新基因序列已登录GenBank,cysA 和cysB 的基因序列号分别为AY336797和AY336798。
陈灵芝, 周金林, 李培英, 周勇志, 龚海燕[6]2005年在《镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶基因的克隆与表达及表达产物免疫保护性分析》文中提出目的在大肠杆菌中高效表达镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶(cysteinase)CysA和CysB,并对表达产物进行免疫保护效果测定。方法将cysA和cysB基因亚克隆到pET-32a载体,转化感受态大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下进行表达;表达产物免疫家兔,首次免疫抗原剂量免为300μg/兔,二次免疫和叁次免疫均为150μg/兔。叁次免疫后进行攻击蜱试验,观察免疫保护效果。结果在IPTG诱导下,重组质粒pET32a-cysA和pET32a-cysB在大肠杆菌中获得高效表达,产生Trx-cysA和Trx-cysB融合蛋白,这两种融合蛋白经纯化后免疫家兔,分别使成蜱的吸附率降至17%和17%,饱血率降至42%和22%。结论重组质粒pET32a-cysA和pET32a-cysB在大肠杆菌中高效表达,表达产物能诱导家兔产生一定程度的抗蜱保护性免疫力。
陈灵芝, 周金林, 周勇志, 龚海燕, 李培英[7]2004年在《镰形扇头蜱两个组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶新基因的克隆与序列分析》文中提出蜱是动物常见的外寄生虫 ,并且传播多种人和动物的疾病 ,严重危害畜牧业发展和人类健康。为了寻找基因工程疫苗候选抗原基因 ,根据半胱氨酸蛋白酶的保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子偏好设计引物 ,PCR扩增、测序并分析得到 2个镰形扇头蜱的半胱氨酸蛋白酶基因片段cysA和cysB ,再通过RACE的方法得到全长基因序列。cysA全长 1168bp ,编码 3 3 2个氨基酸 ;cysB全长 1153bp ,编码 3 3 5个氨基酸。经过分析 ,CysA和CysB均与其他蜱种或物种的组织蛋白酶L 样半胱氨酸蛋白酶有高度同源性 ,两者均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点处的保守性氨基酸序列 ,因此cysA ,cysB均为镰形扇头蜱两个新的组织蛋白酶L 样半胱氨酸蛋白酶基因。RT PCR分析表明 ,CysA和CysB在镰形扇头蜱的不同发育阶段表达情况不一
王玉俭[8]2012年在《镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子的鉴定》文中研究表明蜱能传播真菌、原虫、立克次体、细菌及病毒等多种病原体,是仅次于蚊子的第二大病原传播媒介。在世界范围内蜱及蜱传病严重威胁着人和动物的健康安全,并对畜牧业生产造成重大的经济损失。蜱功能分子的研究对于在分子水平上了解蜱的生物学特性具有十分重要的意义。酶与酶的抑制剂分子在蜱的生物学活动中扮演十分重要的角色,其中能与木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶产生可逆的、紧密结合抑制的半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子(cystatin)在近年来被广大的研究者所关注。Cystatin根据一些保守氨基酸序列和所占有的cystatin结构域个数可分为四个亚家族：cystatin家族1,也称之为stefins家族；cystatin家族2；cystatin家族3,也称之为kininogens家族；cystatin家族4,也称之为cystatin样蛋白(胎球蛋白、组氨酸糖蛋白)。在蜱上现在被发现和研究的主要是家族1和家族2cystatin分子。家族1cystatin是一些不具有信号肽的胞质蛋白,而家族2cystatin是具有信号肽的分泌型蛋白。在国外长角血蜱、肩突硬蜱和非洲钝缘蜱等蜱的cystatin分子被进行了较为深入的研究,发现了cystatin分子涉及蜱的饱血、对宿主免疫调节、调节血液消化及蜱的先天免疫等许多重要生理过程。然而国内对于蜱的cystatir研究仍属空白。本研究所用的蜱种是采自湖北武汉经本实验室传代培养的南方优势蜱种镰形扇头蜱。利用cystatin分子在结构上相对保守的特点,用与镰形扇头蜱亲缘性较高的微小牛蜱的家族1cystatin分子和变异革蜱的家族2cystatin分子分别设计家族1cystatin的保守区引物和家族2cystatin的3'RACE引物,用于扩增镰形扇头蜱的家族1cystatin的一个保守片段和家族2cystatin的3'端。利用得到的家族1cystatin保守片段序列通过3'RACE和5RACE方法可扩增出镰形扇头蜱家族1cystatin全长基因序列,利用得到的家族2cystatin3端序列通过5'RACE方法扩增出镰形扇头蜱家族2ystatin全长基因序列。将得到镰形扇头蜱家族1和家族2cystatin分子分别命名为RHcyst-1和RHcyst-2. RHcyst-1全长基因为471bp,具有一个编码98个氨基酸的开放阅读框,没有信号肽序列。和绝大多数的家族1cystatin—样,RHcyst-1具有N端保守甘氨酸知QXVXG保守位点。推测RHcyst-1的蛋白大小约为11kDa,等电点为5.66。RHcyst-2全长基因为773bp,具有一个编码139个氨基酸的开放阅读框,其中有23个氨基酸为信号肽序列。RHcyst-1具有非常典型的家族2cystatin的特征,N端保守甘氨酸、QXVXG保守位点、PW保守位点以及两个二硫键桥。推测RHcyst-2的蛋白大小约为15kDa,等电点为5.20。将RHcyst-1和RHcyst-2去信号肽的ORF序列亚克隆至pGEX-4T-1载体,转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达。用GST树脂纯化重组蛋白,将RHcyst-1和RHcyst-2的重组蛋白分别命名为rRHcyst-1和rRHcyst-2。用rRHcyst-1和rRHcyst-2对六种半胱氨酸蛋白酶进行体外酶活抑制实验。实验结果表明,rRHcyst-1知rRHcyst-2对组织蛋白酶L、B、C、H、S和木瓜蛋白酶的酶活性能产生有效抑制。本研究成功从镰形扇头蜱中克隆了两个新的cystatin分子,并在生化水平对其抑制活性进行了分析,这对我们进一步了解cystatin分子在镰形扇头蜱生物学活动中的作用有着十分重要意义。
张文杰[9]2008年在《镰形扇头蜱抗微生物多肽基因的克隆及序列分析》文中进行了进一步梳理蜱是一类以吸血为生的节肢动物,是人和动物的许多病原的传播媒介,包括细菌、真菌、病毒、立克次体、螺旋体和寄生原虫等多种病原。在中国,已记录的蜱类近120种,其中10余种具有明显的医学重要性,了解病原在蜱体的传播机制,特别是病原体与蜱的相互作用关系,对于蜱和蜱传病的防治具有重要价值。抗微生物多肽作为蜱的先天性免疫效应分子之一,是研究蜱与病原体的相互作用的重要切入点。本实验以镰形扇头蜱吸血前后雄蜱唾液腺的抑制消减杂交cDNA文库中的EST数据为基础,从镰形扇头蜱体内克隆出M200和M50二个新基因。M200基因全长542bp,编码100个氨基酸,预测分子量为9.85kDa,含有典型的信号肽序列,经同源性比较,该基因编码蛋白与与微小牛蜱抗微生物多肽分子Ixodidin序列的显着同源。M50基因全长410bp,编码100个氨基酸,预测分子量为9.0kDa,含有典型的信号肽序列,无显着性同源分子,仅与单一异尖线虫蛋白酶抑制因子有低度同源。结构上,M200和M50预测蛋白都含有半胱氨酸的抗微生物多肽的典型特征,即在C-末端含有6个保守的半胱氨酸残基(C…CXXXC…C…CXC),形成一个称为CSαβ(cysteine-stabilizedαβ)稳定的基序(motif)。综合同源性、结构特征、分子量、信号肽等生物信息学分析结果,初步预测M200和M50为二个编码镰形扇头蜱抗微生物多肽的新基因。应用RT-PCR方法分析了M200和M50基因在蜱的不同组织器官和不同发育阶段的表达情况。结果表明,这二个基因的表达没有组织特异性;M200在蜱的各个发育阶段卵、幼蜱、若蜱和成蜱均有表达,但M50在蜱的卵、若蜱阶段没有表达。应用RT-PCR方法分析了M200和M50基因在蜱的吸血前后的表达模式。M200和M50基因在蜱吸血后的转录量显着高于未吸血蜱,说明这两个基因的表达与吸血有关。成功构建了重组表达载体pGEX-4T-1/M200和pGEX-4T-1/M50,并转化到表达菌BL21中,经IPTG诱导,结果表明M200和M50可以在原核表达系统中高效表达,应用GST融合蛋白纯化系统,可获得纯化的目的蛋白。综上所述,本研究首次克隆、表达了镰形扇头蜱二个新基因,生物信息学分析表明它们可能是二个编码镰形扇头蜱抗微生物多肽。研究结果,为进一步研究这二个分子的生物学功能打下基础。
关洁[10]2013年在《镰形扇头蜱丝氨酸蛋白酶SP30和SP48基因的克隆及原核表达》文中研究表明蜱是一类仅依靠宿主血液生存的动物体表外寄生虫，蜱也因为传播大量的病原体而被人们熟知，包括立克次氏体、病毒、细菌、原虫等，这些病原体会导致动物和人类疾病。目前用来控蜱的策略仍然是用化学杀虫剂，但是这会带来蜱对杀虫剂的抗性，同时也会因为化学残留造成环境污染。因此，需要新的绿色环保的替代手段来控制蜱。不像其他的吸血节肢动物那样饱血迅速，蜱在吸附宿主后相当长一段时期吸取宿主大量的血液，因此蜱拥有一套有效地消化血液和吸收营养的机制。这些与蜱的吸血和血液消化相关的分子可能成为一类新的有效的控制蜱的疫苗候选分子，但是有关蜱消化血液的生物化学途径的信息很少。丝氨酸蛋白酶广泛存在于多种生物体中，参与众多的生理过程，如生理消化、血液凝固、免疫反应及细胞凋亡等。蜱吸食大量的血液之后，需要蜱体内的一系列酶来参与血液的消化，所以这些酶分子的分离及鉴定，不仅有助于了解蜱的生理学特征，还可以挖掘出有抗蜱免疫作用的候选靶标。本实验是采用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)技术，从镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA中克隆出两个丝氨酸蛋白酶新基因，分别命名为SP30基因和SP48基因，进而对两个基因的全长序列进行生物学分析并进行编码序列的原核表达。应用Real-time PCR技术对两个基因在镰形扇头蜱的不同发育阶段和不同组织器官的差异表达分析，还对SP30和SP48基因进行了RNA干扰分析以及重组蛋白的酶活分析。结果表明，SP30和SP48基因全长分别为1194bp和1586bp，分别编码299aa和462aa，预测分子量大小分别为30kDa和48kDa，都具有信号肽。将两基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1上，进行原核表达，经IPTG诱导，得到大小分别为56kDa和74kDa的重组蛋白。用纯化得到的重组蛋白分别免疫小鼠制备抗血清，进行Western blot分析表明，两种抗血清均能够识别蜱肠道30kDa和48kDa的天然蛋白。Real-time PCR分析结果表明，SP30和SP48基因在蜱的不同发育阶段均有不同程度的表达，其中SP30基因在未吸血的若蜱阶段表达量最高，而SP48基因在半饱血的若蜱阶段表达量最高。SP30和SP48基因在蜱的不同组织器官也均有不同程度的表达，两者都是在蜱的肠道中表达量最高。酶活性分析表明，rSP48重组蛋白浓度为5μM时与底物反应，表现出一定的活性。Real-time PCR结果显示，SP30和SP48基因干扰前后沉默效果明显。从生物学特征来看，SP30和SP48基因在干扰后，饱血率发生了一定的变化。综上所述，本研究应用RACE技术克隆出SP30和SP48基因，并进行原核表达。应用Real-time PCR分析两基因在不同发育阶段及组织器官的差异表达，并对两基因进行了RNA干扰分析，这些研究将为蜱的生理学特性了解和研究抗蜱疫苗提供基础。
参考文献：
[1]. 镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶基因的克隆及免疫效果研究[D]. 陈灵芝. 安徽农业大学. 2004
[2]. 温度变化对叁种硬蜱半胱氨酸蛋白酶活性的影响[D]. 徐林海. 华中农业大学. 2012
[3]. 镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶的鉴定及其在唾液腺细胞凋亡中的作用研究[D]. 于新茂. 中国农业科学院. 2016
[4]. 镰形扇头蜱二个半胱氨酸蛋白酶新基因的克隆与序列分析[C]. 陈灵芝, 周金林, 周勇志, 龚海燕, 李培英. 中国动物学会全国第九次寄生虫学学术讨论会论文摘要集. 2003
[5]. 镰形扇头蜱RhcA和RhcB基因的克隆、表达和抗蜱免疫保护作用[C]. 陈灵芝, 周金林, 周勇志, 龚海燕, 李培英. 中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集. 2004
[6]. 镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶基因的克隆与表达及表达产物免疫保护性分析[J]. 陈灵芝, 周金林, 李培英, 周勇志, 龚海燕. 中国人兽共患病杂志. 2005
[7]. 镰形扇头蜱两个组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶新基因的克隆与序列分析[J]. 陈灵芝, 周金林, 周勇志, 龚海燕, 李培英. 生物工程学报. 2004
[8]. 镰形扇头蜱半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子的鉴定[D]. 王玉俭. 南京农业大学. 2012
[9]. 镰形扇头蜱抗微生物多肽基因的克隆及序列分析[D]. 张文杰. 上海师范大学. 2008
[10]. 镰形扇头蜱丝氨酸蛋白酶SP30和SP48基因的克隆及原核表达[D]. 关洁. 上海师范大学. 2013
标签：畜牧与动物医学论文; α-氨基酸论文; 重组蛋白论文; 酸性氨基酸论文; 半胱氨酸论文; 同源重组论文; 基因合成论文; 保守序列论文; 同源基因论文;