嗜热四膜虫周期蛋白Cyc9及其相关蛋白的功能分析

论文摘要

在长期的生物进化过程中,从酵母的单倍体交配型进化到纤毛虫多样化的交配型细胞,以及高等生物两性配子细胞结合的生殖方式,细胞为彼此识别融合进化出精细的调控系统。单细胞真核生物有性生殖起始于不同交配型细胞的识别结合,不同的调控因子及细胞膜表面蛋白直接参与,起始了有性生殖进程。原生动物嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）具有7种不同的配对型,不同交配型细胞通过有性生殖过程中基因重排机制随机产生。不同交配型细胞间识别配对时,细胞形态发生改变,配对细胞形成稳定的conjugation junction结构,小核经历连续两次减数分裂,配子交换融合。目前四膜虫细胞性别决定和减数分裂机制取得重要进展,然而细胞识别的分子机制并不清楚。本研究鉴定了饥饿诱导的阶段性特异表达的周期蛋白基因CYC9,并对周期蛋白Cyc9p相关蛋白在细胞配对起始过程中的功能进行了系统分析。获得的主要结果如下:1.CYC9在饥饿期和有性生殖期特异表达通过四膜虫大核基因组数据库（http//:www.ciliate.org）以及功能基因组数据库（http://tfgd.ihb.ac.cn）对嗜热四膜虫CYC9（TTHERM00940290）基因进行分析发现,该基因全长为1915bp,开放阅读框为1218bp,预测编码405个氨基酸,蛋白大小约为45KDa。Cyc9氨基酸序列比对分析发现其中含有一段由95aa组成的保守的周期蛋白框,但没有典型的破坏框,N端有一段富含赖氨酸的区域,推测为泛素化结合位点。Microarray表达谱及qRT-PCR分析表明CYC9基因在生长期不表达,在饥饿期和细胞配对初期具有高表达。通过构建带有HA标签的由MTT1启动子调控表达的重组质粒pXS75CYC9,将该质粒转入野生型细胞株后进行免疫荧光定位分析,发现Cyc9p定位在细胞质中。2.CYC9敲除抑制不同交配型细胞的识别配对构建质粒pNeo4-CYC9,转化不同交配型的嗜热四膜虫细胞B2086和Cu428,通过Paromomycin抗性筛选和表型分配,获得CYC9敲除突变细胞株ΔCYC9-B和ΔCYC9-C。对ΔCYC9突变细胞株进行不同交配型细胞识别配对分析,结果表明不同配对型敲除突变细胞株之间不能发生配对结合。进一步对ΔCYC9突变株细胞形态进行观察发现,饥饿诱导的不同配对型突变细胞株混合后,其细胞形态始终与饥饿时相同,并不被诱导出现细胞极性突出结构。构建pBsrCYC9重组质粒,转化ΔCYC9-B和ΔCYC9-C突变株,恢复CYC9的表达。结果发现营救之后部分细胞可以恢复配对,且配对细胞可以正常完成有性生殖发育,表明CYC9为细胞的识别配对所必需。3.CYC9相关基因的鉴定分析对野生型和ΔCYC9突变细胞株总RNA进行差异转录组分析,结果发现CYC9的表达缺失导致嗜热四膜虫性别决定基因MTA6表达量下降了约10倍,MTB6表达量下降了约20倍。此外,编码周期蛋白依赖性蛋白激酶催化亚基的基因CKS1表达量下降了约25倍。为进一步了解周期蛋白Cyc9p调控通路参与的因子及其功能,通过功能基因组数据库（http://tfgd.ihb.ac.cn）鉴定了与CYC9共表达的周期蛋白依赖性激酶基因CDK19。4.CYC9相关基因CDK19,CKS1敲除干扰细胞识别配对分别构建敲除质粒pNeo4CDK19和pNeo4CKS1,转化不同交配型的嗜热四膜虫细胞Cu427和Cu428,通过Paromomycin抗性筛选和表型分配,获得CDK19和CKS1敲除突变体细胞。将不同交配型CDK19敲除突变细胞株进行配对观察,结果发现,敲除CDK19后细胞不能进行配对;将不同配对型的CKS1敲减突变株进行配对发现,CKS1基因敲减后细胞的配对率仅达到20%-30%,表明Cdk19和Cks1共同参与调控交配型细胞的配对识别。本研究首次对嗜热四膜虫周期蛋白基因CYC9及其相关因子的功能进行了分析,CYC9基因在生长期不表达,在饥饿期和有性生殖细胞配对初期具有高表达,Cyc9p定位在细胞质中。CYC9,CKS1,CDK19为嗜热四膜虫不同交配型细胞的识别和配对所必需,CYC9的敲除同时抑制了四膜虫性别决定基因MTA6和MTB6的表达。结果表明周期蛋白Cyc9及相关因子Cdk19,Cks1共同参与调控嗜热四膜虫有性生殖过程中细胞的识别配对。

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ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 配对细胞识别及结合

1.2 周期蛋白对细胞周期的调控

1.3 嗜热四膜虫的识别配对起始有性生殖

1.4 本课题研究意义

第二章嗜热四膜虫Cyc9的表达和定位

2.1 实验材料与试剂

2.1.1 菌株

2.1.2 主要试剂及工具酶

2.1.3 引物

2.1.4 主要试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 嗜热四膜虫细胞的培养,饥饿及配对

2.2.2 嗜热四膜虫全基因组的提取

2.2.3 野生型嗜热四膜虫CYC9基因的克隆

2.2.4 嗜热四膜虫总RNA的提取

2.2.5 嗜热四膜虫cDNA的合成

2.2.6 野生型嗜热四膜虫CYC9基因的实时荧光定量分析

2.2.7 pXS75CYC9重组质粒构建

2.2.8 pXS75CYC9重组质粒的转化及筛选

2.2.9 pXS75CYC9重组质粒基因枪转化及重组细胞株的筛选

2.2.10 免疫荧光定位分析

2.3 实验结果

2.3.1 CYC9基因鉴定

2.3.2 CYC9基因的表达谱

2.3.3 Cyc9的序列分析

2.3.4 重组质粒pXS75CYC9鉴定

2.3.5 细胞株HA-CYC9-B和HA-CYC9-C的重组鉴定

2.3.6 Cyc9在嗜热四膜虫细胞饥饿期和有性生殖时期定位于细胞质

2.4 讨论

第三章 Cyc9调控嗜热四膜虫细胞识别配对

3.1 实验材料与试剂

3.1.1 菌株

3.1.2 主要试剂及工具酶

3.1.3 引物

3.1.4 主要试剂的配制

3.2 实验方法

3.2.1 嗜热四膜虫细胞的培养及饥饿

3.2.2 pNeo4CYC9重组质粒构建

3.2.3 pBsrCYC9重组质粒构建

3.2.4 pNeo4CYC9和pBsrCYC9重组质粒的转化及阳性克隆筛选

3.2.5 pNeo4CYC9和pBsrCYC9重组质粒基因枪转化及突变株的筛选

3.2.6 嗜热四膜虫细胞的活细胞染色观察

3.2.7 嗜热四膜虫总RNA的提取及cDNA合成

3.2.8 荧光定量分析

3.3 实验结果

3.3.1 pNeo4CYC9重组质粒鉴定

3.3.2 pBsrCYC9重组质粒构建

3.3.3 CYC9敲除细胞株的重组鉴定

3.3.4 Rescue-CYC9细胞株筛选鉴定

3.3.5 CYC9敲除抑制细胞配对识别

3.3.6 CYC9营救的突变细胞株恢复正常有性生殖进程

3.4 讨论

第四章 CYC9功能相关基因的鉴定与功能分析

4.1 实验材料与试剂

4.1.1 菌株

4.1.2 主要试剂及工具酶

4.1.3 引物

4.1.4 主要试剂的配制

4.2 实验方法

4.2.1 嗜热四膜虫细胞的培养及饥饿

4.2.2 转录组测序取样

4.2.3 嗜热四膜虫总RNA的提取

4.2.4 嗜热四膜虫cDNA的合成

4.2.5 野生型嗜热四膜虫CYC9相关基因的实时荧光定量分析

4.2.6 pNeo4CDK19和pNeo4CKS1重组质粒构建

4.2.7 pNeo4CDK19和pNeo4CKS1重组质粒的转化及阳性克隆筛选

4.2.8 pNeo4CDK19和pNeo4CKS1基因枪转化及突变细胞株筛选

4.2.9 KO-CDK19和KO-CKS1细胞配对及活细胞染色观察

4.3 实验结果

4.3.1 KO-CYC9转录组测序结果分析

4.3.2 敲除CYC9后CKS1,MTA6以及MTB6表达量明显下调

4.3.3 CDK19序列分析

4.3.4 Cks1 序列比对

4.3.5 pNeo4CDK19重组质粒鉴定

4.3.6 pNeo4CKS1重组质粒鉴定

4.3.7 KO-CDK19和KO-CKS1突变细胞株的重组鉴定

4.3.8 敲除CDK19后细胞不能发生配对

4.3.9 CKS1敲减细胞株配对率降低

4.4 讨论

参考文献

总结与展望

附录

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简况及联系方式

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭玉凤

导师: 许静

关键词: 嗜热四膜虫,周期蛋白,有性生殖,细胞识别

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山西大学

分类号: Q78

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000300

总页数: 71

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嗜热四膜虫周期蛋白Cyc9及其相关蛋白的功能分析

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