利用磁性纳米颗粒共价固定化重组大肠杆菌

论文摘要

大肠杆菌是典型的革兰氏阴性菌,作为一种重要的生物催化剂,在生物催化、药品生产、临床检测、环境等方面已经有着广泛的应用。然而游离的大肠杆菌细胞在反应溶液中不稳定,难以连续使用,并且当细胞用于催化,难以将细胞与后续产物分离。与游离细胞相比,经过固定化的细胞可以实现重复使用,降低了使用成本,并简化了产物的分离和纯化。固定化技术已被证明可以改善细胞作为生物催化剂的性质。本文通过制备一种表面携带炔基基团的磁性纳米载体,利用叠氮-炔基的有铜点击化学反应实现重组大肠杆菌的共价固定化。首先制备了一种炔基功能化的磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2-NH2-alkyne。通过共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米颗粒,在其表面包覆二氧化硅层,得到Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒,然后利用硅烷化试剂APTES对Fe3O4@SiO2颗粒进行表面氨基修饰,得到氨基修饰的磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2-NH2,最后利用氨基和羧基的缩合反应对Fe3O4@SiO2-NH2颗粒进行修饰,得到炔基功能化的磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2-NH2-alkyne。通过FTIR、TEM、SEM、XRD和DSC等方法对磁性纳米材料进行表征,确定成功制备了炔基修饰的磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2-NH2-alkyne。使用对甲苯磺酰氯处理D-阿拉伯糖,然后加入乙酸酐对5号位的C进行活化,活化后加入NaN3进行取代反应,得到5-叠氮基-1,2,3-三-O-乙酰基-D-阿拉伯呋喃糖。然后用甲醇钠处理,中和得到5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯呋喃糖。进一步将5-叠氮基-5-脱氧-D-阿拉伯呋喃糖与草酰乙酸钠缩合,得到KDO-N3,在弱酸条件下脱羧后得到其铵盐KDO-N3·NH3。使用红外光谱及核磁共振对制备得到的KDO-N3进行结构分析,证实结构正确。将制备得到的KDO-N3通过代谢整合插入到重组大肠杆菌细胞膜的表面,然后与上述制备得到的磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2-NH2-alkyne通过有铜点击化学连接,得到共价固定化细胞。并对影响固定化的因素（细胞载量、固定时间、固定温度、pH和二价铜离子浓度）进行优化,得到最佳固定化细胞的条件为:细胞载量为0.67 mg/mg,固定化温度45 oC,固定化时间10分钟,固定化pH 6.0,二价铜离子浓度为20 mM。在最佳固定化条件下,对固定化细胞和游离细胞的性质表征结果表明,固定化细胞具有更好的pH耐受性。在经过10次循环利用后,固定化细胞仍保留50%以上的初始活性。固定化细胞的活性分别比游离和KDO-N3修饰细胞高5倍和2.5倍。利用固定化细胞催化甘油转化为1,3-二羟基丙酮测试固定化细胞的催化效率,在反应12小时后,固定化细胞生成的DHA比游离细胞多1.4倍。结果表明,利用点击化学方法固定化大肠杆菌,催化反应生成DHA,在反应中不需要添加辅酶NAD+,且操作简单,可以为固定化细胞在工业中的应用提供参考依据。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 沈佳佳

导师: 张业旺

关键词: 固定化,磁性纳米颗粒,点击化学,重组大肠杆菌

来源: 江苏大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,材料科学

单位: 江苏大学

分类号: TB383.1;Q819

总页数: 75

文件大小: 2425K

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