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塞内加谷病毒四川株的分离鉴定、全基因序列分析及其3C蛋白的真核表达

2020-12-02阅读(1009)

塞内加谷病毒四川株的分离鉴定、全基因序列分析及其3C蛋白的真核表达

论文摘要

猪塞内加谷病毒（Seneca Valley virus,SVV）可引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡,并具有传染性,对猪群危害重大。近几年来,SVV在世界各地频繁暴发,但由于其临床症与口蹄疫等病毒相似而被忽视,因此对该病毒开展的组织培养特性、病理学特点以及分子生物学特性的系统性研究具有重要意义。本研究采集四川眉山和遂宁等地区疑似SVV感染猪群的水疱液病变组织等原始病料,检测后选择SVV阳性病料无菌处理后接种PK-15细胞进行病毒分离。结果两组病料皆在盲传过程中使PK-15细胞出现CPE,传至10代后,接毒24h稳定出现典型CPE,表现为个别细胞变圆,并随着时间的增加大量细胞堆积破碎,漂浮于液面上。对分离的病毒株进行挑斑纯化,经RT-PCR检测证实成功分离出两株SVV毒株,将其命名为SVV-MS株和SVV-SN株。经测定,SVV-MS株和SVV-SN株的TCID50分别为10-5.66/0.1 mL and 10-6.12/0.1 mL。将SVV-SN株分别对2-3日龄及7-9日龄乳鼠进行攻毒,经鉴定两组日龄乳鼠均无法为SVV-SN株进行传代。参照GenBank已发布的SVV-001（登录号:DQ641257）株全基因序列,设计8对引物,对两分离株进行全基因分段克隆。经过分子生物学软件的拼接,获得了SVV-MS株与SVV-SN株的全基因序列全长均为7312nt,且两株病毒基因组结构具有典型的小RNA病毒的结构特征。对两株SVV毒株进行全基因序列分析发现SVV-SN株与美国株有较高的亲缘性而SVV-MS株与中国本土毒株亲缘性更高,体现出四川地区SVV基因的差异性。同时两病毒株和大部分SVV流行毒株一样,均与首株毒株SVV-001株亲缘性较低,提示该病毒在不断变异进化。另外本研究对两株SVV的VP1基因进行序列分析,结果显示SVV-MS株的VP1蛋白氨基酸仅存在一个位点的突变,但SVV-SN株存在三个位点的突变。数据丰富了SVV的分子流行病学资料及其遗传进化规律,为后续SVV病毒学研究提供参考。采用Primer 5.0软件设计引物,以SVV-MS株为模板,扩增SVV非结构3C蛋白,3C全基因长度为669bp,生物信息学分析显示SVV 3C可编码一个较稳定的非分泌型蛋白,预测得到该蛋白具有16个磷酸化位点,证明其具有较高活性,这一点在预测其二级结构后也可得到支持。将pMD19-SVV-3C和真核表达载体pcDNA3.1（+）进行双酶切后连接,重组质粒经鉴定后命名为pcDNA3.1（+）-SVV-3C。将pcDNA3.1（+）-SVV-3C转化到BHK-21细胞24h后制样进行Western-blot,成功验证该重组质粒能在BHK-21细胞中进行真核表达。将pcDNA3.1（+）-SVV-3C和能依赖帽样结构途径表达GFP蛋白的pEGFP-N1质粒共转染BHK-21细胞,24h和48h后在荧光显微镜下可观察到实验组荧光增多,收集样品以Western-blot验证,实验结果与荧光反应结果一致,证明SVV-3C蛋白能使真核细胞依赖帽样结构途径表达蛋白的表达水平上升。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 主要缩略词
  • 第一章 文章综述
  •   1 塞内加谷病毒及其发现
  •   2 SVV的基因组结构及其功能
  •     2.1 5'UTR与3'UTR
  •     2.2 SVV的多蛋白前体
  •     2.3 SVV的结构蛋白
  •     2.4 SVV的非结构蛋白
  •   3 SVV细胞培养特性
  •   4 SVV的致病性
  •     4.1 临床症状
  •     4.2 解剖症状
  •   5 SVV的流行病学
  •   6 SVV的鉴别诊断与预防
  •   7 研究目的与意义
  • 第二章 SVV-MS株和SVV-SN株的分离与鉴定
  •   1 试验材料
  •     1.1 实验动物
  •     1.2 主要酶和试剂
  •     1.3 病料、细胞与质粒
  •     1.4 主要仪器
  •     1.5 主要配制试剂
  •   2 试验方法
  •     2.1 引物的设计与合成
  •     2.2 病料的处理与RT-PCR检测
  •     2.3 SVV的分离与培养
  •       2.3.1 细胞的复苏与培养
  •       2.3.2 SVV的分离与培养
  •       2.3.3 SVV的蚀斑纯化
  •       2.3.4 病毒TCID50 的测定
  •     2.4 乳鼠攻毒实验
  •   3 结果分析
  •     3.1 病料检测结果
  •     3.2 SVV的分离与培养
  •     3.3 RT-PCR检测
  •     3.4 SVV TCID50 的测定
  •     3.5 乳鼠攻毒实验
  •   4 讨论
  • 第三章 SVV-MS株和SVV-SN株全基因测序与分析
  •   1 试验材料
  •     1.1 主要酶及试剂
  •     1.2 毒株、细胞及质粒
  •     1.3 主要仪器
  •     1.4 主要配制试剂
  •   2 试验方法
  •     2.1 引物的设计与合成
  •     2.2 SVV的增殖
  •     2.3 RNA的提取
  •     2.4 SVV的 c DNA合成
  •       2.4.1 5'-UTR与3'-UTR的 c DNA合成
  •       2.4.2 ORF的 c DNA合成
  •     2.5 SVV基因组的扩增
  •       2.5.1 5'-UTR与3'-UTR的 c DNA扩增
  •       2.5.2 ORF的 c DNA的扩增
  •     2.6 目的片段的回收
  •     2.7 重组质粒的构建
  •       2.7.1 目的基因与质粒的连接
  •       2.7.2 感受态细胞的制备
  •       2.7.3 转化
  •     2.8 全基因组序列分析
  •   3 结果分析
  •     3.1 全基因的分段扩增与克隆
  •     3.2 全基因组的序列拼接
  •     3.3 全基因序列特征及与遗传进化树分析
  •       3.3.1 全基因序列同源性分析
  •       3.3.2 全基因遗传进化树分析
  •       3.3.3 VP1 基因序列同源性分析
  •       3.3.4 VP1 基因遗传进化树分析
  •       3.3.5 VP1 基因氨基酸序列分析
  •   4 讨论
  • 第四章 SVV-3C基因真核质粒的构建表达
  •   1 试验材料
  •     1.1 主要酶及试剂
  •     1.2 质粒、菌种、细胞和毒株
  •     1.3 主要实验仪器
  •     1.4 主要配制试剂
  •   2 试验方法
  •     2.1 SVV3C蛋白序列的扩增
  •       2.1.1 设计扩增SVV3C蛋白的引物
  •       2.1.2 扩增SVV3C蛋白序列
  •       2.1.3 目的片段回收
  •       2.1.4 回收后目的片段与pMD19-T载体重组质粒的构建
  •       2.1.5 质粒抽提
  •     2.2 SVV3C蛋白的生物信息学分析
  •     2.3 SVV3C蛋白真核质粒的构建
  •       2.3.1 载体及目的片段的酶切和回收
  •       2.3.2 3C序列与表达载体pcDNA3.1（+）的连接
  •       2.3.3 连接产物转化
  •       2.3.4 重组质粒鉴定
  •     2.3.4.1 重组质粒PCR鉴定
  •     2.3.4.2 重组质粒双酶切鉴定
  •     2.3.4.3 真核表达重组质粒的序列测定
  •     2.4 SVV3C蛋白真核质粒的表达
  •       2.4.1 质粒抽提（无内毒素）
  •       2.4.2 转染
  •       2.4.3 样品制备
  •       2.4.4 SDS-PAGE电泳
  •       2.4.5 免疫印迹
  •     2.5 SVV3C蛋白对帽样结构依赖蛋白的影响
  •       2.5.1 pcDNA3.1（+）-SVV-3C和 pEGFP-N1 的共转染
  •       2.5.2 观察及免疫印迹法验证
  •   3 结果分析
  •     3.1 SVV3C蛋白序列的扩增
  •     3.2 SVV3C蛋白生物信息学分析
  •       3.2.1 SVV3C基因结构分析
  •       3.2.2 二级结构分析
  •       3.2.3 SVV3C蛋白真核质粒的构建
  •     3.3 SVV3C蛋白真核质粒的表达
  •     3.4 SVV3C蛋白对帽样结构依赖蛋白的影响
  •       3.4.1 荧光显微镜观察
  •       3.4.2 免疫印迹法验证
  •   4 讨论
  • 全文总结
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历
  •   一、个人基本情况
  •   二、教育经历
  •   三、攻读学位期间发表的学术论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 陈瑛琪

    导师: 徐志文

    关键词: 塞内加谷病毒,病毒分离,序列分析,真核表达,蛋白

    来源: 四川农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 四川农业大学

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000554

    总页数: 77

    文件大小: 1650k

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