杨帆[1]2004年在《1. 慢性粒细胞性白血病融合基因bcr/abl第一外显子条件性基因打靶的实验研究 2. RNA干扰在哺乳动物细胞中的初步应用性研究》文中研究指明9号和22号染色体相互易位形成融合基因bcr／abl，是慢性粒细胞性白血病(CML)的主要发病机制。bcr／abl所编码的融合蛋白p210~(BCR/ABL)具有异常增高的酪氨酸激酶活性，与白细胞的恶性转化密切相关。研究发现，bcr／abl融合基因中bcr基因第一外显子(即bcr／abl的第一外显子bE1)所编码的肽段为激活原癌蛋白c—ABL的酪氨酸激酶活性所必需。本课题拟利用定点打靶系统Cre／loxP系统作用原理，通过同源重组将loxP序列引入CML细胞系K562基因组的bE1两侧，并通过调控Cre酶的表达调控细胞内bE1基因的敲除过程，观察bE1敲除后K562细胞在生长、转移及致癌性等方面的变化，从而为深入阐明CML的发病机理、演变过程、改善治疗方案及估计预后提供有力的理论依据。 我们首先通过四方面的实验全面分析和检验了我们所采用的基因打靶体系的有效性：1)利用染色体检查和核型分析检测了K562细胞内染色体的数目和特点，同时采用原位荧光杂交(FISH)测定了细胞内bcr／abl融合基因的拷贝数和分布情况。染色体检查和核型分析结果显示，K562细胞核内有67～69条染色体，其中22条染色体有2～3条，未见典型的Ph′。而FISH结果却表明，K652细胞虽然没有Ph′，但却有叁对或多对bcr／abl或abl／bcr融合基因，无论是bcr、abl还是二者产生的融合基因都存在过度扩增现象。结果表明，K562可以作为针对bcr／abl的基因打靶的靶细胞；不过由于bcr／abl过度扩增，可能需要多次打靶才能观察到打靶的效果。2)应用Tet—on系统的作用原理，分别构建了调控蛋白的表达载体pIREShyg2-rtTA及Cre酶表达载体pTREneo-Cre(含有Tet反应元件TRE)，将这两种载体联合转染后，以不同浓度强力霉素(Dox)诱导Cre酶的表达，Western blot检测结果显示：Dox可通过激活调控蛋白rtTA，显着诱导细胞中Cre酶的表达，Cre表达水平与Dox浓度呈正相关。这一结果说明我们建立了可调控型Cre酶的表达体系，为下一步对基因打靶进行调控打下了基础。3)将不同剂量的K562细胞通过尾静脉注射到NOD／SCID小鼠体内，观察尾静脉注射K562细胞对小鼠存活的影响，并对死亡小鼠的内脏进行病检。结果显示，静脉注射1×10~6～10~7K562细胞后，除1×10~6注射的小鼠外，其余剂量组小鼠均发生急性白血病并在13～49天内死亡，小鼠存活时间与注射细胞剂量之间呈明显的负相关关系；死亡小鼠极度消瘦，内脏病检可见肿瘤细胞浸润，有叁只小鼠大脑组织中亦可见到肿瘤细胞浸润，这是静脉注射K562细胞导致中枢神经系统白血病的首例报道。上述结果表明NOD／SCID小鼠可作为尾静脉注射K562诱发白血病的良好模型。4)利用PCR分别扩增bE1序列、紧邻其上游、下游的内含子序列以及Abl基因第
林林[2]2013年在《表皮生长因子（EGF）与大肠癌关系的研究》文中研究说明目的：研究表皮生长因子（EGF）在临床大肠癌组织中表达及意义；探讨EGF基因多态性与大肠癌发病的相关性；揭示抑制EGF基因表达对大肠癌细胞的生长增殖作用及机制。方法：通过免疫组化的方法检测分析临床大肠癌病理标本中EGF的表达。选取50名大肠癌患者病理组织标本，结肠癌31例，直肠癌19例。高分化腺癌为12例，中分化腺癌为29例，低分化腺癌为9例。依据TNM分期分类，Ⅰ期9例，Ⅱ期16例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例。对照组选取标本边缘正常大肠组织。所有标本切片后采用免疫组化方法染色，细胞浆和/或细胞膜如果呈现棕黄色染色颗粒则设定细胞EGF染色阳性。每张切片均有两位病理医师观察，采用双盲法，每张切片随机选择10个视野用400倍显微镜观察。积分分级法记录染色结果。染色强度:染色无色0分，染色浅黄色评定为l分，染色棕黄色评定为2分，染色棕褐色评定为3分。阳性细胞数:无阳性染色细胞评定为0分，阳性染色细胞数25%评定为1分，阳性染色细胞数26-50%评定为2分，阳性染色细胞数51-75%评定为3分，阳性染色细胞数>75%评定为4分。染色积分为上述两项之和，标本染色分级如下：（－）为阳性细胞数0分，（±）为阳性细胞数2-3分，（＋）为阳性细胞数4-5分，（＋＋）为阳性细胞数6-7分，其中染色阳性为（＋）和（＋＋）的标本。验证其表达情况。同时，对大肠癌组织中EGF表达情况与临床指标关系进行研究，进行统计学处理，两组间对比应用χ2检验，P<0.05有统计学意义。利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术研究EGF基因多态性。检验180名大肠癌患者EGF基因型，病例组年龄区间为35-84岁，平均年龄60.8岁，其中女性患者85名，男性患者95名。对照组年龄区间为55-65岁，平均年龄61岁，其中女性患者87名，研究EGF+61GG基因型与大肠癌的关系。所有病人抽静脉血，提取DNA经PCR扩增后，使用限制性内切酶AluI酶切，将酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，统计患者EGF+61位点基因型，研究所有大肠癌患者EGF+61基因多态性分布状况。利用RNAi技术探讨EGF的缺失对大肠癌细胞生长增殖的影响。查询EGFmRNA核苷酸序列，通过软件设计针对EGF的siRNA，通过化学合成的方法合成叁条GF-siRNA，通过Lipofectamine2000质粒转染到培养好的SW620大肠癌细胞中，利用羧基荧光素（FAM）检测转染效率，再通过RT-PCR研究EGF-siRNA对SW620大肠癌细胞EGF基因表达的影响，提取转染后的大肠癌细胞中RNA,通过SuperScript II反转录酶作用转换成DNA，将所得的DNA进行PCR扩增并电泳，选择沉默EGF基因效果最好的EGF-siRNA，采用MTT法研究SW620大肠癌细胞EGF基因受到干扰后，细胞生长受抑的情况，在一定数量的细胞中，产生的蓝紫色针状结晶与细胞的数量几乎成正比。因此，MTT试验测得的OD值与细胞数成正比。可以通过吸光值来计算细胞的数量。mRNA受到抑制可导致细胞数量增长减缓。，通过吸光值可以间接计算细胞生长抑制率=（1－实验组A490nm/对照组A490nm）×100%，并根据结果绘制生长曲线。不同处理组细胞经48小时培养后，常规消化收集细胞，Annexin V和PI染液室温共孵育30min，流式细胞学检测，CellQuest软件分析荧光强度。结果：表皮生长因子（EGF）在临床大肠癌组织中呈高表达，并与大肠癌组织分化、分期及转移存在关联性。EGF在大肠癌细胞中表达主要集中于细胞的细胞浆和（或）细胞核中，EGF染色表现为黄色的片状染色区域。所检测的50例大肠癌患者的肿瘤组织中有27例EGF染色阳性（54.00%）;50例对照组癌旁粘膜中仅有5例EGF染色阳性（10.00%）。数据经统计学处理后如下：EGF在大肠癌肿瘤细胞中的表达水平明显强于其在癌旁粘膜细胞中的表达（P<0.05）。EGF在肿瘤组织中的表达与肿瘤的分化程度存在关联，实验中男患者EGF染色阳性率为57%，女患者EGF染色阳性率为53%；年龄50岁以上的（包括50岁）患者EGF染色阳性率为54.84%，50岁以上的患者EGF染色阳性率为56.25%；这些分类方法中各组之间比较无统计学差异（P>0.05）。以TNM分期分组，Ⅰ期为33.33%、Ⅱ期为43.75%、Ⅲ期为58.82%、Ⅳ期为75%，但是将Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ比较有统计学差异（P <0.05）；EGF染色阳性率与肿瘤分化有相关性，根据分化程度分类，高分化组为25%、中分化组为62.07%、低分化组为77.78%，其中EGF染色阳性率在高分化组与中分化两组之间比较有统计学差异（P <0.05），而在中分化组与低分化两组之间比较无统计学差异（P>0.05）。通过PCR-RFLP方法，发现EGF+61GG基因型与大肠癌发病存在相关性。大肠癌患者EGF+61GG基因型显着高于对照组（OR=1.93,95%可信区间（CI）=1.07,3.50；p=0.03），EGF+61GG基因型的中国人群患大肠癌的几率比EGF+61AG或EGF+61AA的人群高，通过分层分析大肠癌患者肿瘤部位、大小、生长形态、分化、TNM分期等大肠癌临床指标与EGF+61无统计学相关性。选用大肠癌SW620细胞作为EGF表达强度与大肠癌细胞生长增殖相关性研究的体外细胞模型，利用EGF-siRNA干扰或下调EGF，通过MTT实验证实，在EGF-siRNA3转染SW620细胞后，与对照组和转染组相比较，在转染后48小时至96小时，观察到EGF-siRNA3组细胞数量的明显减少，此结果证实EGF-siRNA可以明显抑制SW620细胞生长增殖，且EGF-siRNA在转染后48细胞开始发挥生长增殖抑制的作用并可延长至转染后96小时。另外，在96小时的时间点上，EGF-siRNA的转染增强SW620细胞增殖抑制。应用Annexin V与PI双染色结果显示：实验组细胞和对照组/转染组比较，Annexin V+PI-百分比明显增高，此结果提示EGF-siRNA3诱导细胞凋亡，即下调或干扰EGF抑制SW620细胞增殖的重要机制为凋亡诱导。结论：EGF的表达与大肠癌的发生发展呈正相关；而EGF+61GG基因型是诊断大肠癌的潜在性指标；下调EGF可通过诱导凋亡的方式引起大肠癌细胞增殖抑制。
蒲春文[3]2011年在《优化选择的串联序列amiRNA表达载体抗乙肝病毒的研究》文中研究表明RNA干扰为治疗人类疾病提供了一个很有前景的方法。前期已有一些学者对于RNAi抗HBV做过研究,但是每个研究小组设计的siRNA分子对病毒的抑制效果有明显的差异,因此还需在HBV的干扰靶点上做大量的工作；另外大多研究进行的都是siRNA的瞬时转染,未构建稳定的转染体系,不能观察清除HBV RNA的远期效果；目前临床应用的抗病毒药物也都需要进行长期治疗,包括干扰素、核苷酸类似物,RNA干扰的作用亦需持久。病毒基因突变是RNA干扰抗病毒失败的重要原因,针对病毒可逃逸RNAi作用的特点,我们设计了可在体内同时表达两个microRNA,靶向不同位点的串联序列amiRNA。即便是病毒一个基因位点的突变就可以逃逸siRNA,而并不能逃逸miRNA的干扰作用。miRNA在体内之所以能广泛存在并发挥作用,是因为它的特点是只要骨架与靶RNA相同,单一一个位点的变化不会影响其发挥作用。目前对于乙肝病毒的研究已从最初的化学合成siRNA、shRNA质粒载体等向应用性较强的microRNA的研究过渡。尽管有学者用化学合成的多个siRNA同时作用于一个细胞,证实了靶向多个区域基因的可行性,但其为剂量依赖性的,需经常向体内注入siRNA。通过质粒等载体在细胞内表达miRNA或siRNA不仅经济方便,还可进行稳定转染,使小干扰RNA持续表达,延长对目的基因的抑制时间。质粒载体能介导更长期的干扰效果,而过多的质粒载体可能对细胞造成一定的影响。串联序列表达载体的优点就在于只需导入一个质粒载体就可发挥作用。amiRNA使得导入的外源性基因在体内自然形成miRNA成为可能,并可同时表达多条miRNA。有学者利用polⅡ启动子表达多个串联的shRNAs,从而抑制了多个基因的表达,其对应蛋白的表达都有明显降低。但有研究提出siRNA可诱导IFN反应,从而存在一些安全性问题。相对于siRNA,由polⅡ启动子介导的amiRNA技术被证实不会引起宿主的免疫反应,亦没对miRNA的内源性途径产生影响,安全有效。有研究采用该种方法将2个串联序列amiRNA导入细胞,但未取得更好的干扰效果,可能是因为并没有找到最佳的干扰序列。另外,关于串联序列amiRNA在HBV DNA水平的干扰效果,尤其是cccDNA方面的干扰效率未见报道。HBV是一个DNA病毒,但必须经过前基因组RNA进行逆转录,使得RNA干扰得以发挥作用,临床中HBV DNA的检测更为实用。cccDNA是HBV的源泉,使得对它的观察更为重要。因为其半衰期较长,所以稳定转染更能接近临床研究情况。目的：本文结合以往研究的经验,针对HBV容易变异的特点,力图寻找针对HBV基因组保守区域的多个有效干扰位点；将构建的质粒瞬时转染入HepG2.2.15,检测各个序列在RNA水平对HBV的干扰效率；挑选干扰效果好的序列,优化设计并构建针对不同位点的串联序列amiRNA表达载体；通过瞬时转染和稳定筛选,全面研究单一序列及串联序列amiRNA表达载体在抑制HBV RNA、DNA和蛋白质表达及cccDNA方面的效果。方法：1.针对病毒容易变异而逃逸RNAi作用的特点,我们首先利用生物信息学软件找到不同基因型HBV基因的保守区域,避开临床常见的病毒变异位点选取4个HBV的RNAi靶位点,分别靶向HBV的S区或X区。2.利用microRNA设计软件,设计4条microRNA序列,并构建四个以CMV为启动子的内源性miR155为骨架的amiRNA表达质粒,分别命名为amiHBV-1、amiHBV-2、amiHBV-3和amiHBV-4。3.将构建成功的4个amiHBV表达载体分别瞬时转染到含有HBV-DNA全基因的人肝母细胞瘤HepG2.2.15细胞株,从mRNA水平研究单一序列amiHBV对HBV mRNA干扰效果,筛选干扰效率高的amiRNA序列,将其中2条干扰效率较高的单一序列串联,构建串联序列amiRNA表达质粒(amiHBV-3-4)。4.将串联序列amiHBV表达质粒瞬时转染入HepG2.2.15细胞,因为ami-HBVI和ami-HBV2在HBV mRNA水平的抑制效率低,在下一步的实验中将其舍去。采用实时定量荧光PCR法分别检测细胞培养上清液和细胞内的HBV DNA；采用CMIA法(Chemiluminescent Microparticle Immunoassay)定量检测分泌蛋白HBsAg和HBeAg的水平变化。5.通过转染后稳定细胞株的筛选,建立amiRNA稳定转染的HepG2.2.15细胞株,采用荧光实时定量检测试剂盒,对amiRNA干扰HBV的复制根源cccDNA的效果进行了研究。结果1.本研究中4个不同靶位的amiRNA载体被构建,4个单一序列及1条串联序列amiHBV表达载体均经测序验证构建成功。2.4个单一序列amiHBV表达质粒以amiHBV-4对HBV mRNA的抑制率最高可达75.6%, amiHBV-3对HBV mRNA的抑制率为61.2%；而amiHBV-1和amiHBV-2对HBVmRNA的抑制率仅为29.3%及14.9%；其中串联序列amiHBV 3-4的干扰效率为87.2%,串联序列组的干扰效率高于单一序列组。3.各组质粒对培养细胞上清中HBV DNA的干扰效率以串联序列质粒组最高可达到94.3%,单一序列组中干扰效率最高的分别为amiHBV-3组60.5%和amiHBV-4组68.0%。对细胞内HBV DNA的干扰效率amiHBV-3组、amiHBV-4组和amiHBV 3-4组分别为71.6%、80.2%和79.7%。4.在转染后72h对细胞上清中HBsAg的抑制效果最好的为串联序列组达到67.4%,其次为amiHBV-4组达到64.6%,再次为amiHBV-3组。对HBeAg的抑制总体效果不及对HBsAg的抑制效果好,串联序列组抑制效果最好,但也只达到了31%。稳定转染后两组(amiHBV 3-4和amiHBV-4)对HBsAg和HBeAg的分泌,均显示了显着的抑制效果。对HBsAg的抑制率最高达97.18%,对HBeAg的抑制率最高达97.00%。5.对HBV cccDNA的干扰情况进行了研究,瞬时转染amiHBV-4组对HBV cccDNA的抑制率为21.9%,串联序列amiHBV3-4组的抑制率(58.4%)明显高于单一序列组。稳定转染后串联序列组HBV cccDNA的抑制率为99.65%,单一序列组的抑制率为93.78%。结论：1.分别靶向HBV S区基因256-276bp和672-692bp位点的单一序列amiRNA对HBV RNA、DNA和表面抗原(HBsAg)均有显着的干扰效果。2.同时靶向HBV S区基因256-276bp和672-692bp两个位点的串联序列amiRNA对HBV RNA、DNA和HBsAg的干扰效果均显着优于单一序列HBVamiRNA的干扰效果。3.瞬时转染靶向HBV S区的串联序列amiRNA对HBsAg的抑制效果显着,对HBeAg的抑制不明显；稳定转染串联序列amiRNA对HBsAg和HBeAg均有显着的抑制效果。4.稳定转染的单一序列或串联序列amiRNA对HBV DNA、cccDNA、HBsAg及HBeAg的抑制效果均优于瞬时转染的抑制效果。5.针对HBV S区基因的单一序列或串联序列amiRNA对HBV RNA、表面抗原(HBsAg)、DNA及cccDNA均有较好的干扰效果,提示HBV S区基因是RNA干扰的有效靶点之一。6.串联序列amiRNA介导的RNA干扰机制能极大程度的抑制HBV的复制、病毒蛋白的表达及复制根源cccDNA。7.本研究串联两个靶位点的amiRNA表达质粒构建成功并显示高效的抗病毒功能,提示针对多个靶基因或靶位点的amiRNA载体的构建和功能的实现具有可行性。
杨琴[4]2012年在《配体依赖的SHH信号异常活化在肺腺癌发生发展中的意义》文中研究表明介导胚胎发育的相关信号通路在成体组织中的异常再活化与肿瘤发生之间的密切关系日益引起人们关注,Sonic hedgehog (SHH)信号通路即为其中一种。SHH信号通路主要由配体SHH,跨膜受体Patched (PTCH),信号转导子Smoothed(SMO)以及下游转录因子Glioma-associated oncogene homolog(Gli)组成,该信号参与胚胎发育过程中的多个阶段,包括肺组织发育。随着SHH信号的活化,下游Gli家族分子稳定性增强并移位至核内,继而介导一系列参与旁路反馈调节,促细胞增生、分化,抗细胞凋亡,维持干细胞数量以及促进上皮间质转化等靶基因的转录,由此构成调控正常胚胎发育的基础。自1996年人们首次发现该信号在成体组织中的异常活化与人类肿瘤一基底细胞癌之间的内在联系后,围绕该信号的异常活化与肿瘤发生的相关研究大量展开。现有研究显示在人类多种组织来源的肿瘤组织中存在该信号以不同活化机制产生的异常活化,并在促进肿瘤发生发展中发挥关键作用。由于该信号通路在正常成体中的相对静息状态,于是人们期待阻断该信号在肿瘤中的异常活化能成为相关肿瘤治疗中有效且低副作用的新靶点。在向这一目标迈进过程中,除了更详尽地阐明该信号通路传导过程中的精确调控机制外,在特定肿瘤中进一步澄明该信号确切的再活化状态以及其致癌机制亟待解决。有关该信号在肺癌中的异常活化,在2003年由Watkins等在对肺小细胞癌的研究中被首次报道,而在非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinomas,NSCLC)中关于SHH信号的活化情况目前报道颇少且存在争议,而该信号与NSCLC发生发展的关系和异常活化机制更不甚明了。究竟SHH信号异常活化在NSCLC中如何存在?是否扮演重要角色?阻断该信号能否成为NSCLC治疗的新靶点?针对这些问题,我们着手以下研究工作,分叁部分进行。第一部分配体依赖的SHH信-号-在人非小细胞肺癌中的异常活化目的：明确人NSCLC组织中SHH信号异常活化情况,并探讨其在NSCLC发生发展中的意义。方法：免疫组化法检测87例NSCLC组织,12例肺腺癌癌旁不典型腺瘤样增生(atypical adenomatous hyperplasia, AAH)组织以及20例癌旁正常肺组织中SHH信号通路分子SHH, GLI1, HHIP表达,并评价分子间相互关系及其与临床病理参数之间的关系。结果：与癌旁正常肺组织相比,SHH, Gli1, HHIP表达上调分别在87/87(100%),74/87(85.1%),75/87(86.2%)的NSCLC组织中检见。在所有NSCLC组织中,SHH表达与Gli1表达之间呈现显着正相关关系(rs=0.592,P=0.000),而两者与HHIP间皆未检见相关性。大多数NSCLC组织中呈现配体依赖的SHH信号异常活化,但在肺腺癌组织多数呈SHH信号高度活化,其高度活化率显着高于鳞癌和大细胞(P<0.05)。在肺腺癌中SHH信号活化程度与癌组织分化程度呈显着正相关(P<0.05),且不同的组织学亚型亦呈现不同程度的信号活化,浸润型腺癌中的微乳头生长为主型和实性生长为主型其SHH信号高度活化率显着低于其它腺癌亚型(P<0.05)。高水平的SHH信号活化除了在多数早期腺癌一原位腺癌(adenocarcinoma in situ, AIS)和微小浸润癌(minimally invasive adenocarcinomas, MIA)被检见外,12例肺腺癌癌前病变一不典型腺瘤样增生(atypical adenomatous hyperplasia, AAH)组织中10例(83.3%)亦呈现SHH信号高度活化。结论：NSCLC中存在配体依赖的SHH信号广泛异常活化。该信号异常活化与肺腺癌发生关系更为密切,且可能是肺腺癌发展过程中的早期分子事件。第二部分SHH表达上调对人肺腺癌细胞体内外生物学效应的影响目的：了解SHH表达上调对人肺腺癌细胞体内外生物学行为的改变以及其中可能的机制。方法：体外培养人肺腺癌A549和H1975细胞,将细胞随机分为未感染组、对照空载慢病毒感染组和重组SHH过表达慢病毒感染组。应用CCK-8法,流式细胞周期分析和凋亡检测,平板克隆形成实验和Transwell小室实验分别观察各组细胞体外增殖、凋亡以及迁移能力的改变。并通过裸鼠成瘤实验比较SHH过表达病毒感染组和空载病毒感染组细胞裸鼠皮下接种成瘤能力的差异。同时,用RT-qPCR和Western Blot法分别检测Gli1和相关通路靶基因cyclinD1,Bcl2和FOXC2的表达。结果：SHH过表达病毒感染组细胞较未感染组和对照病毒感染组其增殖、迁移能力显着增强且凋亡水平降低(P均<0.05),而未感染组和对照病毒感染组未见显着差异(P>0.05)。与对照病毒感染组细胞相比,SHH过表达病毒感染组细胞皮下瘤结节生长速度快,最终成瘤体积和重量皆显着大于对照感染组(P均<0.05)；此外,Glil,cyclinD1,Bcl2和FOXC2的表达在SHH过表达病毒感染组细胞皆较相应两对照组显着上调(P均<0.05)。结论：SHH表达上调可促进肺腺癌细胞增殖和迁移,并抑制细胞凋亡,其分子机制可能与SHH信号高度活化上调下游靶基因cyclinD1,FOXC2和Bc12的表达有关。第叁部分敲减SHH对人肺腺癌细胞体内外生物学效应的影响目的：观察SHH敲减的肺腺癌细胞体内外生物学行为的改变,并进一步探讨其中可能的机制,以了解SHH敲减在干预肺腺癌发生发展中的意义。方法：应用慢病毒工具载体构建SHH-shRNA重组慢病毒载体以及对照慢病毒载体。体外培养人肺腺癌A549和H1975细胞,将细胞随机分为未感染组、对照慢病毒感染组和SHH-shRNA重组慢病毒感染组。应用CCK-8法,流式细胞周期分析和凋亡检测,平板克隆形成实验和Transwell小室实验分别观察各组细胞体外增殖、凋亡以及迁移能力的改变。并通过裸鼠成瘤实验比较SHH-shRNA重组慢病毒感染组和对照病毒感染组细胞裸鼠皮下接种成瘤能力的差异。同时,用RT-qPCR和Western Blot法分别检测Gli1和相关通路靶基因cyclinD1,Bcl2和FOXC2的表达。结果：成功构建叁种SHH-shRNA重组慢病毒载体并筛选到其中干扰效率最高者用于实验。SHH-shRNA重组慢病毒感染组细胞较未感染组和对照病毒感染组其增殖,迁移能力显着降低且凋亡水平增高(P均<0.05),而未感染组和对照病毒感染组未见显着差异(P>0.05)。与对照病毒感染组细胞相比,SHH-shRNA病毒感染组细胞皮下瘤结节生长速度,最终成瘤体积和重量皆显着降低(P均<0.05)；此外,Gli1, cyclinD1, Bcl2和FOXC2的表达在SHH-shRNA病毒感染组细胞皆较相应两对照组显着降低(P均<0.05)。结论：敲减SHH表达可抑制肺腺癌细胞增殖和迁移,并促进细胞凋亡,其机制与其下调配体依赖的SHH信号活化水平从而抑制下游靶基因cyclinD1, FOXC2和Bc12的表达有关。总结：结合前面叁部分体内外实验结果,可以证实：(1)肺腺癌中配体依赖的SHH信号呈现广泛异常活化；(2)该信号在肺腺癌中的异常活化具有促进癌细胞增殖和迁移并抑制其凋亡的多重作用,其作用机制与上调信号下游多个相关靶基因表达有关；SHH信号的多重作用提示其可能参与肺腺癌发生发展中的多个阶段；(3)抑制SHH表达,阻断该信号通路有望成为肺腺癌治疗的有效途径。
邱志红[5]2010年在《siRNA抑制IGFBPrP1表达对活化肝星状细胞细胞外基质的影响》文中认为第一部分siRNA对肝星状细胞IGFBPrP1基因表达的抑制目的设计、化学合成2对针对大鼠胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)基因的siRNA,研究对大鼠IGFBPrP1基因和蛋白表达的抑制作用,筛选出抑制作用较显着的一对IGFBPrP1 siRNA,用于后续实验中对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)中IGFBPrP1功能的研究。方法1.应用10、30、50nmol/L化学合成的FAM-Negative siRNA转染HSC-T6细胞,转染后48h应用荧光显微镜评估其转染效率。2.30nmol/L IGFBPrP1 siRNA (siRNA1、siRNA2)和阴性对照分别转染HSC-T6细胞,培养48h后,采用荧光实时定量RT-PCR方法检测HSC-T6中IGFBPrPl基因的表达(β-actin作为内参照)3.30nmol/L IGFBPrP1 siRNA (siRNA1、siRNA2)和阴性对照分别转染HSC-T6细胞,培养48h后,采用Western blot方法检测HSC-T6中IGFBPrP1蛋白的表达(β-actin作为内参照)结果1.10、30、50nmol/L的FAM-Negative siRNA转染组细胞内均可见绿色荧光,对照组无荧光信号,30nmol/L和50nmol/L siRNA的转染效率明显高于10nmol/L组(P<0.05)；30nmol/L和50nmol/L siRNA组转染效率无显着差异(P>0.05),但50nmol/L组细胞死亡严重,转染效率约70%。2.30nmol/L IGFBPrP1 siRNA转染HSC-T6细胞,siRNAl组HSC中IGFBPrP1基因的表达水平明显低于阴性对照组和siRNA2组(P<0.01)3.30nmol/L IGFBPrP1 siRNA转染HSC-T6细胞,siRNA1组HSC中IGFBPrP1蛋白的表达水平明显低于阴性对照组和siRNA2组(P<0.01)结论1.化学合成的siRNA可以成功转染HSC-T6,30nmol/L的siRNA即可获得理想的转染效果。2.化学合成的2对siRNA转染HSC-T6 48h后,在mRNA水平和蛋白水平上,检测结果一致,其中siRNA1抑制作用显着。第二部分IGFBPrP1 siRNA对活化肝星状细胞分泌细胞外基质的影响目的利用化学合成的siRNA抑制胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)基因的表达,研究其对肝星状细胞中细胞外基质表达的影响。方法选择大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)作为研究对象,分别设立正常对照组(加入等量PBS)、阴性对照组(转染Negative siRNA control或FAM-Negative siRNA作对照)和IGFBPrP1 siRNA干扰组(将筛选的抑制效率较高的siRNA以30nmol/L转染HSC-T6)。siRNA转染HSC-T6 72h后,收集各组细胞培养上清液并抽提细胞胞浆蛋白,采用Western blot检测HSC-T6胞浆蛋白中IGFBPrP1和培养上清液中Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的表达。结果1. Western blot检测IGFBPrP1的表达：与正常对照组(0.42±0.03)和阴性对照组(0.40±0.03)相比,IGFBPrP1 siRNA干扰组IGFBPrP1的相对蛋白表达量(0.21±0.04)显着降低(F=48.018,P<0.01)。2. Western blot检测Ⅰ型胶原的表达：IGFBPrP1 siRNA干扰组Ⅰ型胶原的相对蛋白表达量(0.63±0.03)较正常对照组(0.61±0.03)和阴性对照组(0.35±0.05)显着减少(F=81.246,P<0.01)。3. Western blot检测纤维连接蛋白的表达：干扰组纤维连接蛋白的相对蛋白表达量(0.43±0.04)较正常对照组(0.76±0.07)和阴性对照组(0.74±0.05)明显降低(F=43.850,P<0.01)。结论1. IGFBPrP1 siRNA能特异性抑制IGFBPrP1在HSC-T6中的表达。2. IGFBPrP1具有调节HSC-T6中CollagenⅠ和FN合成和分泌的功能,进而导致肝纤维化的形成。第叁部分IGFBPrP1与TGFβ1关系初探目的研究TGFβ1对HSC-T6中IGFBPrP1及细胞外基质表达的影响；通过应用siRNA阻断HSC-T6中IGFBPrP1基因的表达,观察TGFβ1对其的细胞外基质的影响,以阐明IGFBPrP1在肝纤维化中的作用地位。方法1.选择大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)作为研究对象,分别设立正常对照组(加入等量PBS)和TGFβ1处理组(加入终浓度为4ng/ml的TGFβ1)。TGFβ1作用24h后,采用Western blot法检测HSC-T6胞浆蛋白中IGFBPrP1和培养上清液中CollagenⅠ和FN表达的变化,并进行IGFBPrP1与CollagenⅠ和FN的相关性分析。2.将大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)分为3组：阴性对照组(转染Negative siRNA control或FAM-Negative siRNA作对照)、siRNA干扰组(将筛选的抑制效率较高的siRNA以30nmol/L转染HSC-T6)和siRNA+TGFβ1组(将抑制效率较高的siRNA转染HSC-T6,再加入TGFβ1刺激该HSC-T6)。TGFβ1作用24h后,采用Western blot法检测]HSC-T6胞浆蛋白中IGFBPrP1和培养上清液中TGFβ1、CollagenⅠ及FN表达的变化。结果1.TGFβ1对HSC-T6中IGFBPrP1、CollagenⅠ和FN表达的影响：TGFβ1处理组IGFBPrP1、CollagenⅠ和FN的相对蛋白表达量均较正常对照组显着增加(IGFBPrP1:0.58±0.09 vs 0.40±0.07,t=3.178,P<0.05；CollagenⅠ:0.79±0.08 vs 0.58±0.08,t=3.649,P<0.05；FN：0.84±0.09 vs 0.66±0.06,t=3.451,P<0.05)。IGFBPrP1的表达变化与CollagenⅠ及FN的表达变化呈正相关(r值分别为0.787,0.814,P<0.05)。2. IGFBPrP1 siRNA对TGFβ1刺激的HSC-T6中IGFBPrP1、CollagenⅠ、FN和TGFβ1表达的影响：siRNA干扰组IGFBPrP1、CollagenⅠ、FN和TGFβ1的相对蛋白表达量均较阴性对照组明显降低(IGFBPrP1:0.22±0.06 vs 0.40±0.03,F=19.384,P<0.01；CollagenⅠ：0.36±0.12 vs 0.61±0.09,F=14.711,P<0.05；FN：0.44±O.10 vs 0.75±0.11,F=25.591,P<0.05；TGFβ1：0.17±0.03 vs 0.23±0.02,F=7.321,P<0.05)；siRNA+TGFβ1组CollagenⅠ和FN的表达较阴性对照组(CollagenⅠ:0.79±0.12；FN：0.90±0.06)显着增加(P<0.05),IGFBPrP1和TGFβ1的表达无明显改变(P>0.05)；siRNA干扰组和siRNA+TGFβ1组相比,siRNA+TGFβ1组IGFBPrP1、CollagenⅠ和FN的表达明显增强(P值均<0.01),TGFβ1的表达无明显变化(P>0.05)。结论IGFBPrP1与致肝纤维化最强的细胞因子TGFβ1在肝纤维化发生发展中可能互为因果关系。
刘林[6]2012年在《草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗和亚单位疫苗的免疫效果研究》文中研究表明草鱼出血病病毒(Grass carp reovirus, GCRV)是水生呼肠孤病毒属中致病力最强双链RNA(dsRNA)病毒,因曾引起中国西南的85%草鱼幼鱼发生草鱼出血病而被首次发现。目前的疫苗包括灭活疫苗和减毒疫苗,灭活疫苗不能进入主要组织相容性复合体I(MHC I)类抗原呈递途径,不能有效的诱导细胞毒性T细胞(CTL)反应,因此,免疫效果相对不理想、免疫力持久性差；减毒疫苗生产成本高,有毒力返祖现象,安全性较差,有回复致病性的潜在危险。鱼体免疫接种的常规方法是浸泡免疫和注射免疫,浸泡免疫方法操作简单,但需要大量的疫苗；但注射免疫要求鱼体要有一定的规格,操作强度大、技术要求高、技术推广困难,而且鱼的捕捞过程及注射对鱼体均造成较大损伤。因此,生产上急需开发安全可靠、高效多价、使用简便的草鱼出血病口服亚单位/DNA联合疫苗。1.草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒多角体蛋白(Polh)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)的β-肌动蛋白启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒P10启动子下游获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6.按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg免疫草鱼(体长14～20cm,体重60～120g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4ml/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70d分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平和在免疫第21d感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28d达到最高；攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。2.原核表达GCRV VP6蛋白对草鱼出血病的免疫保护作用为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43kDa,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右；Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20cm,60～120g),并在第14、21、28、49、70d通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14d可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21d达到最高峰,第70d仍可检测到抗体的存在；免疫注射第21d人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。研究结果为草鱼出血病亚单位疫苗的研发奠定了基础。3.GCRV VP6蛋白亚单位/DNA联合口服疫苗及免疫效果评价杆状病毒具有高效表达外源基因以及安全有效向脊椎动物细胞传递基因的功能,为了研发安全可靠、高效多价、使用方便的VP6蛋白亚单位/DNA联合口服疫苗,本研究分别用团头鲂的β-actin启动子和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体蛋白启动子控制GCRVvp6基因构建供体质粒pFastBac-FA-VP6-ph-VP6,通过Bac to Bac系统获重组杆状病毒BacFish-VP6。重组病毒感染5龄家蚕后,采集血液,SDS-PAGE和Western blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为53kDa。重组病毒感染蚕蛹120h后,VP6蛋白的表达水平达到最高值,达血淋巴总蛋白的5%左右,冷冻干燥制成冻干粉,然后分别以1%、5%、10%的比例掺入饲料中(含2.5%淀粉),口服免疫草鱼,通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,抗体产生水平呈剂量依赖的方式,并在免疫后第3-4周抗体水平达到最高,至3个月后仍能检测到特异性抗体的存在；RT-PCR检测结果显示,在口服免疫的鱼血液中可特异性地检测到vp6基因的mRNA,免疫组化法在免疫鱼的肝、肾组织中可检测到VP6蛋白,表明用感染重组杆状病毒BacFish-vp6的蚕蛹冻干粉口服免疫,重组杆状病毒BacFish-vp6能进入鱼体,并正确表达VP6蛋白,刺激鱼体产生免疫反应。初步的研究结果表明,表达VP6蛋白的蚕蛹冻干粉具有蛋白亚单位/DNA疫苗的双重功效,口服免疫能诱导鱼产生特异性免疫反应。
刘光[7]2016年在《胚胎干细胞自我更新和分化研究》文中认为论文中包含两部分的工作。第一部分工作：miR23a～27a～24在胚胎干细胞分化中的功能研究了解胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)维持自我更新及多向分化潜能的具体机制,对于人们未来更好的将其应用于再生医学非常重要。过去几十年已经对ESC中转录因子和信号通路层面上的调控机制开展了较全面的研究,也勾画出ESC维持其特征的具体整体框架。除了各种转录因子相互协调形成网络调控外,人们也逐渐认识到表观遗传修饰,如组蛋白修饰、DNA甲基化及非编码RNA等,也可以协同转录调节因子来共同维持ESC状态基因的表达。其中microRNA在ESC自我更新及分化中发挥了重要的功能,在ESC中将Dicer和DGCR8敲除均显示ESC分化存在缺陷,说明microRNA在胚胎干细胞的自我维持尤其是分化中具有非常关键的作用。人们对于促进ESC自我更新和多潜能性,提高iPS细胞重编程效率的microRNA研究较多。但是,对于抑制ESC自我更新,促进分化的microRNA则研究较少。本课题组在前期的研究工作发现位于小鼠8号染色体上的miR-23a～27a～24-2基因簇(miR-23a基因簇)的两个成员miR-27a和miR-24在分化细胞和组织中呈现不同程度的高表达,通过靶基因Oct4、 Foxo1、 gp130、 Smad3、 Smad4实现对ESC自我更新的抑制,并能够促ESC多胚层分化,抑制二者的表达能显着提高叁因子介导的iPS细胞形成的效率,同时有促进胚层特异性分化的相关报道。考虑到上述工作很多是在特定修饰的细胞系或者体外开展,对miR-27a和miR-24-2在ESC分化中是否不可或缺这一问题不能全面回答,miR-23基因家族除了miR-23a基因簇外,还包含有位于13号染色体上的miR-23b～27b～24-1基因簇(简称miR-23b基因簇),这两个基因簇共编码5个microRNA:miR-23a,23b,27a,27b,24。 miR-23b基因簇上叁个成员miR-23b,27b,24-1的种子序列与miR-23a基因簇中的叁个成员完全相同,因此它们可能具有相同的靶基因及相应的功能,在功能上有代偿作用。因此,我们使用CRISPR/Cas9技术在V6.5细胞系中分别获得miR-23a和23b双基因簇纯合敲除(DKO)和miR-23a基因簇纯合敲除(KO)细胞系,而这是第一次由CRISPR/Cas9技术实现双microRNA基因簇的纯合敲除。而后,我们将获得DKO和KO ESC系通过EB形成实验、ES细胞向中内胚层定向诱导实验和畸胎瘤形成实验确定上述miR-23a/b基因簇敲除ESC系的分化能力。在EB形成实验中,DKO细胞显示导致中胚层分化缺陷而促进其它胚层的分化,提示miR-23-27-24基因簇参与ESC自我更新的抑制和早期中胚层的形成；在心肌分化实验中,DKO ESC 在任意天数都未观察到博动性cEBs,心肌特异标志物Nkx2.5、 Tbx5、a-MHC、 b-MHC和cTnT等的表达量明显降低。免疫荧光试验显示没有明显的肌原纤维形态,叁个心肌标志物Actinin、 ANP和Troponin1的表达量也非常低,提示miR-23～miR-27～miR-24基因簇在心肌细胞分化中起着非常重要的作用；同过畸胎瘤体积大小和重量检测显示DKO ESC成瘤能力小于KO和野生型ESC,通过HE染色,DKO ESC来源的畸胎瘤中可以观察到外、内胚层的结构,而几乎没有中胚层的结构,并且存在大量未分化或低分化的区域；通过ESC的标志物Oct4进行免疫组化检测,发现DKO ESC来源的畸胎瘤中存在大片Oct4染色阳性区域,而野生型ESC来源的畸胎瘤中则几乎没有,KO ESC来源的畸胎瘤介于两者之间。第二部分工作：单倍体胚胎干细胞突变体文库的建立和应用研究表明转录因子Oct4与Sox2是维持多能性所必须的,它们与其它一些转录因子共同组成了一个调控网络来建立及维持ESC的多能性。当这一调控网络被破坏时,ESC将退出多能性(Exit from Pluripotency)走向分化,但是,对于这一过程的机制,还有很多疑问有待人们研究,目前在国际上已经有几个研究团队利用正向遗传学筛选(Forward Genetics)方法获得了与调控ESC退出多能性相关的候选基因。但这些研究都有自身的局限性,另外,将这些遗传筛选的结果放在一起分析会发现相互间的重复性很差,只有少数几个基因(如Tcf3)在不同研究中都被筛选出来,这也从侧面说明上述研究还远没有全面揭示ESC退出多能性进入分化状态的相关因子及其作用机制。由于多数基因的性状为隐性的,只有两个等位基因都发生突变时,性状的变化才显现出来,因此获得基因组范围的纯合突变细胞文库是进行正向遗传筛选研究必要条件。haESC只具有一套染色体组,并具有ESC的所有特征,因而,在正向遗传筛选工作具有更广泛的优势,目前,在突变ESC基因的多种方法中,利用病毒载体和转座子载体进行的插入突变是使用较为广泛的方法,而转座子载体没有病毒载体那样显着的基因组整合偏好性,可以覆盖更多的基因。因此我们使用piggyBac转座子载体携带的基因诱捕(Gene Trap)元件在haESC中构建了4个纯合突变体文库,约包含60000个突变克隆,通过Southern blot检测其转座子单拷贝插入插入的比例在74%,通过Splinkerette-PCR结合“叁引物竞争性PCR”鉴定纯合突变的比例在85%以上,通过Splinkerette-PCR结合高通量测序的方法确定构建的文库中55%以上的插入位点位于基因内,其约涵盖18000个以上的基因。在此基础上,我们构建了一个包含460个突变克隆的小规模矩阵式突变体文库,所谓“矩阵库”就是在单倍体胚胎干细胞混合库的基础上,将每一个突变克隆挑取到96孔细胞培养板中独立培养。随后利用两种分化条件M15 (-LIF)和N2B27对这些细胞进行了分化筛选,共获得了33个仍可以呈ESC样生长的阳性克隆；利用Splinkerette PCR结合常规测序确定了19个阳性克隆在基因组中的插入位点,其中11个插入位点定位于已知基因,包含已知的与分化和发育相关的基因。接着,我们挑选了两个阳性克隆进行回复实验,当转座子捕获载体被切除后,回复克隆在分化的条件下表现出了明显的分化表型,证明了分化缺陷表型的产生是由转座子的插入引起的。这些结果充分证明了我们将建立的矩阵式突变体文库的可应用性以及筛选策略的可行性,为我们下一步扩大矩阵式突变体文库奠定了良好的基础,通过筛选出更多的分化相关基因使我们能更深入全面地了解ESC分化的分子机制。
李彦欣[8]2004年在《异种克隆牦牛，羚牛及相关机理的研究》文中研究说明在保护濒危动物和进行核质互作分析方面，异种克隆技术是非常有效的方法。本研究利用牛卵母细胞作为受体，通过显微操作与牦牛或羚牛体细胞构建异种重构胚，将牦牛的异种重构胚移植到代孕牛中，获得了妊娠，并有望于2004年6—7月间出生。此外本研究还对异种克隆技术和异种体细胞核重编程进行了初步探讨。 1 供体细胞的培养：本实验从北京动物园、青海互助县、秦皇岛野生动物园分别采集了羚牛和牦牛组织样，建立了21个细胞系。细胞系种类包括耳成纤维细胞、输卵管上皮、颗粒细胞系叁种。实验证明样品采用0℃保存48小时，对细胞系的建立无负面影响。这为野外收集珍稀动物组织，建立细胞系提供了切实可行的方法。 2 体细胞克隆技术基础平台的建立：首先，在去核方法上，本实验比较了H33342染色法，盲吸法和高渗法并结合这叁种方法作了优化，形成本实验的去核方法：其次，本实验利用牛卵母细胞孤雌激活的方法，比较了四种激活方法，发现利用复合激活方法比单个化学试剂激活效率高(83.6、68.7：45、62.5)，而在复合激活的方法中以A23187+6-DMAP激活效率较高(分裂率，83.6)；最后，通过比较M199培养液和CR1aa培养液对孤雌激活胚胎的培养效率，发现CR1aa培养液较适合牛胚胎的培养。 3 异种克隆牦牛囊胚研究：本实验利用不同个体的牦牛耳成纤维细胞、颗粒细胞和输卵管细胞，分别作为供核细胞移入去核牛卵母细胞中，均可完成体外牦牛的早期囊胚发育(囊胚率高达35％)。通过对不同年龄阶段、不同个体、不同细胞类型、细胞的饥饿与否、细胞冷冻与否，以及卵母细胞成熟率，不同融合到激活时间对克隆效率的比较发现：卵母细胞的质量是克隆成功的基础，当成熟率在40％以下时，将显着影响异种克隆牦牛的囊胚发育(由25％降到3％，P＜0.01)；影响异种克隆牦牛早期囊胚发育的重要因素为延迟激活时间，当延迟激活1.5小时可显着提高异种克隆囊胚率(由21％提高到35％，P＜0.05)；而不同类型细胞、不同个体、不同年龄、饥饿与否、冷冻与否对异种克隆牦牛早期囊胚发育影响不显着，这为简化供体细胞的处理提供了依据。 4 通过将羚牛和牦牛的异种克隆发育情况、囊胚总细胞数和克隆牛进行比较发现：(1)异种克隆羚牛胚胎在体外可以发育到囊胚阶段，囊胚率为5％左右：(2)利用相同的克隆技术，同种克隆牛、异种克隆牦牛、异种克隆羚牛之间克隆效率差异显着(48％；28％；5％，P＜0.01) (3)叁种克隆囊胚的细胞数无差异。这些结果说明牛卵母细胞可以支持羚牛、牦牛、牛成纤维细胞核进行重编程，但是囊胚发育率种内较异种克隆高(牛高于牦牛、羚牛)，物种间距离越近克隆效率越高(牦牛高于羚牛)。 5 由于异种克隆所用的卵母细胞不是同一物种，有必要对克隆后囊胚的核，线粒体遗传物质进行鉴定。本实验对异种克隆牦牛和羚牛囊胚鉴定结果表明：囊胚核基因组来自牦牛和羚牛供核中国农业大学博士学位论文中文摘要细胞，说明本实验获得的囊胚是真正异种体细胞克隆的结果;囊胚线粒体以牛卵母细胞线粒体为主，耗牛或羚牛供体细胞线粒体含量甚微。 6异种克隆耗牛胚胎进行移植:共移植耗牛胚胎185枚，用受体牛60头，其中有近33头的受体牛返情期延长，移植后第60天直肠检查确认有3头怀孕。7个月后，1头牛妊娠仍然正常，为通过异种克隆的方法保护珍稀动物提供了依据。 7目前在较近的物种之间进行异种体细胞克隆虽然已有成功的报道，但是多数报道的异种体细胞克隆都发育到囊胚阶段，最多妊娠几个月。本实验在异种克隆耗牛实验中也发现了这一问题。为了较全面的探索其基因方面的原因，则需要对大量的候选基因进行分析。而利用传统的RT一PCR方法从单个卵母细胞或胚胎中获得的RNA量不足以分析大量的基因。本研究利用并优化了一套全新的扩增细胞中整体cDNA的方法，使微量材料进行大量的基因表达分析成为现实。通过该方法，本实验检测了6个重要基因在耗牛体细胞和牛卵母细胞和耗牛异种体细胞克隆胚胎的表达情况;同时对耗牛异种体细胞克隆囊胚的内细胞团/总细胞的比例进行了检测。结果表明耗牛体细胞功能基因波形蛋白基因和胶原蛋白基因只在耗牛细胞中检测到，说明耗牛体细胞的基因表达得到了重编程。发现cx43和乃油乙夕这两个对细胞和胚胎重要的基因在耗牛细胞和胚胎中均表达;两个对胚胎发育重要的基因人吸”hZ和116不在供体细胞中表达，在胚胎中有表达，但其起始表达的时期异常。耗牛异种体细胞克隆囊胚的内细胞比例显着高于牛人工受精囊胚。由此可推测，滋养层细胞比例过少和胚胎发育重要的基因表达起始时期异常可能与异种体细胞克隆胚胎妊娠困难和流产率高有关。 8在此次研究中发现，作为干细胞标志的Ocl4基因在牛和耗牛体外培养的细胞系中也有大量表达。利用原位杂交技术检测发现Ocl4在牛卵母细胞、牛克隆和IVF胚胎、异种克隆耗牛胚胎、牛体外培养的细胞系和耗牛体外培养的细胞系中均有表达。说明Oct4基因在牛和耗牛中并非只在干细胞中表达，推测该基因可能具有种属特异性。
徐祎慧[9]2014年在《日本囊对虾模式识别受体抗病毒功能研究》文中研究说明对虾是我国重要的水产养殖产品,具有重要的经济意义。但其养殖易受如白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)等病原的侵害,造成巨大的经济损失。对虾主要依靠先天免疫抵抗病原的侵害,因此对日本囊对虾先天免疫防御机制的研究具有重要意义。C型凝集素(C-type lectin, CTL)是甲壳动物中一种重要的模式识别受体。本研究选取日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)为实验动物,研究了两种含有低密度脂蛋白受体家族A结构域(LDLa, low-density lipoprotein receptor class A domain)的C型凝集素Ld1rLec1与Ld1rLec2在抗病毒免疫中的功能及可能的作用机制。LSm14A是RNA结合蛋白LSm(like-Sm)家族的一员,在抗病毒免疫中具有重要功能,本文还对日本囊对虾中新发现的叁种MjLSm在抗病毒免疫中的功能进行了研究。1.日本囊对虾C型凝集素Ld1rLec1与Ld1rLec2的功能研究C型凝集素是一大类含有糖类识别结构域(CRD, carbohydrate recognition domain)的蛋白家族,在生物中分布广泛。甲壳动物中含有大量的C型凝集素,大都具有一个CRD结构域,多数甲壳动物C型凝集素表达于血细胞和肝胰腺中。有的C型凝集素丧失了凝集功能,但仍作为模式识别受体参与对病原的识别。有的凝集素具有促进血细胞对病原微生物吞噬的功能,还有一些C型凝集素具有杀菌的功能。C型凝集素在抗病毒先天免疫中也具有重要的功能。因此从分子水平上研究LdlrLec1与LdlrLec2在日本囊对虾先天免疫中的功能与作用机制,对于深入了解宿主对病原微生物的抵御、探索有效的免疫预防方式具有重要意义。LdlrLec1与LdlrLec2几乎在所有组织中均有表达,但是LdlrLec1主要在血细胞、心、鳃和肠内表达,而LdlrLec2主要在肝胰腺和心内表达。在受到WSSV刺激后,LdlrLec1与LdlrLec2的表达发生显着上调。LdlrLec1与LdlrLec2能够发生异源寡聚化。向日本囊对虾体内注射LdlrLec1与LdlrLec2重组蛋白能够抑制WSSV的复制,并降低了日本囊对虾感染WSSV后的累积死亡率。利用RNA干扰敲低LdlrLec1与LdlrLec2则会促进WSSV在对虾体内的复制,重新注射LdlrLec1与LdlrLec2蛋白能够抑制WSSV的复带。Pull down实验显示LdlrLec1与LdlrLec2蛋白能够与WSSV的囊膜蛋白VP28结合,并且主要依赖CRD结构域发挥功能。LdlrLec1和LdlrLec2蛋白与WSSV孵育后感染血细胞的效率与对照组相比发生显着下调。这些结果表明LdlrLec1与LdlrLec2通过CRD结构域结合WSSV的囊膜蛋白VP28,从而抑制WSSV在对虾体内的侵染和复制,在对虾的抗病毒免疫中发挥功能。2.日本囊对虾新型模式识别受体MjLSm抗病毒功能研究LSm蛋白是RNA结合蛋白,在多种生物中分布广泛,通常可以形成六聚体或者七聚体的复合物发挥功能,能够参与mRNA前体的加工、剪接以及mRNA的脱帽反应等。LSm14A,又称为RAP55(mRNA-associated protein55),被认为是一种新型的模式识别受体,位于细胞质处理小体(P-body)上。人类的LSm14A在病毒感染的早期,能够与病毒核酸结合,然后部分从P-body转位到过氧化物酶体,激活下游相关信号通路,最终诱导干扰素表达,在抗病毒先天免疫中发挥功能。但甲壳动物中的LSm14A尚未见报道,我们在日本囊对虾发现了3种LSm14A,分别命名为MjLSm1、MjLSm2与MjLSm3,对其功能进行了初步研究。MjLSm1、MjLSm2与MjLSm3在多种组织中分布广泛。MjLSm1、MjLSm2与MjLSm3在N端均含有一个Sm结构域,在C端均含有一个FFD结构域。其中MjLSml在血细胞、心、肝胰腺中表达较高,在鳃内表达相对较低；MjLSm2在血细胞和肝胰腺中表达较高,在心和肠内表达相对较低；MjLSm3在肝胰腺中表达较高,在血细胞和鳃内表达略低,在胃肠内基本无表达。在WSSV刺激后,MjLSm1、MjLSm2与MjLSm3表达均发生上调。MjLSm1、MjLSm2和MjLSm3蛋白还能够与WSSV dsRNA结合。干扰MjLSm促进WSSV在对虾体内的复制,并调控参与抗病毒免疫的甲壳肽crustin4与crustin11表达下调。过表达MjLSm1、 MjLSm2或MjLSm3均能够抑制WSSV在对虾体内的复制。分别过表达MjLSm1与MjLSm2后,对虾感染WSSV时crustin4表达上调,分别过表达MjLSm1、 MjLSm2或MjLSm3后,对虾感染WSSV时crustin11表达发生上调。这些结果表明MjLSm在日本囊对虾感染WSSV时参与调控crustin4与crustin11的表达,在抗病毒免疫中发挥功能。
李侠[10]2007年在《EphA2基因表达及其对人脑星形胶质细胞瘤生物学特性的影响》文中提出脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤,其发生率约占全部颅内肿瘤的30%~50%;在脑胶质细胞瘤的不同组织分型中,以星形胶质细胞起源的肿瘤最为多见。根据WHO 2000年肿瘤病理分级标准,所有星形胶质细胞瘤分为四级(I级~IV级)。虽然少量的低级别星形胶质细胞瘤为良性肿瘤,但是绝大多数该类肿瘤为恶性肿瘤,常导致不良预后。以多形性胶质母细胞瘤(IV级)为例,即便是采用手术、化疗、放疗等综合治疗措施,患者的平均生存期往往不足1年。为了进一步改善恶性脑星形胶质细胞瘤的治疗效果,研究者一直试图发现新的具有诊断和/或治疗意义的生物标记分子,但是成效并不显着。由于一些受体型酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase,RTK)在多种恶性肿瘤组织中显着高表达,其被认为是一类有价值的肿瘤候选生物标记分子。Eph受体家族是最大的RTK家族,目前关于Eph分子家族的研究多集中于探讨其在恶性肿瘤生物学行为及靶向治疗中的意义。EphA2为A型Eph分子家族的重要成员,广泛表达于多种上皮组织,已证实它在神经元发育、细胞侵袭-黏附调控等方面具有重要作用。此外,在多种非神经系统恶性肿瘤组织中也检测到了EphA2表达上调,这提示EphA2可能对于多种肿瘤的恶性进展具有重要的意义。就脑肿瘤而言,目前仅在高级别恶性星形胶质细胞瘤中发现EphA2表达上调,如多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme,GBM)和间变性星形细胞瘤(Anaplastic Astrocytomas,AA)。然而,EphA2在低级别星形胶质细胞瘤中的表达特点目前还不清楚;EphA2是否能够成为新的、有价值的星形胶质细胞瘤生物标记分子尚有待进一步研究证实。本研究系统地检测了EphA2分子在脑星形胶质细胞瘤中的表达特征,揭示了EphA2表达与星形胶质细胞瘤病理分级、增殖和凋亡的关系。此外,本试验还初步探讨了EphA2分子诱导高表达和干涉表达对于星形胶质细胞瘤细胞体外增殖、侵袭、凋亡、FAK磷酸化以及裸鼠致瘤性的影响,为发现EphA2分子在脑星形胶质细胞瘤恶性进展中的作用提供了实验基础。本课题主要包括以下四方面研究:1. EphA2在人脑星形胶质细胞瘤中的表达及意义采用反转录聚合酶链反应(Reverse-transcription PCR,RT-PCR)检测EphA2 mRNA在4株人脑星形胶质瘤细胞系(U251、U87、BT325和SHG44)、90例人脑星形胶质细胞瘤组织和10例正常人脑组织中的表达水平。结果显示,EphA2 mRNA在U251、U87、SHG44细胞中均有表达;而BT325细胞未见EphA2 mRNA表达。90例人脑星形胶质细胞瘤标本中,共有43例(47.8%)表达EphA2 mRNA;10例正常人脑组织均未见EphA2 mRNA表达。EphA2 mRNA表达阳性率在人脑星形胶质细胞瘤及正常人脑组织之间存在显着差异(P<0.01)。EphA2 mRNA表达阳性率随肿瘤标本病理级别增高而增高(P<0.05)。EphA2 mRNA表达阳性率与患者性别、年龄、肿瘤大小及部位无关(P均>0.05)。采用免疫荧光法检测EphA2蛋白在4株人脑星形胶质瘤细胞系(U251、U87、BT325和SHG44)中的表达。结果显示,EphA2蛋白在U251、U87及SHG44细胞中均有高表达,在BT325细胞中未见表达。EphA2蛋白阳性染色多定位于细胞胞浆。分别采用免疫组化SABC法和凋亡原位检测法( Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)检测90例人脑星形胶质细胞瘤组织、10例正常人脑组织中EphA2蛋白、Ki67蛋白表达以及细胞凋亡水平。结果显示,43.3% (39/90)肿瘤标本表达EphA2蛋白,而正常人脑组织未见EphA2蛋白表达。EphA2蛋白阳性染色定位于胞浆和/或胞膜;90例肿瘤组织EphA2蛋白免疫染色评分(Immunoreactivity Score,IRS)为2.90±3.89,与正常人脑组织有显着差异(P<0.01)。EphA2蛋白表达阳性率和EphA2 IRS在I~IV级肿瘤组织间差异显着(P<0.05);但二者均与患者性别、年龄、肿瘤大小及部位无显着相关性(P均>0.05)。所有肿瘤组织均有Ki67表达,其肿瘤细胞增殖指数(Proliferative Index,PI)范围为2.8%~90.3%,平均(30.42±24.91)%。随肿瘤病理级别增高,PI明显升高(P<0.01);EphA2蛋白阳性组和阴性组PI分别为(53.71±20.39)%和(12.61±6.45)%,二者间存在显着差异(P<0.01),且PI与EphA2 IRS呈显着正相关(P<0.01)。所有肿瘤组织均见凋亡细胞,凋亡指数(Apoptotic Index, AI)范围是0.2%~4.9%,平均为(1.42±0.99)%。随肿瘤病理级别增高,AI明显升高(P<0.01),EphA2蛋白阳性组和阴性组AI分别为(1.26±0.71)%和(1.55±1.16)%,二者之间虽然无显着差异(P>0.05),但AI与EphA2 IRS呈显着负相关(P<0.05)。本部分研究结果表明,EphA2 mRNA和蛋白在人脑星形胶质细胞瘤组织及细胞系中高表达,其表达水平随肿瘤病理分级增高而显着升高;此外,EphA2蛋白表达与肿瘤增殖成正相关、与肿瘤凋亡成负相关,提示EphA2可能是一个有价值的脑星形胶质细胞瘤生物标记分子。2. EphA2真核表达载体及RNAi载体转染星形胶质瘤细胞系的研究设计并合成包含EphA2 RNA干涉序列及其单碱基突变序列的两对互补寡核苷酸序列,构建干涉载体pSilencer-EphA2-SR及单碱基突变载体pSilencer-EphA2-mSR并酶切鉴定、测序。采用脂质体介导法将所构建载体及空载体pSilencer转染U251细胞,分别命名为U251-SR、U251-mSR和U251-P细胞。采用半定量RT-PCR和Western blot法检测瞬时转染后U251、U251-P、U251-SR和U251-mSR细胞中EphA2 mRNA和蛋白表达水平。结果显示,成功合成两对寡核苷酸序列并克隆入pSilencer载体中,重组克隆经双酶切鉴定和DNA序列分析证实与设计序列完全一致。RT-PCR检测显示,U251-SR细胞中EphA2 mRNA表达受到明显抑制,而U251-P和U251-mSR细胞中EphA2 mRNA表达水平较转染前无明显变化。Western blot检测显示,U251-SR细胞中EphA2蛋白表达受到明显抑制,而U251-P细胞和U251-mSR细胞中EphA2蛋白表达水平无明显改变。双酶切获赠EphA2真核表达载体pcDNA3.2-DEST-EphA2和空载体pcDNA3.2-DEST,琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序分析。采用脂质体介导法将载体pcDNA3.2-DEST-EphA2及空载体pcDNA3.2-DEST分别转染BT325细胞,筛选稳定转染的细胞株并分别命名为BT325-E和BT325-P细胞。采用半定量RT-PCR和Western blot法检测EphA2 mRNA和蛋白在BT325、BT325-P和BT325-E细胞中的表达水平。电泳结果如预期,pcDNA3.2-DEST-EphA2质粒切出大约7200bp和1290bp左右的两个条带,而空质粒pcDNA3.2-DEST切出大约7100bp和630bp左右的两个条带。测序分析显示,质粒DNA序列与目的基因序列完全一致。RT-PCR检测显示,BT325-E细胞中EphA2 mRNA表达明显升高,而BT325-P和BT325细胞中均未检测到EphA2 mRNA表达。Western blot检测显示,BT325-E细胞中EphA2蛋白表达显着升高,而BT325-P和BT325细胞中均未检测到EphA2蛋白表达。本部分结果提示:成功构建EphA2 RNA干涉载体,将该载体和获赠EphA2真核表达载体分别转染星形胶质瘤细胞系后,可明显抑制或诱导EphA2 mRNA和蛋白表达,这为进一步探讨EphA2表达对于星形胶质瘤细胞生物学特性的影响提供了良好的细胞模型。3.诱导EphA2高表达或RNAi对人脑星形胶质瘤细胞体外增殖、凋亡、侵袭及FAK蛋白磷酸化的影响分别采用细胞计数法和克隆形成实验检测两组细胞(U251-SR、U251-P、U251和BT325-E、BT325-P、BT325)的体外增殖速率和活力。两组细胞生长曲线显示:U251-SR细胞增殖受到明显抑制,U251和U251-P细胞的增殖速率显着高于U251-SR(P<0.05);BT325-E细胞的增殖速率明显提高,显着高于BT325和BT325-P细胞(P<0.05)。克隆形成实验显示:U251、U251-P和U251-SR细胞的平均克隆数分别为(67.0±4.82)%、(63.8±4.51)%和(32.5±4.36)%,U251-SR细胞显着低于U251和U251-P细胞(P<0.01);BT325、BT325-P和BT325-E细胞的克隆数分别为(43.0±4.09)%、(42.2±3.06)%和(59.2±2.08)%,BT325-E细胞显着高于BT325和BT325-P细胞(P<0.01)。采用流式细胞仪测定两组细胞的细胞周期,观察G0/G1期、G2/M期、S期细胞所占百分比,以及是否存在凋亡峰。结果显示,与U251和U251-P细胞相比,U251-SR细胞中S期细胞明显减少,G2/M期细胞略有减少,G0/G1期细胞明显增加,并出现明显的凋亡峰;与BT325和BT325-P细胞相比,BT325-E细胞中S期细胞明显增加,G2/M期细胞略有增加,G0/G1期细胞明显减少。分别采用HE染色、Hoechst染色、透射电镜以及FCM(PI/Annexin V双染)检测两组细胞凋亡。HE染色显示,U251和U251-P细胞生长状态良好,罕见凋亡,而U251-SR细胞凋亡增多,表现为胞核固缩、深染;BT325、BT325-P、BT325-E细胞生长状态均良好,未见明显凋亡。Hoechst染色显示,U251、U251-P和U251-SR细胞核呈现深蓝色荧光,而U251-SR细胞可见较多胞核呈浅亮蓝色荧光着色,提示为凋亡表现;BT325、BT325-P、BT325-E细胞胞核呈均一的深蓝色荧光染色,未见明显凋亡。透射电镜显示U251-SR细胞凋亡增多,凋亡细胞表现出典型的超微结构特征,如细胞膜表面微绒毛消失、出泡,染色质浓集;在凋亡早期,染色质边集,核仁存在;晚期核仁消失,染色质断裂成块,并形成凋亡小体;而U251、U251-P、BT325、BT325-P、BT325-E细胞均未发现明显的凋亡超微结构改变。FCM分析显示,与U251(2.7%)和U251-P细胞(3.4%)相比,U251-SR细胞凋亡比率明显升高,达22.3%;较BT325(4.9%)和BT325-P(5.3%)细胞,BT325-E细胞(2.0%)的凋亡率明显降低。采用BD BioCoat? Matrigel?侵袭小室检测两组细胞的体外侵袭能力。结果显示,U251、U251-P和U251-SR细胞的侵袭率分别为(39.7±2.52)%、(38.3±2.08)%和(22.3±5.03)%,U251-SR细胞明显低于其它两种细胞(P<0.01);BT325、BT325-P和BT325-E细胞的侵袭率分别为(29.7±4.73)%、(29.3±2.52)%和(46.3±10.02)%,BT325-E细胞的侵袭率明显增加(P<0.01)。采用免疫共沉淀法检测两组细胞的FAK表达及磷酸化水平。结果显示:U251、U251-P和U251-SR细胞均有FAK表达,且表达水平一致,而U251-SR细胞的FAK磷酸化水平显着低于U251和U251-P细胞(P<0.01);BT325、BT325-P和BT325-E细胞中FAK表达水平一致;但是较BT325和BT325-P细胞而言,BT325-E细胞的FAK磷酸化水平显着升高(P<0.01)。上述研究结果提示,EphA2的高表达可能与脑星形胶质瘤细胞的体外增殖、侵袭和抗凋亡等恶性生物学特性密切相关,而FAK的磷酸化可能是EphA2诱导星形胶质细胞瘤恶性进展的重要分子机制。4.诱导EphA2高表达或RNAi对人脑星形胶质瘤细胞裸鼠体内成瘤、增殖以及凋亡的影响将定量的U251细胞(1.0×107/200μl)接种于裸鼠腹部外侧皮下,建立人脑胶质细胞瘤裸鼠皮下移植瘤模型。移植细胞15 d后,于移植瘤原位分别定量注射PBS(简写为U251-PBS组)、Lipofectamine 2000+无血清RPMI 1640培养基(简写为U251-Lipo-RPMI 1640组)、Lipofectamine 2000+pSilencer(简写为U251-Lipo-P组)或Lipofectamine 2000+pSilencer-EphA2-SR(简写为U251-Lipo-SR组),每周两次,继续观察肿瘤生长情况,测定肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。接种细胞30 d后处死动物,称瘤重后取瘤组织行HE、EphA2/Ki67免疫组化以及TUNEL荧光染色,并计算AI和PI值。结果显示,与U251-PBS组、U251-Lipo-RPMI 1640组、U251-Lipo-P组相比,U251-Lipo-SR组裸鼠肿瘤生长明显缓慢。HE染色显示,U251-Lipo-SR组标本中凋亡细胞显着多于其他叁组。EphA2免疫组化显示,U251-Lipo-SR组肿瘤组织中EphA2蛋白表达明显下调。四组肿瘤组织的PI值分别为(71.26±4.54)%、(70.58±5.68)%、(66.64±4.94)%、(40.62±4.39)%,U251-Lipo-SR组明显降低(P<0.01);AI值分别为(2.40±0.43)%、(2.22±0.76)%、(2.16±0.47)%、(11.78±1.56)%,U251-Lipo-SR组明显升高(P<0.01)。分别以BT325、BT325-P和BT325-E细胞建模,方法同上。定期观察肿瘤生长情况,测定肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,观察30 d后处死动物,称瘤重后取瘤组织行HE、EphA2/Ki67免疫组化以及TUNEL染色,并计算AI和PI值。结果显示,与BT325、BT325-P组相比,BT325-E组裸鼠肿瘤形成时间短,肿瘤生长迅速。EphA2免疫组化染色显示,BT325-E组EphA2蛋白表达明显上调。BT325、BT325-P和BT325-E组肿瘤组织的PI值分别为(51.74±13.98)%、(
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