刘洪艳[1]2003年在《氨对肝硬化大鼠模型脑神经细胞凋亡的影响》文中研究指明目的 氨是引起肝性脑病(HE)的一种主要的异常代谢产物，高血氨是目前公认的肝性脑病发病的一个重要的因素，有学者报告一些肝性脑病病人的脑CT可见明显的大脑皮质萎缩，病理学检查可见大脑或小脑神经元消失，但其发生的病理学基础尚不清楚，目前已有实验证明氨可以引起体外培养胚胎大鼠脑皮质神经细胞凋亡。本研究拟应用肝硬化动物模型，给予氨负荷来研究氨对脑神经细胞凋亡的影响。 材料与方法 实验动物为健康雄性Wistar大鼠，根据4种不同处理方法将大鼠随机分成4组：正常对照组：不加外界干预因素；正常氨负荷对照组：实验末给予氨负荷；实验对照组：应用四氯化碳制备肝硬化模型，不加外界干预因素；实验组：制备肝硬化模型，实验末给予氨负荷。各组大鼠在给予氨负荷前及20分钟后分别经内眦静脉应用抗凝管采血并在半小时内应用vitros AMON干片比色法测定血氨值。给药后2小时内观察大鼠的状态，应用角膜反射及翻转反射的存在与否判断是否伴有肝性脑病的发生。2小时后处死大鼠，处死前经心脏采血检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBil)。处死后立即取大脑及肝右叶组织，应用4％多聚甲醛固定。常规染色显微镜观察肝脏组织的改变，以确定肝硬化模型是否形成；镜下观察脑组织的形态改变，并应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记(TUNEL)法对石蜡包埋的脑组织进行脑细胞凋亡的检测。DAB显色后，细胞核呈深棕黄色染色的为凋亡细胞，于显微镜下计数凋亡指数(AI)。 结 果 二．实验组中有3只大鼠角膜反射与翻转反射消失，证明出现肝性脑病；正常对照组、正常氨负荷对照组及实验对照组角膜反射与翻转反射存在，均未出现肝性脑病。实验对照组有5只生成腹水，实验组有6只生成腹水。显微镜下观察：实验组及实验对照组肝小叶结构破坏，纤维组织增生，有明显硬化结节形成；正常对照组及正常氨负荷对照组肝脏结构正常；实验组与各对照组脑组织均未见异常。 2．分别比较实验对照组及实验组与正常对照组的ALT人ST。TBil及0分血氨水平，具有显着性差异，说明动物模型组存在肝功能改变，血氨水平也高于正常。实验组给予氨负荷后血氨值与正常氨负荷组、实验对照组比较有明显增高，经检验具有非常显着性差异河＜0．01人实验对照组脑细胞周与正常对照组比较具有显着性差异瞩＜0．05X实验组脑细胞周与实验对照组及正常氨负荷对照组比较具有非常显着性差异（P＜o．01入其中发生＊E的大鼠脑细胞AI都大于均数。 讨 论 肝性脑病是肝硬化晚期常见的严重并发症，它的发病机理目前尚未完全清楚，其中氨中毒理论是目前公认的发病机制之一。肝硬化病人肝功能逐渐恶化，肝内外侧支循环的建立使来自肠道的氨绕过肝脏直接进入体循环，氨的生成增多而清除减少，使体内氨水平逐渐升高，当氨进人脑组织时，可以干扰脑的能量代谢，影响Na”－K“－ATP酶的活性，破坏血脑屏障的完整性，干扰神经递质间的平衡。目前研究证实凋亡蛋白酶激活因子一1（Apaf一问是一种诱导凋亡的因子，它有一个结合ATP的位点，氨由于能够干扰脑的能量代谢，这可能是氨引起肝性脑病的一个作用机制。 ·2·本研究应用大鼠肝硬化动物模型给予氨负荷后发现：肝硬化大鼠血氨水平已高于正常，而且对氨负荷耐受性下降，给予氨负荷后，血氨水平则更显着升高，再一次证实了氨在HE中的作用。 神经细胞的死亡有二种方式：坏死和凋亡，后者是一种更轻微的J炎症的、依赖能量的细胞死亡方式。细胞凋亡是一种生理调节机制，参与调节机体发育、细胞分化及体内正常的细胞更新，受细胞内外因素的影响。近年来对细胞凋亡的分子机理研究显示，细胞凋亡是一个遗传的程序性过程，是基因表达的结果，当细胞凋亡相关基因的组成成分发生突变或出现数量异常时，此过程可受到干扰，从而引起细胞增殖与死亡的平衡障碍，进而导致多种疾病的发生。许多研究证实一些神经退行性疾病与神经细胞凋亡有关：如早老性痴呆，帕金森氏症，脊柱肌肉萎缩，肌萎缩性侧索硬化。 本研究通过TUNEL检测发现脑细胞在正常情况下末加任何处理因素时，也可发生少量的细胞凋亡；实验对照组AI值与正常对照组之间比较具有显着性差异，前者的血氨高于后者瞩＜0．01厂说明氨能够引起肝硬化大鼠模型脑细胞凋亡；在给予氨负荷后，实验组与实验对照组相比，脑细胞凋亡指数有所增加，实验组与正常给予氨负荷组比较，脑细胞凋亡指数也明显增加，实验组与以上比较的两组血氨水平存在明显差异，说明血氨越高，细胞凋亡越明显。本实验不仅进一步证实氨是能够诱发HE的一个因素，而且发现氨可以促进肝硬化大鼠脑细胞凋亡。实验组给予氨负荷后发生肝性脑病的大鼠脑细胞凋亡指数都大于均数，说明肝性脑病可能存在明显的脑细胞凋亡。从细胞凋亡调控的角度分析，在氨浓度不断积累的过程中，有可能通过细胞受体第二信使的
刘洪艳, 王静艳, 雷薇, 闻颖, 刘沛[2]2004年在《氨对肝硬化大鼠模型脑神经细胞凋亡的影响》文中研究说明目的:应用肝硬化模型研究氨对大鼠脑细胞凋亡的影响, 以探讨氨在慢性肝性脑病时脑组织病理改变发生中的作用. 方法:应用四氯化碳制备肝硬化动物模型,给予模型乙酸胺负荷,检测氨负荷前后血氨、肝功能水平;同时应用TUNEL方法检测氨负荷前后脑细胞凋亡隋况. 结果:肝硬化动物模型肝功改变明显,血氨增高155.74±12.70;氨负荷后肝硬化血氨增高1699.17±181.34;肝硬化氨负荷后脑细胞凋亡明显增多. 结论:氨可能诱发肝硬化大鼠脑细胞发生凋亡.
刘洪艳, 王静艳, 王伟, 刘沛[3]2005年在《肝硬化大鼠模型脑组织形态变化及机制》文中研究指明目的:探讨肝硬化时脑组织形态改变及其发生机制。方法:应用计算机扫描技术对16只应用四氯化碳腹腔注射12周制备肝硬化模型的大鼠和9只正常大鼠的大脑皮层的厚度进行计算,同时应用TUNEL方法和苏木素复染后计数大鼠脑细胞凋亡情况。结果:肝硬化动物模型的血氨为(231.80±24.17)μmmol/L,明显高于正常大鼠(48.7±5.87)μmmol/L。肝硬化动物模型大脑皮质的厚度为(215.03±14.94)μm,正常大鼠大脑皮质厚度为(248.35±19.82)μm,P<0.01;脑细胞凋亡指数(0.29±0.11)较正常大鼠(0.03±0.02)明显增高,P<0.05。脑细胞凋亡指数与血氨的水平呈正相关。结论:氨可能诱发肝硬化大鼠脑发生形态变化,脑神经细胞凋亡可能是这种变化的基础。
黄叶盛[4]2016年在《氯化铵对大鼠海马神经元生长的影响》文中指出目的:建立大鼠海马神经元的氨中毒模型模拟肝性脑病的氨中毒,观察不同氨浓度氨对体外培养海马神经元的形态学、微丝的影响,为阐明肝性脑病患者中枢神经功能失调的机制提供理论依据及新思路。方法:1.提取大鼠海马组织,培养原代大鼠海马神经元,培养至第7天加入不同浓度的NH_4CL(培养基中NH_4CL终浓度分别为0.125、0.5、1.0、5.0mmol/L),24小时后,利用荧光显微观察各组神经元形态的变化,用IPP软件统计各组海马神经元突起长度,根据神经元改变,选择合适的氨浓度,建立氨中毒模型模拟肝性脑病。2.培养至第7天的海马神经元加入不同浓度的NH_4CL培养24小时后,用钙黄绿素-乙酰乙酸酯(AM)染色,观察海马神经元生长情况,鉴定神经元的存活情况。3.海马神经元培养至第9天加入NH_4CL(培养基中NH_4CL终浓度1mmol/L),24小时后用罗丹明标记的鬼笔环肽染色,用荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察神经元内F-actin的改变并拍照,用IPP软件统计F-actin的荧光强度,用Image-J软件对海马神经元行Sholl分析并统计神经元突起分布情况。结果:1.正常对照组神经元生长良好,细胞胞体饱满,突起轮廓清晰,连接成网状结构;0.125 mmol/L NH_4CL组海马神经元与正常对照组无明显差别,随着浓度的增加,神经元胞体内出现黑色颗粒,细胞核皱缩、破裂,神经元突起僵硬曲张、断裂,甚至消失,5mmol/L组出现大量神经元凋亡;神经元突起长度随NH_4CL浓度的升高而降低,5mmol/L组神经元突起长度与对照组具有统计学意义(P<0.05),0.125、0.5、1.0mmol/L组神经元长度与对照组比较不具有统计学意义(P>0.05);2.用钙黄绿素-AM染色鉴别存活的海马神经元,结果显示对照组海马神经元形态基本与倒置显微镜所见一致,神经元生长良好,荧光染色强,5mmol/L NH_4CL组海马神经元经钙黄绿素染色后,染有绿色荧光的神经元较少,且荧光强度较弱,存活神经元的细胞密度降低(P<0.05);3.用鬼笔环肽对海马神经元染色观察F-actin,对照组海马神经元F-actin成束状整齐分布于突起及胞体。氨中毒组,F-actin排列紊乱、结构破坏,细胞趋于凋亡,F-actin荧光强度降低,差别有统计学意义(P<0.05);氨中毒组神经元细胞的突起的数量较对照组有着明显下降(P<0.05)。结论:1.成功分离培养大鼠海马神经元;2.高浓度的氨对体外培养的原代海马神经元生长有抑制作用,并诱导神经元凋亡;3.氨中毒组大鼠海马神经元F-actin荧光强度降低,微丝束状结构被破坏,结构紊乱、排列无序,提示氨中毒可导致F-actin异常解聚;氨中毒组神经元细胞突起的数量减少,表明氨中毒可能在神经元形态发育过程中有抑制作用。
参考文献：
[1]. 氨对肝硬化大鼠模型脑神经细胞凋亡的影响[D]. 刘洪艳. 中国医科大学. 2003
[2]. 氨对肝硬化大鼠模型脑神经细胞凋亡的影响[J]. 刘洪艳, 王静艳, 雷薇, 闻颖, 刘沛. 世界华人消化杂志. 2004
[3]. 肝硬化大鼠模型脑组织形态变化及机制[J]. 刘洪艳, 王静艳, 王伟, 刘沛. 中国医科大学学报. 2005
[4]. 氯化铵对大鼠海马神经元生长的影响[D]. 黄叶盛. 暨南大学. 2016
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